Luận văn Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của một số chủng nấm sợi thuộc giống Aspergillus, Trichoderma và ứng dụng

romycetes (Fungi imperfect), chúng được phân loại như sau: Giới: Nấm Nghành: Ascomycota Lớp: Deuteromycetes Bộ: Moniliales Họ: Moniliceae Giống: Trichoderma Một số tài liệu phân loại giống Trichoderma thuộc họ Moniliacae, bộ Moniliales, lớp nấm, nấm bất toàn (Fungi imperfecti). Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 1.2.2.2. Đặc điểm hình thái [62, 63] Khuẩn lạc Trichoderma harzianum ban đầu có màu lục trắng, sau dần dần chuyển sang màu lục sẫm, mặt dưới khuẩn lạc không màu. Bào tử áo hình cầu, nhẵn, không màu, đường kính 6-12 m, ở giữa sợi nấm hoặc đính ở các nhánh. Giá bào tử trần ngăn vách, phân nhánh 2-3 lần, đường kính 4 - 5 m, dài tới 250 m. Thể bình có kích thước 3-4 x 5-7m, thường thành 2-5 cái ở đỉnh nhánh tận cùng, ở dọc các nhánh thường đơn độc. Thể bình ở giữa thường dài tới 17 m và có đường kính nhỏ hơn, phần rộng nhất khoảng 2-3 m. Bào tử trần hình gần cầu, hình trứng, phần gốc hơi bẹt, nhẵn, màu lục nhạt, không vách ngăn, kích thước 2-3 x 3-3,5 m, nhày ở thể bình. Hình 1.9. Hình thái bào tử và khuẩn lạc của Trichoderma harzianum [64] 1.2.2.3. Đặc điểm sinh lý, hóa sinh Trichoderma harzianum được tìm thấy ở những vùng ấm áp. Theo nghiên cứu của Domsch và cộng sự (1980), nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng, phát triển của Trichoderma harzianum vào khoảng 30C, tối đa khoảng 36C. Trichoderma harzianum cũng có thể phát triển ở nhiệt độ khoảng 5C, nhưng sinh trưởng rất chậm và yếu . Trichoderma harzianum tổng hợp enzyme chitinase và các chất kháng sinh (Trichodermin, glyotosin…).Vấn đề độc tố của Trichoderma harzianum chưa được biết đến. 1.3. SƠ LƯỢC CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CHITINASE 1.3.1. Trên thế giới So với các enzyme khác như protease, amylase, pectinase ... thì hệ enzyme chitinase được nghiên cứu chậm hơn và các công trình nghiên cứu về chúng còn hạn chế. Đối tượng được nghiên cứu sớm nhất và khá nhiều là xạ khuẩn Streptomyces (L.R. Berger và D.M. Renolds, 1958; R. Grupta, R. K. Saxena, P. Chatuvedi và J. S. Windi, 1995). Những nghiên cứu trên đối tượng này nhằm thu nhận chitinase ứng dụng chủ yếu vào việc phá vỡ vách tế bào nấm. Năm 1978, P.A. Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 Carroad và R. A. Tom có công trình nghiên cứu việc sử dụng phương pháp sinh học trong xử lý chất thải chứa chitin, và tiếp đó là nghiên cứu của I. G. Cosio, R. A. Fisher, P. A (1982) đề cập đến quá trình sản xuất enzyme nhằm xử lý chất thải chứa chitin. Về sau, trong những năm 1989, việc thu nhận chitinase được tiếp tục nghiên cứu trên các đối tượng khác như Serratia liquefaciens (S. Joshi, Kozlowski), Myrothecium verrucaria (P. Vyas và M. V. Deshpand) và vẫn chủ yếu tìm hiểu ứng dụng của chitinase trong việc phá vỡ vách tế bào nấm. Những năm gần đây, chitinase được nghiên cứu nhiều trên đối tượng nấm sợi Trichoderma. Năm 1991, C. J. Ulhoa, J. F. Peberdy nghiên cứu sự điều hòa quá trình sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma harzianum. Năm 