Luận văn Khảo sát khả năng sinh kháng sinh của các chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn huyện Cần Giờ thành phố Hồ Chí Minh

ox (nuôi cấy, giữ giống nấm sợi kiểm định) [8]. Glucôza 20,0g; NaNO3 3,5g; KH2 PO4 1,5g; MgSO4.7 H2O 0,5g; KCl 0,5g; FeSO4.7 H2O 0,1g; Thạch 20,0g; Nước biển 1000 ml, pH 5,5 – 6,0; ( thêm 0,5g chloramphenicol khi phân lập) - MT 2: Môi trường Glucose Yeast Extract Agar (môi trường nuôi cấy và giữ giống nấm sợi RNM- môi trường YEA) [46]. Glucôza 20,0g Cao nấm men 4,0g Thạch 20,0g Nước biển 1000ml, pH 5,5 – 6,0. - MT 3: Môi trường D (môi trường nuôi cấy nấm sợi RNM) [46]. Glucôza 10,0g; Peptôn 2,0g; KH2 PO4 5,0g; MgSO4.7 H2O 0,5g; Thạch 20,0g; Nước biển 1000 ml, pH 5,5 – 6,0 2.1.4.2.Môi trường phân loại nấm sợi: - MT 4:Môi trường Potato Glucose Aga r(môi trường PGA- môi trường nuôi cấy nấm sợi gây bệnh ở cây trồng) [8]. Khoai tây 250,0g Glucôza 20,0g Thạch 15,0g (nếu làm môi trường đặc) Nước cất 1000ml. - Cách chế dịch khoai tây: Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch. Cân 250g, thái nhỏ, thêm 500ml nước, đun sôi, nhỏ lửa trong 30 phút, lọc lấy dịch trong. - MT 5:Môi trường Malt Extract Agar (môi trường MEA- môi trường phân loại nấm sợi) Glucôza 20,0g; Peptôn 1,0g; Malt Extract 20,0g; Thạch 20,0g; Nước biển 1000 ml, pH = 5,5 - 6 - Môi trường YEA ( môi trường 2.1.4.1) Nếu thử hoạt tính kháng sinh thì thay nước biển bằng nước cất 2.1.4.3. Môi trường nuôi cấy và giữ giống nấm men kiểm định [8]. -MT 6: Môi trường Hanxen . Glucôza 50,0g; Peptôn 10,0g; KH2 PO4 3,0g; MgSO4.7 H2O 2,0g; Thạch 20,0g; Nước cất 1000 ml, pH 5,5 – 6,0 2.1.4.4.Môi trường MPA nuôi cấy giữ giống vi khuẩn kiểm định [16]. - MT 7: Môi trường MPA. Peptôn 5,0g; NaCl 5,0g; Cao thịt 5,0g; Thạch 20,0g, Nước cất 1000ml; pH= 7,5. 2.1.4.5. Môi trường thử họat tính enzym ngoại bào [8], [46]. a. Môi trường thử hoạt tính enzym bằng phương pháp cấy chấm điểm: Dùng [MT1] để thử hoạt tính enzym ngoại bào như: xenlulaza, prôteaza, amilaza dùng các cơ chất tương ứng là CMC, casein, tinh bột thay đường glucose với hàm lượng tương đương. b. Môi trường thử hoạt tính enzym bằng phương pháp đục lỗ: Dùng [MT 2, MT 3] để thử hoạt tính enzym ngoại bào, thành phần môi trường tương tự nhưng không có agar. MT8:Môi trường khoáng (phát hiện khả năng phân giải dầu) [19]. KH2 PO4 0,3g; MgSO4 0,4g; KNO3 3,0g; Na2 HPO4 0,7g; Nước biển 1000 ml, pH 5,5 – 6,0; dầu DO hoặc dầu thô 5 % Lưu ý: Các môi trường trên trước khi đem sử dụng đều được thanh trùng ở 1atm trong 30 phút. 2.2.Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương phápVSV 2.2.1.1.Phương pháp lấy mẫu [19]. Các mẫu được thu ngẫu nhiên khi thủy triều vừa rút tại các rừng già cách biển 2 km.Các điểm lấy mẫu cách nhau 200 m. Lấy các mẫu đất mặt, đất cách bề mặt 5-10 cm, thân cây tươi, thân cây mục, lá tươi trên cành, lá mục trên mặt đất. Khu vực lấy mẫu là vùng nước lợ có độ mặn từ 12 - 18 0 / 00, nhiệt độ trung bình khoảng 25- 280C, độ ẩm 79- 87 %, pH dao động trong khoảng 4- 4,5. Mẫu bao gồm:lá vàng vừa rụng , lá rụng bị mục, thân cành chết khô còn trên cây, thân cành chết đang bị phân giải trên mặt bùn, đất bề mặt. Cách lấy: Dùng dao kéo vô trùng, cắt khoảng 50g mẫu cho vào túi nilon vô trùng bọc kín, đánh số, ghi địa điểm lấy mẫu , ngày tháng , bảo quản trong thùng nước đá vận chuyển về phòng thí nghiệm và giữ ở tủ giống 40 C .Các mẫu được phân lập ngay không giữ quá 48h. 2.2.1.2.Phương pháp phân lập [9], [46]. Lấy mẫu trực tiếp và pha loãng mẫu theo F.Uyenco (1988) a.Lấy mẫu và pha loãng mẫu. Lấy 10g mẫu lá, đất, thân, cho vào túi lọc mẫu, thêm 90ml nước biển Cần Giờ . Dập mẫu bằng máy nghiền mẫu trong vòng 2 phút, tốc độ 230vòng/ phút. Túi lọc mẫu giữ lại chất hữu cơ phần dịch hơi đục chảy ra bên ngòai. Lấy dịch lọc ta được dung dịch pha loãng 10-1. Lắc đều, rồi hút 1ml dd 10 -1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước biển vô trùng ta đựợc dung dịch pha loãng nồng độ 10-2. Tiếp tục pha lõang liên tiếp như thế ta được dung dịch nồng độ 10-3, 10-4, 10-5, 10-6. b- Cấy mẫu Nhỏ 0,1ml dung dịch ở mỗi nồng độ lên dĩa chứa môi trường. Dùng que trang trải lên khắp mặt thạch. Sau đó sử dụng que trang đó trải tiếp 2 đĩa tiếp theo. c- Ủ mẫu Úp đĩa pêtri xuống, dùng báo gói lại, ủ ở nhiệt độ phòng từ 3-7 ngày. Chọn khuẩn lạc riêng lẽ cấy truyền sang ống nghiệm thạch nghiêng. d- Làm thuần Lấy 1 mẫu khuẩn lạc trong ống thạch nghiêng, hòa vào nước biển vô trùng, trải lên đĩa lần 2, nếu thuần nhất 1 khuẩn lạc đồng đều, màu sắc giống nhau, soi dưới kính hiển vi đều có 1 dạng tế bào thì đã thuần, ta cấy sang 3 ống thạch nghiêng để bảo quản ngắn hạn và nghiên cứu các đặc tính hình thái, sinh lý, sinh hóa . 2.2.2. Phương pháp quan sát hình thái nấm sợi. 2.2.2.1.Quan sát đại thể nấm sợi. -Phương pháp nuôi cấy tạo khuẩn lạc khổng lồ: - Cho vào ống thạch nghiêng (đã cấy chủng nấm sợi thuần khiết) 5ml nước biển vô trùng, tạo dung dịch huyền phù. - Dùng que cấy chấm vào dung dịch huyền phù rồi nhanh chóng chấm điểm vào mặt thạch ở giữa đĩa pêtri. Quan sát sự hình thành và phát triển của khuẩn lạc hằng ngày theo các đặc điểm sau. + Đo kích thước khuẩn lạc. + Quan sát hình dạng khuẩn lạc, màu sắc mặt phải, mặt trái của KL, màu sắc của môi trường, dạng mép KL, chất tiết trên bề mặt KL, mùi… 2.2.2.2.Quan sát vi thể nấm sợi [9], [10]. Phuơng pháp làm phòng ẩm nuôi cấy nấm để quan sát của J.T.Dunean. - Chuẩn bị môi trường thích hợp ( PDA, MEA, YEA) đổ 1 lớp thật mỏng khoảng 1mm trên bề mặt các đĩa petri. Khi thạch đã đông hoàn toàn thì dùng dao vô trùng cắt thành từng mẩu hình vuông, diện tích 1cm2 . - Chuẩn bị các đĩa pêtri sạch, phiến kính , lá kính, bông thấm nước (hoặc giấy thấm) nước cất, tất cả đều được vô trùng (sấy ở nhiệt độ 1600C, trong 1 giờ). - Đặt 1 khối thạch lên phiến kính. Cấy 1 ít bào tử lên bề mặt xung quanh khối thạch. Đậy lá kính lại và cho vào hộp pêtri có sẳn giấy thấm (bông) vô trùng được làm ẩm bằng nước cất vô trùng. Giữ các hộp pêtri này trong tủ ấm 3-4 ngày. - Sau 3- 4 ngày nuôi, khẽ gỡ lá kính ra, úp lên 1 phiến kính sạch có bề mặt thuốc