Luận văn Khảo sát sự kháng kháng sinh của Pseudomonas Aeruginosa phân lập được trên bệnh phẩm tại viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh từ tháng 01- 06/2014

thmandu, Nepal”, kết quả thu được: đa số các chủng P. aeruginosa được phân lập từ các bệnh phẩm là đàm, mủ, nước tiểu và dịch hút khí quản. Kết quả khảo sát kháng sinh cho thấy số chủng kháng với Amikacin (17,25%), Ciprofloxacin (27,59%) và Cefoperazone-sulbactam (34,48%). Tỉ lệ đề kháng với Co-trimoxazole, Piperacillin, Ceftriaxone và Chloramphenicol dao động từ 51% đến 73%. Tất cả các chủng phân lập đều nhạy cảm với Imipenem, 20,69% các chủng P. aeruginosa là đa kháng thuốc [35]. Năm 2013, Somayeh Moazami-Goudarzi và Fereshteh Eftekhar, với đề tài: “Đánh giá độ nhạy cảm với Carbapenem và đa kháng thuốc của các P. aeruginosa phân lập từ bệnh nhân bỏng tại Tehran”, kết quả thu được: phần lớn các chủng phân lập được từ bệnh phẩm là vết thương (88,7%), tiếp theo là 5,26% từ máu, 1,5% từ nước tiểu. Kết quả khảo sát kháng sinh đồ cho thấy 99,2% kháng Carbenicillin, 98,4% kháng Ticarcillin, 96,2% kháng với Ciprofloxacin, 95,4% kháng Co- Trimoxazole, 94,7% kháng Imipenem và Meropenem, 93,9% kháng Piperacillin, 93,2% kháng Aztreonam, 92,4% với Tobramycin, 91,7% kháng Cefepime, 89,4% kháng Amikacin và ceftazidime. Nhìn chung, 100% số mẫu phân lập cho thấy vi khuẩn đa kháng thuốc (kháng ≥ 3 kháng sinh) [61]. 42 Năm 2013, Mahnaz Sarhangi, Mohammad Motamedifar và Jamal Sarvari với đề tài: “Sự phổ biến P. aeruginosa Sản xuất blaIMP1, blaVIM2, blaSIM1, blaSPM1 tại Shiraz, Iran”. Kết quả từ 240 chủng P. aeruginosa phân lập được có 82 (34,16%) số chủng kháng với Imipenem. Trong số các chủng kháng Impipenem được kiểm tra bằng phản ứng PCR đã xác nhận sự hiện diện của 18 (21,95%) số chủng P. aeruginosa mang gen blaIPM1 và blaVIM2 [49]. Qua các kết quả về các nghiên cứu trong và ngoài nước về sự đề kháng kháng sinh của P. aeruginosa, chúng tôi nhận thấy có sự gia tăng về khả kháng kháng sinh của P. aeruginosa qua các năm và mức độ kháng là khác nhau phụ thuộc vào vị trí địa lý, địa điểm, thời gian và đối tượng nghiên cứu. Nhiều cơ chế đề kháng kháng sinh của P. aeruginosa cũng đã được phát hiện và làm rõ, đặc biệt là xác định được các gene mã hóa cho khả năng kháng Carbapenem. Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 43 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ tháng 01/2014 đến 06/2014 tại phòng Vi sinh bệnh phẩm, khoa LAM, viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh. 2.2. Đối tượng nghiên cứu 2.2.1. Đối tượng Dân số mục tiêu: Tất cả các mẫu bệnh phẩm được xét nghiệm tại phòng Vi sinh bệnh phẩm, khoa LAM, viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh. Dân