1999, P. A. Felse và T. Panda nghiên cứu tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp chitinase từ Trichoderma hazianum. Năm 2000, P. A. Felse và T. Panda nghiên cứu quá trình nuôi cấy chìm thu nhận chitinase từ Trichoderma harzianum trong bể lắc. Năm 2003, Ashok Pandey và cộng sự nghiên cứu tối ưu hóa quá trình tổng hợp chitinase có tính kháng nấm từ Trichoderma harzianum nuôi cấy trên môi trường bán rắn. Dường như Trichoderma là chi nấm đến nay được phát hiện có hoạt tính chitinase khá cao, ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực, đặc biệt trong bảo vệ thực vật. Đối với chi nấm Aspergillus cũng đã có một số công trình nghiên cứu về khả năng sinh chitinase của chúng trên môi trường bán rắn (Nopakarn Rattanakit và cộng sự, 2002). Những chủng thuộc chi nấm này được nghiên cứu thu nhận chitinase là Aspergillus carneus (A. A. Sherief, 1990); A. Fumigatus (Jin-Ian Xia và Jing Xiong, 2009). A. A. Shubakow và P. S. Kucheryavykh (2003) đã nghiên cứu nuôi cấy nhiều chủng nấm khác nhau trong đó có các chủng thuộc các chi nấm Aspergillus và Trichoderma... Tuy nhiên những nghiên cứu về chitinase từ nấm sợi phần lớn thực hiện trên môi trường nuôi cấy lỏng. Vi khuẩn cũng là một đối tượng được nghiên cứu về việc sinh tổng hợp chitinase. Năm 1998, B. Bhushan, G. S. Hoondal nghiên cứu enzyme chitinase chịu nhiệt từ Bacillus sp G-1. Và gần đây nhất, năm 2009, S. M. Akhir và cộng sự nghiên cứu tối ưu hóa môi trường nuôi cấy thu nhận enzyme chitinase từ Bacillus licheniformis bằng phương pháp nghiên cứu bề mặt đáp ứng (RSM). Ưu điểm của chitinase thu nhận từ vi khuẩn này là tính bền nhiệt của chúng. Trên đối tượng thực vật, cũng có một vài nghiên cứu thu nhận chitinase. Năm 2004, Isabela S. Santos và cộng sự có công trình nghiên cứu về chitinase thu nhận trên đối tượng thực vật (hạt cây Adenanthera pavonina L.), cây họ đậu Phaseolumungo. Kết quả cho thấy chitinase từ hạt cây Adenanthera pavonina L. là loại enzyme bền nhiệt. Tác giả Wen-Chi Hou, Yaw-Huei Lin, Ying- Chou Chen (1998) nghiên cứu thu nhận chitinase chiết rút từ lá khoai lang. Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 1.3.2. Trong nước Nhìn chung những nghiên cứu về enzyme chitinase trong nước còn rất hạn chế cho dù tiềm năng ứng dụng rộng rãi của enzyme này là không thể phủ nhận. Năm 2001, tác giả Đinh Minh Hiệp có công trình nghiên cứu đặc tính của enzyme chitinase thu nhận từ nấm mật Coprinus fimentarius và một số ứng dụng trong lĩnh vực bảo vệ thực vật và y dược. Năm 2003, các tác giả Nguyễn Thị Hồng Thương, Đinh Minh Hiệp, Đồng Thị Thanh Thu có công trình nghiên cứu khảo sát một số yếu tố tác động lên quá trình sinh tổng hợp hệ enzyme chitinase của các chủng nấm mốc Trichodrema sp. Năm 2004, tác giả Tô Duy Khương thực hiện đề tài khảo sát sự sinh tổng hợp chitinase ở Trichoderma spp. và khả năng đối kháng với một số nấm gây bệnh. Năm 2008, tác giả Nguyễn Đình Nga và cộng sự khảo sát khả năng tác động lên nấm Candida albicans của enzyme chitinase thu nhận từ thực vật và từ nấm Trichoderma. Trên đối tượng thực vật, năm 2008, tác giả Đặng Trung Thành đã nghiên cứu quá trình thu nhận enzyme chitinase từ cây khoai lang Ipomoea batatas, thu enzyme chitinase có hoạt tính khá cao (hoạt độ đạt 192 UI/ml) Nhìn chung, những nghiên cứu về chitinase trong nước chưa nhiều, chủ yếu vẫn trên nấm Trichoderma, ứng dụng chủ yếu mới đề cập đến trong lĩnh vực bảo vệ thực vật và khởi đầu trong lĩnh vực y dược. Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 2.1.1 Giống vi sinh vật Các chủng nấm sợi Aspergillus niger và Aspergillus awamori, Aspergillus sp., Trichoderma harzianum do phòng thí nghiệm, bộ môn Sinh hóa, trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Thành phố Hồ Chí Minh và bộ môn Vi sinh, trường Đại Học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp. 2.1.2 Các môi trường sử dụng trong thí nghiệm 2.1.2.1. Môi trường nuôi cấy và giữ giống nấm sợi MT 1: Cao nấm men agar – Yeast Extract Agar (YEA) [1, 12] Cao nấm men 4g Agar 20g Glucose 20g Nước 1000ml pH = 5,5 – 6,0 Khử trùng 1atm/30 phút MT 2: Thạch khoai tây Dextrose (PDA) [6, 10, 26] Nước chiết khoai tây 200ml Agar 20g Glucose 20g Nước 1000ml pH = 5,5 – 6,0 Khử trùng 1atm/30 phút MT 3: Malt Extract Agar (YEA) [11,26] Cao Malt 20g Pepton 1g Agar 20g Glucose 20g Nước 1000ml pH = 5,5 – 6,0 Khử trùng 1atm/30 phút 2.1.2.2. Môi trường cảm ứng tổng hợp enzym chitinase [12, 13, 29] Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 MT 4: NaNO3 3,5g K2HPO4 1,5g MgSO4.7H2O 0,5g KCl 0,5g FeSO4.7H2O 0,01g Bột chitin 10g Agar 20g Nước 1000ml pH = 6,5 Khử trùng 1atm/30phút 2.1.2.3. Môi trường bán rắn khảo sát khả năng sinh tổng hợp hệ enzyme thủy phân chitinase từ các chủng nấm sợi [12,15, 34, 36] MT 5: Trấu 50g Cám 40g Đường vàng 4g (NH4)2HPO4 0,1g Urê 2,2g CaCl2 0,1g KCl 0,05g MgSO4.7H20 0,05g HCl 0,05g Bột chitin 10g Nước 60% MT 6: Trấu 50g Cám 40g Cao nấm men 1g (NH4)2SO4 0,1g CaCl2 0,1g KCl 0,05g MgSO4.H20 0,05g Bột chitin 10g Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 Nước 60% * Thay thế bột chitin bằng nguyên liệu giàu chitin khác (bột vỏ tôm, bột vỏ cua) để nghiên cứu ảnh hưởng cơ chất cảm ứng lên khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của chủng nấm sợi chọn nghiên cứu. 2.2 DỤNG CỤ THIẾT BỊ HÓA CHẤT 2.2.1 Dụng cụ - Thước đo khuẩn lạc. - Bình tam giác các kích cỡ khác nhau (250ml, 500ml, 1000ml). - Ống nghiệm 5ml, 10ml. - Đĩa petri. - Pipetman các loại. - Buồng đếm hồng cầu. - Đèn cồn, diêm quẹt, que cấy, giấy lọc, giấy báo cũ, bông không thấm nước, bông thấm nước, đũa khuấy, phễu, ống đong, vải lọc … - Nồi nấu môi trường, lò điện. 2.2.2 Thiết bị - Nồi hấp vô trùng. - Tủ cấy vô trùng. - Tủ sấy 300C – 1800C. - Tủ ấm. - Máy đo pH. - Máy li tâm. - Cân phân tích điện tử. - Máy chụp ảnh kỹ thuật số. - Máy nghiền mẫu. - Máy đo độ ẩm. - Máy đo quang phổ UV / Visible Spectrophometre ... - Tủ lạnh. 2.2.3 Hóa chất và vật liệu Glucose, cao nấm men, chitin, agar, cồn, nước cất, khoai tây, trấu, cám; NaNO3, K2HPO4, MgSO4.7H2O, KCl, FeSO4.7H2O, (NH4)2HPO4, (NH4)2SO4, Urê, CaCl2, HCl, NaH2PO4, Na2HPO4, Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 N-acetyl-β-D-Glucosamine, Lugol, thuốc thử DNS, và các hóa chất khác sử dụng trong từng phương pháp sẽ nêu cụ thể. 