nhuộm. Gỡ bỏ lớp thạch và để nguyên phần nấm sợi trên phiến kính, nhỏ giọt lactophenol, đậy lá kính lên trên là ta đựơc tiêu bản thứ 2. Quan sát dưới vật kính 40, 100 các đặc điểm: + Giá bào tử, các thể bọng, thể bình. + Sợi nấm có hay không có sự phân nhánh và vách ngăn. + Màu sắc, kính thước bào tử, có gai hay không có gai. Chụp hình trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đaị 400- 1000 lần. 2.2.3.Các phương pháp hóa sinh. 2.2.3.1. Kiểm tra họat tính enzym ngoại bào của nấm sợi [9]. Bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch. a. Nguyên tắc. Thuốc thử phản ứng với cơ chất tạo màu đặc trưng, còn phần cơ chất bị nấm sợi phân hủy sẽ không tạo màu mà tạo vòng trong suốt quanh khuẩn lạc. b. Thực hiện.  Phương pháp cấy chấm điểm - Chuẩn bị các chủng nấm sợi nghiên cứu và các môi trường thích hợp (MT 1 với cơ chất tương ứng). - Cấy chấm điểm các chủng nấm sợi đã nghiên cứu (ba điểm trong một hộp pêtri) lên môi trường thử họat tính tương ứng. - Giữ các hộp pêtri này trong tủ ấm 280 C300 C, trong 3 4 ngày.  Phương pháp đục lỗ trên môi trường thạch: - Thu dịch nuôi cấy: dùng que cấy vô trùng, lấy một vòng nấm sợi nghiên cứu vào bình tam giác chứa 50 ml môi trường lỏng ( MT 2, MT 3 không có thạch) vô trùng. Nuôi cấy trên máy lắc (160 vòng/phút) trong 4 ngày ở nhiệt độ 250C280C. Ly tâm 20 ml dịch nuôi cấy ở 3000 vòng/ phút, trong 20 phút. Loại bỏ sinh khối, phần dịch ly tâm cho vào các bình vô trùng, bổ sung 0, 04% NaN3 để khử trùng. Dịch ly tâm có thể giữ trong 1 tháng trong tủ lạnh sâu ở -200C. - Dùng khoan nút chai vô trùng (d= 8 mm) khoan các lỗ thạch trên môi trường nghiên cứu tương ứng trong các hộp pêtri (MT 1) với cơ chất tương ứng. - Dùng pipet vô trùng nhỏ 0,1 ml dịch enzym vào các lỗ khoan trên các môi trường thử hoạt tính tương ứng.Giữ các hộp pêtri vào tủ lạnh ở 4 0C trong vòng 2 – 4 giờ. Sau đó chuyển sang giữ trong tủ ấm ở 280C300C, trong vòng 24 giờ. c. Kiểm tra kết quả: Kiểm tra hoạt tính enzym bằng thuốc thử tương ứng: + Kiểm tra hoạt tính proteaza: đổ dung dịch thuốc thử 10 % HgCl2 lên bề mặt môi trường nuôi cấy, nếu nấm sợi sinh ra prôteaza sẽ có 1 vòng trong suốt xung quanh khuẩn lạc (cấy chấm điểm) hoặc xung quanh lỗ khoan có chứa dịch enzym (phương pháp đục lỗ) do các phân tử prôtêin bị phân giải không còn phản ứng kết tủa với HgCl2. Các phân tử prôtêin chưa bị phân giải có màu trắng đục. + Kiểm tra hoạt tính amilaza: nhỏ dung dịch thuốc thử KI + I 2 (dung dịch lugol loãng) lên bề mặt môi trường nuôi cấy nấm sợi. Nếu nấm sợi có enzym amilaza sẽ tạo vòng trong suốt xung quanh khuẩn lạc (cấy chấm điểm) hoặc xung quanh lỗ khoan có chứa dịch enzym (phương pháp đục lỗ). + Kiểm tra hoạt tính xenlulaza bằng thuốc thử dung dịch lugol loãng hoặc cônggo đỏ 1 %. Đổ thuốc thử lên bề mặt môi trường nuôi cấy nấm sợi. Nếu nấm sợi có hoạt tính xenlulaza sẽ tạo 1 vòng trong suốt xung quanh khuẩn lạc (cấy chấm điểm) hoặc xung quanh lỗ khoan có chứa dịch enzym (phương pháp đục lỗ). Vùng xenluloza chưa bị phân giải sẽ có màu đỏ đậm với thuốc thử cônggo 1% và màu tím hồng nhạt với thuốc thử là dung dịch lugol loãng. d. Đánh giá khả năng tạo enzym . - Hoạt tính enzym = (D- d), mm với D = đường kính vòng phân giải, d = .