số chọn mẫu: Các mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân được chẩn đoán nhiễm trùng bệnh viện theo tiêu chuẩn CDC (tiêu chuẩn chẩn đoán nhiễm trùng bệnh viện theo CDC [21] [34] (phụ lục 1)) được mang đến và được xét nghiệm tại phòng Vi sinh bệnh phẩm, khoa LAM, viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh. 2.2.2. Cỡ mẫu Tất cả các chủng P. aeruginosa phân lập được trên các bện phẩm: đàm, mủ máu, nước tiểu, dịch não tủy của bệnh nhân được chẩn đoán nhiễm trùng bệnh viện trong thời gian từ tháng 1/2014 đến 6/2014. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Vật liệu - Dụng cụ: Ống nghiệm, đĩa Petri, đèn cồn, que cấy, tăm bông vô trùng, lame, lamelle, kẹp, pipette Pasteur, thước kẹp Sylvac dùng đo đường kính vòng vô khuẩn (serial N0 211047, Thụy Sỹ), pipetman (Gilson), khay và trượt dùng đổ gel, - Thiết bị: + Thiết bị dùng trong phân lập, nuôi cấy, định danh vi khuẩn 44 ∗ Kính hiển vi dùng để soi: Leiz Biomed, kiểu loại 020-501-010, Đức. Olympus CH20, kiểu loại CH20bIMF200, Nhật. ∗ Kính hiển vi soi và chụp hình: Olympus CX, U-CTR 30-2, 3K04189. ∗ Tủ cấy ATSH ESCO, Model: SC24A1, Serial: 2013-87120, Indonesia. ∗ Tủ ấm 370C Memmert, Model: 600 Đức. ∗ Tủ ấm 420C Napco, Mỹ. ∗ Tủ ấm CO2 ESCO (5%CO2), Serial: 2013-8724, Indonesia. ∗ Máy ly tâm bàn EBA III (6 tube), kiểu 2009, Đức. ∗ Máy Vortex Heidplph, kiểu loại: Top-mix 94323, Đức. ∗ Máy đo độ đục Densi-La-Mtr II, kiểu loại-2: sản phẩm từ EU. ∗ Tủ đông sâu giữ chủng Gram -200C, Nhật. ∗ Tủ lạnh bảo quản kháng sinh, môi trường, test dịnh danh API 20E hoặc API 20NE: tủ Jean (1001), Hàn Quốc. + Thiết bị dùng trong tách chiết ADN và PCR ∗ Tủ an toàn sinh học cấp 2: nhãn hiệu EHRET, mã hiệu sản xuất AuRA-U- 130, Đức. ∗ Tủ an toàn sinh học: nhãn hiệu Nuaire, mã hiệu sản xuất: NU 427-400E, Mỹ. ∗ Máy ly tâm lạnh Hermle, Đức. ∗ Máy ủ lắc nhiệt Thermo-Shaker TS 100, hãng PEQLAB – Đức. ∗ Máy Real-time PCR: nhãn hiệu Agilen techologies Stratagen Mx 3005P, Mỹ. ∗ Microwave, Sanyo, mã hiệu EM-S2086W. ∗ Bộ điện di ∗ Thiết bị đọc và chụp gel GeldDoc-It 320 Imager, seri: 97-0284-02, Mỹ. - Môi trường cấy vi khuẩn và kháng sinh sử dụng 45 + Môi trường: thạch máu CO (Columbia Agar+5% máu cừu) (Bio-rad), thạch chocolate CA (CO +5% máu cừu được chưng cách thủy đến màu nâu đất), BCP (Bromo Cresol purple) (Bio-rad), chai cấy máu hai pha (Công ty Nam Khoa, Việt Nam), MHA (Mueller Hinton Agar) (Liofilchem, Ý), TSA (Tryptic Soy Agar) (Merck, Đức), BHI (Brain Heart Infusion) (BD, Mỹ), môi trường Sabourand+Chloramphenicol (Bio-rad). + Kháng sinh sử dụng: lựa chọn kháng sinh theo tiêu chuẩn của CLSI 2014: 46 46 Bảng 2.1. Các kháng sinh sử dụng trong thử nghiệm kháng sinh đồ Nhóm Lớp Phụ lớp Tên khánh sinh sử dụng Viết tắt Hàm lượng Cách đọc Kháng Trung gian Nhạy β- lactams Penicillins Ureido-penicillin Piperacillin PIP 75µg ≤ 17 - ≥ 18 β-lactams/yếu tố kết hợp ức chế β- lactamase Ticarcillin-clavulanic acid TCC 75µg ≤14 - ≥15 Cepems Cephalosporin II Cefsulodin CFS 30µg ≤14 15-21 ≥22 Cephalosporin III Cefoperazone CFP 30µg ≤15 16-20 ≥21 Cephalosporin IV Cefepime FEP 30µg ≤14 15-17 ≥18 Monobactams Aztreonam ATM 30µg ≤15 16-21 ≥22 Penems Carbapenem Imipenem IPM 10µg ≤13 14-15 16 Nonβ- lactams Aminoglycosides Amikacin AN 30µg ≤14 15-16 ≥17 Gentamycin GM 10µg ≤12 13-14 ≥15 Tobramycin TM 10µg ≤12 13-14 ≥15 Sulfamid Sulfamides SSS 200µg ≤12 13-16 17 Fosfomycins Fosfomycin FOS 50µg ≤14 - ≥14 Lipopeptides Polymyxins Colistin CS 10µg ≤10 - ≥11 Quinolones Fluouroquinolone Ciprofloxacin CIP 5µg ≤15 16-20 ≥21 47 47 - Hóa chất + Hóa chất cho định danh vi khuẩn và kháng sinh đồ: Nước muối sinh lý (0,85%), dung dịch tím kết tinh (crystal violet); dung dịch lugol; cồn tuyệt đối; dung dịch fuchsin; dầu soi cedre; thuốc thử Oxidase của BioMerieux (Pháp); H2O2; khoanh giấy kháng sinh của BioRad; API 20E hoặc API 20NE của BioMerieux (Pháp). + Hóa chất sử dụng cho thử nghiệm Hodge test: Khoanh Meropenem 10 µg hoặc Ertapenem10 µg; dung dịch ZnSO4 (0,5M). + Hóa chất cho tách chiết ADN, PCR, điện di: ∗ Nước sinh học phân tử (ADNase free, Rnase free), hãng sản xuất Quiagen. ∗ Tris HCl 10mM (pH=8). ∗ Toptaq Master Mix kit (250). ∗ Agarose, hãng sản xuất Lonza. ∗ TBE 10x (Tris-Borate-EDTA buffer) hãng sản xuất Sigma, Mỹ. ∗ Loading dye 10x (Bromothymol Blue). ∗ Ethidiume Bromide, hãng Invitrogen, nồng độ 10mg/ml. - Quản lý và xử lý số liệu bằng phần mềm Microsoft excel 2007 2.3.2. Phương pháp thực hiện Phương pháp nuôi cấy, phân lập, định danh và thực hiện kháng sinh đồ theo quy trình chuẩn của viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh đạt chuẩn ISO 15189:2007. 1. Phân lập và nuôi cấy vi khuẩn từ bệnh phẩm: đàm, máu, nước tiểu, mủ, dịch não tủy. 2. Nhuộm Gram: xác định vi khuẩn Gram âm 48 48 3. Định danh các chủng P. aeruginosa phân lập được: dùng các thử nghiệm sinh hóa hoặc chạy API 20E hoặc API 20NE. 4. Làm kháng sinh đồ theo phương pháp Kirby- Bauer. 5. Khảo sát khả năng sản xuất carbapenemase của các chủng P. aeruginosa phân lập được bằng thử nghiệm Hodge test. 6. Xác định một số gen kháng thuốc chính của P. aeruginosa bằng PCR. Sơ đồ 2.1. Phương pháp nghiên cứu tính kháng kháng sinh của P. aeruginosa 2.3.2.1.Nuôi cấy vi khuẩn từ bệnh phẩm: đàm, mủ, máu, dịch não tủy, nước tiểu Mẫu bệnh phẩm (Đàm, mủ, máu, dịch não tủy, nước tiểu) Phân lập định danh tác nhân P. aeruginosa theo quy trình của viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh đạt chuẩn ISO 15189:2007 Thử nghiệm kháng sinh đồ Đọc và phân tích kết quả kháng sinh theo tiêu chuẩn CLSI 2014 Bảo quản chủng ở -200C PCR phát hiện gene mã hóa cho khả năng sản xuất carbapenemase Thử nghiệm Hodge test để sàng lọc nhanh các chủng có khả năng sản xuất enzyme carbapenemase 49 Bệnh phẩm Máu Cấy vào chai cấy máu VK không mọc Theo dõi trong 24h-48h-10 ngày Cấy sang thạch CA, CO Ủ 350±20/24-48h Vi khuẩn mọc Âm tính VK không mọc Dịch não tủy Nhuộm Gram Tăng sinh BHI Thạch CA Soi tươi, nhuộm mực tàu, nhuộm Ziehl-Nelson Ủ 350±20/24-48h Ủ tủ CO2 350±20/24-48h Đàm Nhuộm Gram Xác định: Hồng cầu, Bạch cầu đơn, đa nhân, nấm men, sợi tơ nấm, Cocci Gr+, Diplococci Gr+, Diplococci Gr-, Bacille Gr+, Bacille Gr- Cấy sang thạch CO Hút 10μl vào ống EP 10ml Cấy sang thạch CA (cấy hình sao) Ủ 350±20/24-48h Xác định: Hồng cầu, Bạch cầu đơn, đa nhân, nấm men, sợi tơ nấm, Cocci Gr+, Diplococci Gr+, Diplococci Gr-, Bacille Gr+, Bacille Gr- Ủ tủ CO2 350±20/24-48h Mủ Nhuộm Gram Tăng sinh BHI Thạch CO Thạch CO Tăng sinh BHI Thạch CA Ủ 350±20/24-48h Ủ tủ CO2 350±20/24-48h Nhuộm Gram Nhuộm Gram Nước tiểu Ly tâm lấy cặn Cấy vào thạch PCP (hình sao) Soi tươi Nhuộm Gram -Biện luận kết quả (kết hợp kết quả nhuộm Gram ban đầu). -Thử nghiệm sinh hóa. -Ngưng kết kháng huyết thanh. - Thực hiện kháng sinh đồ. Nhuộm Gram Nhuộm Gram Nhuộm Gram -Quan sát hình thể VK. -Cấy sang thạch CA và CO ủ ở 350±20/24-48h. Sơ đồ 2.2: Quy trình nuôi cấy phân lập P.aeruginosa trong mẫu máu, đàm, dịch não tủy, mủ, nước tiểu Cấy Cấy Pha loãng tỷ lệ ½ trong nước muối sinh lý. Ủ 350±20/24-48h 50 a. Bệnh phẩm đàm Dùng tăm bông hay pipette Pasteur lấy một ít đàm trải đều thành một phết 2x3cm trên một tấm lame, để khô tự nhiên, sau đó gắn nhẹ trên lửa và thực hiện nhuộm Gram. Đánh giá mẫu đàm đạt độ tin cậy để cấy theo thang điểm Barlett. Thang điểm đánh giá là cộng tất cả các điểm rồi đánh giá như sau:  Điểm ≤ 0 không tin cậy để cấy mẫu.  1 ≤ Điểm ≤2 tin cậy vừa.  Điểm ≥3 rất đáng tin cậy. Tiến hành cấy khi mẫu được đánh giá hoàn toàn tin cậy. Riêng mẫu có độ tin cậy vừa, có thể yêu cầu lấy mẫu lại hay cũng có thể tiến hành nuôi cấy nhưng phải lấy được mẫu là vùng đàm mủ, tránh lấy nhớt hay nước bọt để nuôi cấy. - Dùng tăm bông lấy đàm cấy vào ống thạch Sabouraud+Chloramphenicol để tìm nấm. - Làm lỏng đàm bằng nước muối sinh lý theo tỷ lệ đàm/nước muối = 1/1. Dùng máy vortex trộn đều đàm và nước muối sinh lý. Lấy 10µl cấy 3 chiều trên thạch máu, ủ ở 35±20C/24h. - Lấy 10µl mẫu bệnh phẩm đã pha loãng 1 2� ở trên để pha loãng vào ống nước muối sinh lý 10ml, vortex đều. Sau đó lấy10µl cấy hình sao (cấy đếm) trên thạch chocolate (CA), ủ trong tủ CO2 35±20C/24h. - Sau 