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Phương pháp cấy chuyền và giữ giống nấm sợi [1, 6, 12] Thực hiện: Chuẩn bị môi trường PGA, cho vào các ống nghiệm, đem hấp khử trùng, lấy ra để nguội tạo môi trường thạch nghiêng. Thực hiện trong buồng cấy: cấy bào tử chủng nấm nghiên cứu lên bề mặt thạch trong ống nghiệm. Để ống vừa cấy chuyền ở nhiệt độ phòng (28 – 300C) trong thời gian 7 ngày, sau đó đem vào tủ giữ giống 40C. Sau 2 tháng cấy chuyền một lần. 2.3.2 Phương pháp xác định sơ bộ khả năng tổng hợp enzyme chitinase bằng cách đo đường kính vòng phân giải [1, 12, 22] Nguyên tắc: khi nuôi cấy trong môi trường thạch có bổ sung chitin, nấm sợi sinh enzyme chitinase phân giải chitin thành các dạng có cấu trúc mạch ngắn hơn và N-acetyl- D- glucosamine. Các dạng này không cho phản ứng màu với thuốc thử Lugol, do đó sau khi nhỏ thuốc thử Lugol, độ lớn của phần môi trường trong suốt phản ánh khả năng sinh tổng hợp chitinase của nấm sợi. Phương pháp này chỉ định tính enzyme, chỉ đánh giá sơ bộ khả năng tổng hợp chitinase chứ chưa xác định chính xác hoạt độ chitinase. Thực hiện: Chuẩn bị môi trường cảm ứng tổng hợp enzyme chitinase (MT 4), hấp khử trùng ở 121OC trong 30 phút. Dùng các đĩa petri vô trùng (sấy ở 1600C trong 120 phút) có kích thước bằng nhau, cho 20ml môi trường từ ống nghiệm vào đĩa, để nguội, sau 1-2 ngày kiểm tra sự tạp nhiễm. Cấy chấm điểm chủng nấm sợi nghiên cứu vào đĩa, có thể chấm một điểm giữa hoặc 3 điểm trên đĩa petri. Ủ ở nhiệt độ phòng (28-300C) trong 2-3 ngày. Cho thuốc thử Lugol vào, để 5 phút rồi đo đường kính vòng phân giải bằng thước đo khuẩn lạc. Nếu D – d ≥ 25mm : hoạt tính enzyme mạnh D – d ≥ 20mm : hoạt tính enzyme khá mạnh D – d ≥ 15mm : hoạt tính enzyme trung bình D – d ≤ 10mm : hoạt tính enzyme yếu Từ đó chọn chủng có tạo hệ enzyme thủy phân chitinase từ khá trở lên tiếp tục nghiên cứu tối ưu hóa. Cách pha dung dịch Lugol Iod 2,5g KI 5g Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 Nước 1000ml 2.3.3 Phương pháp nuôi cấy nấm sợi trên môi trường bán rắn thu enzyme chitinase [12, 34] Nguyên tắc: Nấm sợi sử dụng chất dinh dưỡng có sẵn trong môi trường để sinh trưởng, tổng hợp một lượng lớn enzyme ngoại bào lẫn trong môi trường, ta thu được sinh khối nấm sợi lẫn enzyme thô từ canh trường. Thực hiện: Cân 10 gam môi trường bán rắn nuôi cấy nấm sợi thu enzyme chitinase (MT 5) vào các bình tam giác 250 ml, hấp khử trùng ở 1210C trong 30 phút, sau đó để nguội. Dùng giống trong ống thạch nghiêng, cho 10ml nước cất vô trùng vào mỗi ống, dùng que cấy cà đều bề mặt lấy hết bào tử tạo dạng huyền phù.Tiến hành đếm bào tử bằng buồng đếm hống cầu. Cho 2ml huyền phù bào tử vào mỗi bình tam giác chứa môi trường đã chuẩn bị (mật độ bào tử là 105 đến 106 bào tử/1 gam môi trường). Nuôi ở nhiệt độ phòng. Canh trường nuôi cấy được thu nhận sau từng khoảng thời gian, điều kiện nhiệt độ, pH nhất định theo mục đích nghiên cứu cụ thể. 2.3.4 Phương pháp tách chiết dịch enzyme thô và thu nhận chế phẩm enzyme từ canh trường nuôi cấy [1, 12, 15] Nguyên tắc: Dựa trên khả năng hòa tan trong nước của các enzyme, dùng nước