đường kính khuẩn lạc (lỗ thạch). - (D-d)  25 mm: hoạt tính rất mạnh; (D-d)  20 mm: hoạt tính mạnh (D-d)  10  19,5: hoạt tính trung bình; (D-d)  10 mm: hoạt tính yếu 2.2.3.2. Kiểm tra khả năng sinh chất kháng sinh của nấm sợi [9]. a.Nguyên tắc Nếu VSV trên khối thạch có khả năng hình thành CKS thì chúng sẽ ức chế và tiêu diệt các VSV kiểm định và tạo thành vòng vô khuẩn xung quanh khối thạch. b.Tiến hành thí nghiệm:  Phương pháp khối thạch Chuẩn bị các chủng nấm sợi nghiên cứu và các môi trường thích hợp ( MT 2) không dùng nước biển mà thay bằng nước cất. Dùng khoan nút chai vô trùng khoan các khối thạch có vi sinh vật cần thử họat tính kháng sinh. Đặt các khối thạch vào đĩa pêtri có môi trường ( MT7) đã cấy các vi sinh vật kiểm định  Phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch - Cách thu dịch kháng sinh tương tự thu dịch enzym. Sau đó điểu chỉnh pH của dịch kháng sinh về pH trung tính (6  7). Các vi sinh vật kiểm định được cấy truyền từ ống giống sang môi trường nước cất vô trùng. - Dùng pipet vô trùng lấy 0,1 ml môi trường lỏng có chứa vi sinh vật kiểm định nhỏ vào hộp pêtri có chứa môi trường dinh dưỡng tương ứng (MT 7). Dùng que trang vô trùng dàn đều giọt dịch vi sinh vật kiểm định trên bề mặt môi trường thạch. - Dùng khoan nút chai vô trùng dùng d=8mm, khoan các lỗ trên môi trường có chứa vi sinh vật kiểm định . - Dùng pipet vô trùng nhỏ 0,1 ml dịch chiết kháng sinh nghiên cứu vào các lỗ khoan. c. Kiểm tra kết quả: - Hoạt tính kháng sinh = (D- d), mm -Với D = đường kính vòng phân giải, d = đường kính khuẩn lạc (lỗ thạch) (D-d)  25 mm: hoạt tính rất mạnh; (D-d)  20 mm: hoạt tính mạnh (D-d)  10  19,5: hoạt tính trung bình; (D-d)  10 mm: hoạt tính yếu 2.2.3.3.Thử khả năng đồng hóa nguồn cacbon, nitơ [19]. a. Nguyên tắc Mức độ phát triển của nấm sợi thể hiện khả năng đồng hóa các nguồn cacbon, nitơ khác nhau . b. Tiến hành thí nghiệm Để xác định ảnh hưởng của nguồn Cacbon tới sự sinh trưởng của nấm sợi nghiên cứu chúng tôi sử dụng MT 1 trong nước biển, glucose lần lượt được thay bằng các nguồn hydrat cacbon: lactose, sucrose, maltose, galactose, rỉ đường.Trọng lượng các chất thay thế được lấy đúng bằng hàm lượng cacbon trong MT 1. Để xác định ảnh hưởng của nguồn nitơ (dùng MT 1). Nguồn NaNO3 lần lượt được thay thế bằng các nguồn Nitơ khác: bột đậu, cao thịt, NH4NO3, NaNO2, NH4Cl, (NH4 )2SO4. Mẫu đối chứng được nuôi ở môi trường MT 1. Cấy chấm điểm các nấm sợi nghiên cứu lên bề mặt môi trường tương ứng, sau đó để trong tủ ấm trong 3 ngày. c. Kết quả: Đánh giá khả năng sử dụng nguồn cacbon, nitơ bằng mức độ phát triển của các khuẩn lạc bằng cách đo đường kính của các khuẩn lạc. 2.2.3.4. Kiểm tra khả năng chịu mặn [19]. a.Nguyên tắc Mỗi loài nấm sợi thích nghi với nồng độ muối khác nhau, ứng với mỗi nồng độ muối nó thể hiện hoạt tính kháng sinh khác nhau. b. Tiến