24h, quan sát hình thái khuẩn lạc, số lượng khuẩn lạc ưu thế và xác định vi khuẩn gây bệnh. Công thức tính X(CFU/ml) = nx2x102x102 (n là số khuẩn lạc đếm được) 51 Nếu X≥ 105 CFU/ml thì tiến hành làm kháng sinh đồ. Bảng 2.2. Thang điểm Barlett dùng đánh giá mẫu đàm Tính chất đại/vi thể Điểm Mẫu đàm 10-25 bạch cầu >25 bạch cầu Nhầy, mủ, mủ nhầy 10-25 tế bào vẩy >25 tế bào vẩy +1 +2 +1 -1 -2 Mẫu đàm hút qua mũi, nội soi phế quản 10-25 tế bào bạch cầu >25 tế bào bạch cầu Tế bào trụ 10-25 tế bào vẩy >25 tế bào vẩy +1 +2 +1 -1 -2 b. Bệnh phẩm là máu - Máu bệnh nhân được lấy và cấy trực tiếp vào chai cấy máu (sử dụng chai cấy máu 2 phase của công ty Nam Khoa). Máu được cấy với tỷ lệ 1 phần máu/10 phần canh thang, trong canh thang Trypticase soy có bổ sung 5% máu cừu hoặc máu động vật khác và 0,025% SPS (Sodium polyanethole sulfonate, là chất chống tạo áo máu và làm giảm tác dụng của các chất ức chế vi khuẩn có trong máu bệnh nhân), ủ 35±20C/24h. Khi có dấu hiệu dương tính trong chai cấy máu, ta tiến hành đồng thời: + Quan sát hình thái khuẩn lạc, thử nghiệm sinh hóa để định danh và làm kháng sinh đồ. 52 + Cấy chuyển lên môi trường thạch máu và thạch chocolate, ủ ở điều kiện 35±20C/24h (CA ủ trong tủ CO2). c. Bệnh phẩm là mủ - Tiến hành cấy vào BHI để tăng sinh vi khuẩn, cấy 3 chiều lên thạch chocolate (CA) và thạch máu (CO) để thu khuẩn lạc riêng rẽ, cấy lên Sabouraud+Chloramphenicol để tìm nấm. Ủ ở điều kiện 35±20C/24h (riêng CA ủ trong tủ CO2). Cuối cùng dùng tăm bông lấy mủ phết lên lame và thực hiện nhuộm Gram. - Quan sát hình thái khuẩn lạc, thử nghiệm sinh hóa để định danh và làm kháng sinh đồ với vi khuẩn gây bệnh. d. Bệnh phẩm là nước tiểu - Trộn đều nước tiểu rồi nhỏ một giọt trực tiếp lên lame 1 để soi tươi và nhỏ 1 giọt lên lame 2 chờ khô tự nhiên rồi nhuộm Gram. Nếu có ít nhất một tế bào vi khuẩn và/hay bạch cầu hiện diện trên một quang trường, có thể nghi ngờ bệnh nhân bị nhiễm trùng nước tiểu. Nếu toàn phết nhuộm không phát hiện được tế bào vi khuẩn hay bạch cầu nào, thì bệnh nhân chắc chắn không bị nhiễm trùng nước tiểu. - Dùng vòng cấy định lượng 10µl, lấy đầy một vòng cấy nước tiểu, trải toàn bộ lên bề mặt hộp thạch BCP (cấy hình sao), ủ ở điều kiện 35±20C/24h. - Sau 24h ủ thạch, đọc kết quả bằng cách đếm khúm trùng để biết số lượng vi khuẩn trong mẫu cấy ban đầu, suy ra toàn bộ số lượng vi khuẩn sống (UFU) trong 1ml nước tiểu. Nếu có: Công thức tính: X(CFU/ml) = nx102 (n là số khuẩn lạc đếm được)  X ≤ 104 CFU/ml nước tiểu, không có nhiễm trùng tiểu. 53  X ≥105CFU/ml nước tiểu, chắc chắn có nhiễm trùng tiểu.  104 ≤ X ≤ 105CFU/ml nước tiểu, nghi ngờ nhiễm trùng nước tiểu. Trong trường hợp này, nếu bệnh nhân có dấu hiệu lâm sàng chắc chắn