cất hòa tan tạo dịch enzyme, sau đó dùng các tác nhân kết tủa khác nhau để kết tủa enzyme. Kết tủa enzyme được sấy ở nhiệt độ dưới 400C, tạo sản phẩm enzyme dạng bột khô. Thực hiện: Sau khi nuôi cấy trong các điều kiện môi trường cụ thể, cho vào mỗi bình tam giác (chứa 10 gam môi trường) 80ml nước cất. Lắc trong 1 giờ, tốc độ 200 vòng/ phút, lọc qua vải, thu dịch lọc. Đem dịch lọc li tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi, ta được dịch enzym thô. Để thu được chế phẩm enzyme (CPE) dạng bột khô, sử dụng tác nhân tủa là Etanol 960 với tỉ lệ 1/3 – 1/4 (dung dịch Enzyme/Etanol) để kết tủa enzyme, ly tâm thu tủa enzyme, sấy nhiệt độ dưới 400C được sản phẩm (CPE). 2.3.5 Phương pháp xác định hoạt độ của enzyme chitinase theo phương pháp so màu với thuốc thử DNS (3,5-dinitrosalicylic acid) [11,12]  Định nghĩa Phương pháp so màu là phương pháp phân tích dựa trên việc so sánh cường độ màu của dung dịch nghiên cứu với cường độ màu của dung dịch tiêu chuẩn có nồng độ xác định. Dùng phương pháp so màu chủ yếu để xác định lượng nhỏ các chất, phương pháp này cho phép tiết kiệm thời gian cùng kết quả chính xác cao so với các phương pháp khác. Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18  Nguyên tắc + đường khử → + đường oxi hóa 3,5-dinitrosalicylic acid 3-amino-5-nitrosalicylate Khi enzyme phân hủy chitin tác dụng với cơ chất là chitin huyền phù, sản phẩm tạo thành là N-acetyl-β-D-Glucosamine được hiện màu với thuốc thử DNS (3,5-dinitrosalisylic acid) và đem đo mật độ quang ở bước sóng 535nm.  Hóa chất * Dung dịch đệm phosphat 0,2M, pH 6,5 - Dung dịch NaH2PO4 0,2M: cân 31,2g NaH2PO4.2H2O hòa tan và thêm nước cất đến 1000ml. - Dung dịch Na2HPO4 0,2M: cân 71,6g Na2HPO4.12H2O hòa tan và thêm nước cất đến 1000ml. * Thuốc thử DNS - Dung dịch A: hòa tan 300g muối Na-K tartrat kép vào trong 500ml nước cất. - Dung dịch B: hòa tan 10g 3,5-dinitrosalicylic acid vào 200ml dung dịch NaOH 2N. - Thuốc thử DNS dùng trong phản ứng: trộn dung dịch A với dung dịch B, thêm nước cất cho đủ 1 lít. Chỉ pha dung dịch DNS dùng cho phản ứng trước khi sử dụng, bảo quản trong chai nâu và tránh không khí.  Chuẩn bị dịch huyền phù chitin 1% Do chitin không hòa tan trong nước nên để tiến hành xác định hoạt tính enzyme chitinase cần huyền phù hóa chitin: Lấy 5 gam chitin hòa tan trong 50ml HCl đậm đặc. Khuấy đều trong vòng 3 phút ở 40C. Sau đó cho nước cất lạnh 5C từ từ tới 500ml, chitin sẽ tạo huyền phù màu trắng sữa. Huyền phù sẽ được lọc qua giấy lọc hoặc ly tâm (3500 vòng/phút trong 7 phút). Rửa nước cất nhiều lần để pH đạt trung tính, bảo quản huyền phù ở tủ lạnh (2-6C).  Dựng đường chuẩn N-acetyl-β-D-Glucosamine Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm dựng đường chuẩn Glucosamine Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5 6 7 Nồng độ N-acetyl-β-D- Glucosamine 10µmol/ml chuẩn (µmol/ml) 0 1 2 3 4 5 6 7 Thể tích dung dịch N-acetyl-β- D-Glucosamine (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 Thể tích nước cất (ml) 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 DNS (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 Lắc đều, đun sôi 5 phút H2O (ml) 5 5 5 5 5 5 5 5 Lắc đều, để yên 5 phút, đo OD ở bước sóng 535 nm Chuẩn bị dung dịch N-acetyl-β-D-Glucosamine chuẩn 10µmol/ml: cân chính xác 0,0221g N- acetyl-β-D-Glucosamine, cho nước cất vào đủ 10ml. Dựng đường chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ N-acetyl-β-D-Glucosamine và giá trị OD.  