hành thí nghiệm - Chuẩn bị môi trường YEA (MT 2) , có bổ sung các nồng độ muối NaCl từ 0%; 3%; 5%; 7%; 10%; 20 %. - Cấy 3 điểm các chủng nấm sợi nghiên cứu lên bề mặt các môi trường nghiên cứu có nồng độ muối khác nhau. - Nuôi trong tủ ấm 4 ngày. Thử hoạt tính kháng sinh theo phương pháp 2.2.3.2 với từng nồng độ muối môi trường ban đầu. c. Kết quả. - Dựa vào thời gian hình thành khuẩn lạc và đường kính khuẩn lạc của các chủng nấm sợi nghiên cứu để đánh giả khả năng chịu mặn. Mẫu đối chứng nuôi trên môi trường không NaCl. - Kiểm tra vòng vô khuẩn (khi thử hoạt tính KS) 2.2.3.5.Thử khả năng phân giải dầu [19]. a. Nguyên tắc Dựa vào khả năng sinh trưởng của nấm sợi để xác định khả năng phân giải dầu. b. Tiến hành TN Cấy nấm sợi trong bình tam giác 100ml có chứa 50ml môi trường khoáng (MT 8). Nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ phòng trong 15 ngày. c. Đánh giá khả năng phân giải dầu bằng cách: Đo sinh khối khô của nấm sợi Quan sát xem nấm sợi có khả năng phát triển tốt trên MT có dầu hay không Quan sát mức độ mất các giọt dầu và ngửi thấy giảm mùi dầu. 2.2.3.6.Xác định ảnh hưởng của thời gian đến sự sinh trưởng và khả năng sinh kháng sinh của nấm sợi Sử dụng môi trường (MT 1) thanh trùng rồi cấy chấm điểm các chủng nấm sợi nghiên cứu. Sau đó ủ trong tủ ấm. Mỗi ngày đo đường kính khuẩn lạc vào cùng thời điểm (sau 24 giờ cấy) để biết tốc độ sinh trưởng của nó. Thử hoạt tính kháng sinh theo phương pháp 2.2.3.2 từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 7. 2.2.3.7.Xác định ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng và hoạt tính kháng của các chủng nấm sợi nghiên cứu. Chúng tôi sử dụng môi trường nuôi cấy (MT 2) nước cất, điều chỉnh bằng dung dịch NaOH 1 M hoặc HCl 1 M để có giá trị pH khác nhau từ 3,0 đến 9,0. Thanh trùng môi trường rồi cấy chấm điểm các chủng nấm sợi nghiên cứu, sau đó để ở nhiệt độ phòng trong 3- 4 ngày. Đánh giá mức độ sinh trưởng của nấm sợi dựa vào độ lớn của khuẩn lạc. Thử hoạt tính kháng sinh theo phương pháp 2.2.3.2 2.2.4. Thử họat tính đối kháng với các chủng nấm sợi gây bệnh cho cây trồng [15]: Nuôi các chủng nấm nghiên cứu trong môi trường dịch thể (MT 2), sau 4 ngày lấy dịch nuôi cấy đem ly tâm 3000 vòng/ phút, trong 20 phút. Loại bỏ sinh khối, phần dịch ly tâm cho vào các bình vô trùng ta được dịch chiết kháng sinh thô. Đổ môi trường (MT 4) vào đĩa pêtri, để nguội, sau đó đục lổ. Cấy nấm gây bệnh thành 2 chấm đối xứng qua lổ thạch và cách lổ thạch 2 cm. Nhỏ dịch chiết kháng sinh thô vào lổ thạch. Để đĩa pêtri này vào tủ lạnh từ 3 đến 5 giờ cho CKS khuếch tán. Sau đó để ở nhiệt độ phòng, quan sát kết quả sau 3- 5 ngày. 2.2.5.Thử khả năng diệt côn trùng của các chủng nấm sợi rừng ngập mặn.