Xác định hoạt độ enzyme chitinase Nguyên tắc: hoạt độ enzyme chitinase được xác định đựa trên phương pháp định lượng glucosamine trong quá trình phân giải chitin. Lượng glucosamine tạo ra được xác định theo phương pháp Elson- Morgan. Tiến hành  Đối với enzyme làm thí nghiệm Chọn các ống nghiệm có cùng kích cỡ, cùng độ dày. Cho vào ống nghiệm hỗn hợp phản ứng gồm: 1ml huyền phù chitin 1% và 1ml dịch enzyme chitinase. Hỗn hợp này được ủ ở 50C trong vòng 60 phút. Ngừng phản ứng bằng 1ml NaOH 1N và đun sôi cách thủy trong 5 phút. Ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút hoặc lọc, thu dịch nổi. Cho 1ml dịch nổi và 1ml DNS 1%, lắc đều, đun sôi cách thủy trong 5 phút, làm lạnh nhanh trong bồn làm lạnh. Thêm 5ml nước cất, lắc đều và đo OD với bước sóng 535nm.  Đối với dịch enzyme làm đối chứng Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 Cho 1ml dịch enzyme vào ống nghiệm, nhỏ 1ml NaOH 1N, sau đó cho thêm 1ml dịch huyền phù chitin 1% vào, tiếp tục làm theo các bước tương tự như trên.  Cách tính [16] Một đơn vị hoạt tính enzyme chitinase (đvht) là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1g N-acetyl-β-D-Glucosamine (NAG) từ chitin huyền phù trong thời gian 1 phút ở nhiệt độ phản ứng (500C). Tổng hoạt tính (đvht) = t Vna .. Hoạt tính chung (đvht/g.CP.E ) = mtv vna .. '.. Trong đó a: hàm lượng glucosamine (g /ml) trong dịch thí nghiệm đã pha loãng n: hệ số pha loãng V: thể tích dịch môi trường nuối cấy (ml) v’: thể tích dịch enzyme ban đầu (ml) v : thể tích enzyme thí nghiệm (ml) t : thời gian phản ứng (phút) m : khối lượng enzyme (g) 2.3.6 Phương pháp khảo sát sự biến thiên hoạt độ của hệ enzyme chitinase của các chủng nấm sợi theo các điều kiện nuôi cấy khác nhau (nhiệt độ, thời gian, chất cảm ứng) khi nuôi cấy trên môi trường bán rắn [12, 23] Nguyên tắc Yếu tố môi trường ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh tổng hợp enzyme của nấm sợi như thời gian nuôi cấy, nhiệt độ môi trường nuôi, loại cơ chất cảm ứng ... Khảo sát các yếu tố trên nhằm chọn ra điều kiện tối ưu để nuôi cấy chủng nấm sợi nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase có hoạt độ cao nhất. 2.3.6.1. Xác định thời gian thích hợp để thu nhận chitinase có hoạt độ cao nhất ở các chủng nấm sợi nghiên cứu Chuẩn bị môi trường nuôi cấy (mục 2.3.3). Cấy các chủng nấm sợi. Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 Thu dịch chiết enzyme (mục 2.3.4) tại các thời điểm nuôi cấy 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ, 72 giờ, 84 giờ, 96 giờ. Xác định sự biến thiên hoạt độ enzyme (mục 2.3.5) chitinase theo thời gian nuôi cấy các chủng nấm sợi nghiên cứu. 2.3.6.2. Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ môi trường nuôi đối với đối với khả năng sinh tổng hợp chitinase ở các chủng nấm sợi nghiên cứu Sử dụng Môi trường 5 (mục 2.1.2), nuôi cấy trong thời gian tối ưu đã khảo sát ở trên ở các nhiệt độ môi trường 20OC, 25OC, 30OC, 35OC, 40OC, 450C. Tiến hành thu dịch chiết enzyme, tiến hành xác định hoạt độ enzyme (theo mục 2.3.5) 2.3.6.3. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng (chitin) đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của các chủng nấm sợi Sử dụng Môi trường 5 (mục 2.1.2), lần lượt bổ sung chitin ở các nồng độ 0,0%, 5%, 10%, 15%, 20%. Nuôi cấy ở nhiệt độ và thời gian tối ưu đã khảo sát ở mục 2.3.6.1 và 2.3.6.2. Tiến hành thu dịch chiết enzyme, xác định hoạt độ chitinase. 2.3.6.4. Khảo sát ảnh hưởng chất cảm ứng đến khả năng sinh tổng hợp chitinase ở các chủng nấm sợi nghiên cứu Sử dụng Môi trường 4 (mục 2.1.2), trong đó sử dụng thay thế lần lượt bột chitin, bột vỏ tôm, bột vỏ cua (tương ứng lượng chitin là 10%). Nuôi cấy trong thời gian và nhiệt độ tối ưu đã khảo sát ở trên, thu dịch enzyme thô, tiến hành xác định hoạt độ enzyme (theo mục 2.3.5) 2.3.7 Phương pháp tối ưu điều kiện môi trường nuôi cấy nấm sợi bằng qui hoạch thực nghiệm [2] Để xác định điều kiện tối ưu cho quá trình nuôi cấy chủng nấm sợi chọn thu chế phẩm enzyme chitinase, chúng tôi dùng thực nghiệm yếu tố toàn phần. Từ các kết quả thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng riêng lẻ từng yếu tố, chúng tôi chọn 3 yếu tố là thời gian nuôi cấy, nhiệt độ môi trường nuôi cấy và nồng độ chitin trong môi trường nuôi cấy để nghiên cứu tối ưu hóa theo phương pháp qui hoạch thực nghiệm. - Lập ma trận đầy đủ với số thí nghiệm N = 23 = 8. Vì không làm thí nghiệm song song nên để xác định phương sai tái hiện, chúng tôi làm 3 thí nghiệm ở tâm (mức cơ sở). Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 Bảng 2.2. Ma trận qui hoạch thực nghiệm STT thí nghiệm x1 x2 x3 y 1 + + + y1 2 + + - y2 3 + - + y3 4 + - - y4 5 - + + y5 6 - + - y6 7 - - + y7 8 - - - y8 9 0 0 0 y0(1) 10 0 0 0 y0(2) 11 0 0 0 y0(3) - Dùng PTHQ tuyến tính dạng: ŷ = b0 + b1x1 + b2x2 + b3x3 + b12x1x2 + b13x1x3 + b23x2x3 + b123x1x2x3 trong đó ŷ: hoạt độ chitinase theo phương trình hồi qui (PTHQ) - Tính b0, b1, b2, b3 ... bj - các hệ số của phương trình hồi qui bằng công thức:    N i ijij yxN b 1 1 N yxx b N i iilj jl   1 )( - Kiểm định tính ý nghĩa của các hệ số PTHQ theo tiêu chuẩn Student + Giá trị trung bình của thông số tối ưu hóa (hoạt độ chitinase) của 3 thí nghiệm tại tâm: ŷ0 = 3 3 1 )0(u uy + Phương sai tái hiện: Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 1 )( 1 2 0)0( 2      n yy s n u u th với n: số thí nghiệm tại tâm (ở đây n=3)  sth + Sai số tính cho bi: N s s thbi  + Tính các giá trị t: tj = | |bj sbj với tlt: p=0,05; bậc tự do f = n-1 = 2 → t(0,05;2)= 4,3 (Tra bảng Student) Hệ số có ý nghĩa phải thỏa mãn điều kiện tj > tlt - Kiểm định sự tương thích của PTHQ theo tiêu chuẩn Fisher + Flt: giá trị chuẩn Fisher ở mức p = 0,05; f1 = N-l; f2 = n-1; trong đó N=8, l: số hệ số có ý nghĩa, n = 3. + Ftn: 2 2 th du tn s sF  với lN yy s i du     2 2 )ˆ( PTHQ thu được tương thích với thực nghiệm khi Ftn < Flt Từ PTHQ, nhận xét ảnh hưởng các yếu tố lên quá trình sinh tổng hợp chitinase của chủng nấm sợi chọn nghiên cứu. Sau đó tiến hành tối ưu hóa thực nghiệm bằng phương pháp đường dốc nhất, bắt đầu từ điểm không, là mức cơ sở. Từ kết quả thu được chọn điều kiện môi trường nuôi cấy thích hợp cho chủng nấm sợi chọn nghiên cứu sinh trưởng và tạo chitinase có hoạt tính cao nhất. 2.3.8 Phương pháp nghiên cứu các điều kiện hoạt động tối ưu của chế phẩm chitinase thu nhận từ một số chủng nấm sợi nghiên cứu 2.3.8.