[16] Nguyên tắc: khả năng diệt sâu của các chủng nấm sợi RNM được đánh giá thông qua tỉ lệ sâu tơ, tằm chết và LD50 . Phương pháp: a-Gây nhiễm trực tiếp bào tử thuần khiết của các chủng nấm sợi RNM với tằm và sâu tơ tuổi ba: - Đếm 40 tằm hoặc sâu tơ tuổi ba để vào đĩa pêtri đã khử trùng. - Dùng que cấy vô trùng gạt các bào tử nấm thuần khiết từ ống giống (tương đương 0, 25g) lên tằm trong đĩa pêtri thí nghiệm, ghi ký hiệu tên chủng nấm lên hộp pêtri. - Đối chứng: tằm để nguyên không nhiễm nấm. - Sau khoảng 4 giờ bổ sung đồng đều một lượng lá dâu tươi (4g / 40 con). b-Gây nhiễm bằng dịch nuôi cấy: Nuôi các chủng nghiên cứu vào môi trường MT 3 dịch thể trong 3  5 ngày ở nhiệt độ phòng (280C 300C). Chiết dịch lọc, ly tâm 3000 vòng/ phút, trong 20 phút. Sau đó phun 3 ml dịch nuôi cấy lên mỗi đĩa pêtri chứa 40 cá thể sâu tơ (tằm) Đánh giá: - Theo dõi sâu, tằm chết trong vòng 15 ngày. - Số sâu, tằm chết ≥ 70%: mạnh ≥ 60 %: khá mạnh ≥ 50 %: trung bình.  40%: yếu. 2.2.6.Phương pháp kiểm tra độ bền nhiệt của chất kháng sinh. Dịch chiết kháng sinh thô được đặt trong tủ sấy ở 600C; 800C;1000C; 1150C; 1210C kéo dài trong 10, 30, 60 phút rồi xác định họat tính kháng sinh bằng phương pháp đục lỗ. 2.2.7.Phương pháp bảo quản giống nấm sợi trên môi trường thạch có lớp dầu khoáng [9], [39]. Dầu khóang parafin lỏng hay vaselin trung tính, không chứa sản phẩm độc đối với vi sinh vật, hấp vô trùng ở 1210C trong 2 giờ, để nguội. Chuẩn bị các ống giống đã cấy, ở nhiệt độ phòng và thời gian thích hợp. Đổ lớp dầu khóang đã vô trùng lên bề mặt môi trường có VSV phát triển tốt một lượng dầu cách mép trên ống nghiệm 1 cm. Hàn kính ống nghiệm bằng parafin rồi đem bảo quản ở nhiệt độ lạnh 40C. 2.2.8.Phương pháp xử lí số liệu bằng toán thống kê đơn giản n 1 i 1 X X N   Trong đó X1: giá trị từng lần lặp thí nghiệm N : số lần lặp lại. i : số lần đo X: giá trị trung bình của các lần lặp lại thí nghiệm Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN. 3.1. Kết quả phân lập các chủng nấm sợi từ rừng ngập mặn huyện Cần Giờ. Mục đích của việc phân lập các chủng nấm sợi từ các mẫu khác nhau nhằm làm sáng tỏ một phần về quần thể nấm sợi, sự phân bố và các hoạt động sinh lý, sinh hoá cũng như vai trò của chúng trong khu hệ sinh thái RNM, tuyển chọn các chủng có nguồn gen quí để có thể nghiên cứu ứng dụng vào thực tế. Từ các mẫu thân, cành khô, lá tươi, lá mục, đất mặt, đất sâu thu nhận được sau 3 lần lấy mẫu tại RNM Cần giờ, trong khoảng thời gian từ tháng 6 đến tháng 9 năm 2006, sử dụng môi trường MT 1, với phương pháp đã trình bày ở phần 2.2.1; 2.2.2 chúng tôi đã phân lập được 312 chủng nấm sợi khác nhau. Trong đó có: - 34 chủng lấy từ lá vàng và 62 chủng lấy từ lá phân hủy. - 63 chủng phân lập từ thân mục và 39 chủng từ thân khô ở rừng cây già. - 93 chủng phân lập từ đất mặt và 21 chủng từ đất sâu. Từ kết quả trên cho thấy nấm sợi có mặt trong mọi cơ chất của RNM. Trong đất bề mặt có số lượng các chủng nhiều nhất. Vì đa số nấm sợi là các sinh vật hiếu khí, cho nên lớp đất bề mặt rất thích hợp với chúng. Số lượng nấm sợi ở các mẫu thân và lá mục nhiều hơn ở thân, lá tươi, điều đó có thể chứng minh khả năng phân giải các cơ chất này kèm theo sự tăng sinh khối của các loài nấm trên các cơ chất đó. Trong thân, cành mục có nấm sợi chứng tỏ chúng có vai trò phân giải xác thực vật RNM. Chúng đã sử dụng các chất hữu cơ chủ yếu từ xác các loài thực vật, một ít xác động vật làm nguồn cung cấp chất dinh dưỡng. Sự phân giải này đã góp phần làm giảm sự ô nhiễm môi trường, tham gia vòng tuần hoàn vật chất của lưới thức ăn. Chính sự hiện diện của nấm sợi đã nâng cao hiệu suất sinh thái của hệ sinh thái rừng ngập mặn [19]. Các chủng phân lập được tiến hành sơ tuyển để chọn những chủng nấm sợi có khả năng sinh KS. 3.2. Khảo sát khả năng sinh các chất kháng sinh của các chủng nấm sợi phân lập từ RNM Cần Giờ. Từ 312 chủng đã phân lập, chúng tôi tiến hành xác định hoạt tính kháng sinh với các VSV kiểm định G+ (B. subtilis), G- (E. coli) theo phương pháp 2.2.3.2. Kết quả được trình bày theo bảng 3.1 Bảng 3.1. Kết quả khảo sát khả năng sinh kháng sinh của các chủng nấm sợi phân lập từ RNM Cần Giờ ở các vị trí lấy mẫu Hoạt tính KS (D-d, mm) Hoạt tính KS (D-d, mm) STT Kí hiệu Chủng B.subtillis E.coli Tồng số chủng Vị trí lấy mẩu STT Kí hiệu Chủng B.subtillis E.coli Tồng số chủng Vị trí lấy mẫu 1 L1 11 11 21 L16.3 9 14 2 L’1 17 17 22 L24 14 3 L1.3 3 23 L15.5 12 4 L’1.3 2 24 L15.3 12 12 5 L3.3 8 25 L30.1 20 6 L4.1 4 26 L32.2 29 7 L4.2 10 14 27 L32.1 24 8 L5.1 13 28 L33.1 11 14 9 L5.3 14 12 29 L34 12 10 L’5.3 12 30 L’34 5 11 L’6.1 10 31 L35 17 12 L6.2 7 9 32 L36 13 13 L13 23 33 L37 14 14 L12 9 34 L38 15.5 15 L’12 13 14 35 L28 16.5 11 16 L14 7 36 L28.1 20 17 L14.2 9 37 L 41 13 19 18 L14.3 9 38 L41.1 12 19 L15.2 12 39 L41.3 15 20 L16.2 20 18 20 Lá vàng ở RNM 40 L41.4 12 41 L41.5 24 9 42 L41.9 18 22 Lá mục ở RNM Hoạt tính KS (D-d, mm) Hoạt tính KS (D-d, mm) STT Kí hiệu Chủng B.subtillis E.coli Tồng số chủng Vị trí lấy mẫu STT Kí hiệu Chủng B.subtillis E.coli Tồng số chủng Vị trí lấy mẫu 43 Đ’ 30 32 18 63 Đ29 22 6 44 Đ 9 22 64 Đ24.1 5 45 Đ’9 22 65 Đ 30 25 8 46 Đ 9.1 12 66 Đ32 21 47 Đ’ 9.2 24 67 Đ33 17 48 Đ 2.1 24 4 68 Đ33.1 25 8 49 Đ’2 9 69 Đ’34.1 12 9 50 Đ 3 21 5 70 Đ’34.3 7 51 Đ’5 32 71 Đ34.2 28 17 52 Đ 7 12 72 Đ34.4 16 53 Đ’ 8.1 20 73 Đ28 20 Đất mặt ở RNM 54 Đ 8 6 74 D 1 14 - 55 Đ10.2 21 75 D6 4 - 56 Đ10.2 21 76 Đ’ 9.2 16 - 57 Đ 12 3 77 Đ’ 9.4 28 - 58 Đ 17 6 78 Đ30.1 14 - 5 Đất sâu ở RNM 59 Đ19 9 31 Đất mặt ở RNM 60 Đ’19 7 61 Đ14.3 8 62 Đ22 11 Hoạt tính KS (D-d, mm) Hoạt tính KS (D-d, mm) STT Kí hiệu Chủng B.subtillis E.coli Tồng số chủng Vị trí lấy mẫu STT Kí hiệu Chủng B.subtillis E.coli Tồng số chủng Vị trí lấy mẫu 79 T’ 12 9 99 ĐB 12 9 80 T1 16 19 100 ĐB1 6 - 81 T’1.1 12 19 101 ĐB 3 10 14 82 T’1 30 19 102 ĐB 4 11 - 83 T1.1 10 103 ĐB 5 11 - 84 T1.2 25 24 104 ĐB 7 4 - 85 T4.1 3 105 Đ’ 0 5 - 86 T4.2 15.5 106 Đ 12 3 - 87 T4.4 6 107 Đ31 13 9 9 Đất mặt có nước ra vô 88 T4.6 8 89 T 5.1 12 90 T5.4 13 91 T7.1 25 15 92 T8.1 12 93 T11.1 10 94 T11.7 11 23 95 T12 15 96 Tc 1 18 97 T c3 12 98 Ct 10 20 Thân cây khô ở rừng cây già Hoạt tính KS (D-d, mm) Hoạt tính KS (D-d, mm) STT Kí hiệu Chủng B.subtillis E.coli Tồng số chủng Vị trí lấy mẩu STT Kí hiệu Chủng B.subtillis E.coli Tồng số chủng Vị trí lấy mẫu 108 C 1b 5 128 C18.1 14 7 109 C 3 8 129 C’18 29 110 C 1b 5 130 C18a 