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đối với khả năng xúc tác của chế phẩm enzyme chitinase Cân 0,2g chế phẩm enzyme, hòa tan trong 10ml nước cất. Tiến hành phản ứng với chitin huyền phù trong các điều kiện nhiệt độ ủ 300C, 400C, 500C, 600C, 700C, 800C. Từ đó vẽ đồ thị biễu diễn sự biến thiên của sản phẩm tạo thành (glucosamine) theo nhiệt độ, tìm ra nhiệt độ hoạt động tối ưu của chế phẩm enzyme. 2.3.8.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH đối với khả năng xúc tác của chế phẩm enzyme chitinase pH = 3,0 – 4,0: sử dụng đệm citrate Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 pH = 4,5 – 5,5: sử dụng đệm acetate pH = 6,0 – 9,0: sử dụng đệm phosphate Cân mỗi 0,1g chế phẩm enzyme, hòa tan trong 5ml dung dịch đệm ở các pH 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0. Tiến hành phản ứng với chitin huyền phù trong điều kiện nhiệt độ ủ tối ưu đã xác định ở mục 2.3.7a. Từ đó vẽ đồ thị biễu diễn sự biến thiên của lượng sản phẩm tạo thành (glucosamine) theo pH, tìm ra pH tối ưu của hoạt động chế phẩm. 2.3.8.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng lên sản phẩm tạo thành của chế phẩm enzym chitinase Cân 0,2g chế phẩm enzyme, hòa tan trong 10ml nước cất. Tiến hành phản ứng với chitin huyền phù trong các điều kiện nhiệt độ và pH tối ưu (mục 2.3.7a, b); thời gian phản ứng thay đổi từ 10 phút đến 90 phút, mỗi lần cách nhau 10 phút. Từ đó vẽ đồ thị biễu diễn sự biến thiên hàm lượng glucosamine tạo ra theo thời gian phản ứng, tìm ra thời gian phản ứng tối ưu của chế phẩm enzyme chitinase. 2.3.9 Phương pháp nghiên cứu ứng dụng bước đầu của chế phẩm chitinase thu nhận từ chủng nấm sợi được chọn 2.3.9.1 Ứng dụng bước đầu trong diệt côn trùng sâu hại Chọn các đối tượng sâu khác nhau, xử lý dung dịch chế phẩm enzyme ở các nồng độ 0%, 1%, 2%. Theo dõi tỉ lệ sâu chết qua các mốc thời gian 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút, 150 phút. Lặp lại thí nghiệm 3 lần, thống kê số liệu. Đánh giá khả năng diệt côn trùng, sâu hại của chế phẩm enzyme. 2.3.9.2 Ứng dụng bước đầu trong sản xuất glucosamine Cân 0,2g chế phẩm enzyme, hòa tan trong 10ml dung dịch đệm có pH tối ưu đã xác định ở mục 2.3.8.2. Sử dụng cơ chất chitin dạng bột 10% và chitin huyền phù 1%, tiến hành phản ứng enzyme trong nhiệt độ tối ưu, thời gian 70 phút. Xác định hàm lượng glucosamine tạo thành, đánh giá hiệu suất tạo glucosamine. Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KHẢO SÁT SƠ BỘ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CHITINASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI Chúng tôi tiến hành khảo sát sơ bộ (phương pháp định tính) khả năng tổng hợp chitinase của m