12 9 111 C1.3 8 131 C18b 21 112 C5 10 132 C19 8 8 113 C11.1 29 133 C 34 8 114 C11.3 26 8 134 C’34 17 Thân cây mục ở RNM 115 C11.4 27 116 C10 18 117 C13 26 5 118 C’13 16 6 119 C13.2 15 120 C15 12 7 121 C15.1 29 6 122 C15.1a 14 123 C16a 18 124 C16b 6 125 C16.1 24 27 Thân cây mục ở RNM 126 C17 6 127 C18 21 Ghi chú : D = đường kính vòng vô khuẩn, d = 8mm đường kính khối thạch Để có cái nhìn tổng quan hơn, từ bảng 3.1 chúng tôi thống kê lại thành bảng 3.2. Bảng 3.2. Kết quả thống kê họat tính kháng sinh của các chủng nấm sợi phân lập từ RNM. Họat tính kháng sinh (D - d, mm) Mức độ họat tính STT VSV kiểm định Số chủng phân lập được Yếu Trung bình Mạnh Rất mạnh Tổng số chủng có hoạt tính KS 1 B.subtilis 312 35 63 20 16 134 2 E.coli 312 18 19 2 0 39 Ghi chú: D-d  25mm: hoạt tính rất mạnh; D-d  20mm: họat tính mạnh, D- d  10  19,5mm: họat tính trung bình; D- d  10mm: hoạt tính yếu. Qua bảng 3.1 và 3.2 cho thấy: Hoạt tính đối kháng của nấm sợi phân lập từ RNM huyện Cần Giờ với các VSV kiểm định ở các mức độ mạnh yếu khác nhau. Có 134 / 312 chủng nấm sợi RNM (chiếm 42,9%) có khả năng chống lại các VK gram dương, trong đó có 16 / 134 chủng (chiếm 11,9%) thể hiện hoạt tính rất mạnh. Có 39/ 312 chủng nấm sợi RNM (chiếm 12,5%) có khả năng kháng lại các VK gram âm, trong đó có 2 chủng (chiếm 0,5 %) thể hiện họat tính mạnh. Có 39/312 chủng (chiếm 12,5%) có khả năng kháng cả VK gram dương lẫn VK gram âm. Các chủng nấm sợi phân lập từ RNM có tiềm năng sinh chất kháng sinh cao, đặt biệt là kháng sinh kháng Bacillus subtilis, một lọai trực khuẩn cỏ khô. Hoạt tính kháng sinh đã giúp các chủng nấm sợi thích nghi và có thể đấu tranh sinh học để tồn tại trong RNM. Các chủng nấm sợi này sẽ được tiếp tục nghiên cứu, nhằm tìm ra các chủng có ý nghĩa thực tiễn đối với cây trồng nói riêng và ở RNM nói chung. Khi so kết quả trên với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Vĩnh Hà (2002)[16] nhận thấy các chủng nấm sợi phân lập từ RNM Cần Giờ có khả năng kháng với các VK G (+) mạnh hơn với VK G (-). Qua bảng 3.1 cho thấy trong 134 chủng nấm sợi có hoạt tính kháng sinh phân lập từ RNM chúng tôi nhận thấy có 49/134 chủng (chiếm 36,5 %) ở thân cây mục và lá mục; 31/ 134 chủng (chiếm 23%) ở lớp đất bề mặt, 20/ 134 chủng (chiếm 15%) ở thân cây khô ở rừng già; 20/ 134 chủng (chiếm 15%) ở lá vàng, 9/134 chủng (chiếm 6,7 %) ở đất mặt có nước ra vô; 5/ 134 chủng (chiếm 3,7%) ở lớp đất sâu từ 5- 10 cm. Chúng tôi nhận thấy các chủng nấm sợi có hoạt tính KS có mặt trong mọi cơ chất của RNM. Đặc biệt nấm sợi sinh KS có ở lớp đất mặt, lá mục, thân cây mục nhiều hơn ở lá và cành cây tươi, điều đó có thể chứng minh khả năng phân giải các cơ chất này kèm theo sự tăng sinh khối của các loài nấm trên các cơ chất đó. Các nấm sợi phân lập từ cành, thân, lá tươi là các nấm kí sinh nội bào, chúng sử dụng chất dinh dưỡng của tế bào chủ khi sống mà không gây ảnh hưởng gì. Ở đất bùn nơi không có thân, lá rụng thì số lượng nấm rất ít, có thể là do các lá cây và thân cây ngoài chức năng là chất dinh dư