bị nhiễm trùng tiểu tái phát nhiều lần, có thể định danh vi khuẩn phân lập được và làm kháng sinh đồ. e. Bệnh phẩm dịch não tủy - Dùng kim tiêm hoặc pipette nhựa vô trùng hút dịch não tủy cho vào môi trường tăng sinh BHI, nhỏ 2 giọt lên thạch máu và 2 giọt lên thạch chocolate, trong đó 1 giọt sẽ ria ra và 1 giọt để nguyên. Đến khi dung dịch trên mặt thạch đã khô đem ủ ở điều kiện 35±20C/24h (ủ trong tủ CO2 với CA). Cấy lên thạch Sabouraud+Chloramphenicol để tìm nấm. Nhỏ giọt dịch vào buồng đếm để đếm số lượng hồng cầu, bạch cầu. - Dịch não tủy được ly tâm, lấy cặn cho lên 3 lame để tiến hành: nhuộm Gram tìm tất cả cầu khuẩn và trực khuẩn hiện diện trong bệnh phẩm, nhuộm mực tàu tìm nấm Cryptococcus neoformans và nhuộm Ziehl-Nelson tìm trực khuẩn kháng acid - cồn (vi khuẩn Lao). - Sau 24h, khuẩn lạc hình thành trên đĩa thạch ở vị trí có ria và cả vị trí giọt dịch không ria thì khẳng định bệnh nhân bị nhiễm khuẩn. Quan sát hình thái vi khuẩn, tiến hành các test sinh hóa định danh và làm kháng sinh đồ. 2.3.2.2. Định danh Pseudomonas aeruginosa Tất cả các mẫu bệnh phẩm, sau khi cấy lên thạch, ủ 35±20C/24h. Nếu có khuẩn lạc hình thành thì bước tiếp theo là định danh và làm kháng sinh đồ. a. Quan sát hình thái 54 Dựa vào kết quả nhuộm Gram ban đầu và hình thái khuẩn lạc mọc trên các đĩa môi trường nuôi cấy. Trên môi trường thạch máu (CO) và thạch chocolate (CA), khuẩn lạc P. aeruginosa có đường kính từ 1- 5mm, khuẩn lạc có bờ mặt nhăn nheo, bờ trải dẹt, giữa lồi lên như quả trứng rán, sinh sắc tố màu xanh và có mùi thơm, trên môi trường thạch máu (CO) khuẩn lạc có thể gây tan huyết hoặc không. Hình 2.1. Khuẩn lạc P. aeruginosa trên môi trường thạch máu Hình 2.2. Khuẩn lạc P. aeruginosa trên môi trường thạch chocolate Nhuộm Gram kiểm tra lại hình dạng vi khuẩn từ các khuẩn lạc đặc trưng phát triển trên môi trường. Hình thái P. aeruginosa trên phết nhuộm Gram có dạng trực khuẩn, bắt màu hồng với thuốc nhuộm. 55 b. Thử nghiệm sinh hóa định danh P. aeruginosa Sau khi quan sát khuẩn lạc và hình dạng vi khuẩn được nhuộm Gram. Nếu nghi ngờ là P. aeruginosa cần tiến hành các bước tiếp theo.  Thử nghiệm catalase Mục đích: phát hiện các vi sinh vật có hệ enzyme catalase Cơ sở hóa sinh: Catalase hiện diện ở các vi sinh vật hiếu khí và kị khí tùy ý H2O2 H2O + O2 (bọt khí) Tiến hành: lấy tube 10ml đã tiệt trùng, cho vào tube khoảng 2-4ml dung dịch hydrogen peroxide (H2O2 3%), sử dụng pipette Pasteur lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc đặc trưng nghi ngờ, đặt đầu pipette có vi khuẩn vào H2O2. Quan sát sự sủi bọt sau 1 – 2 giây. Thử nghiệm được tiến hành đồng thời với khuẩn lạc Staphylococcus aureus để làm chứng dương. Kết quả: Có hiện tượng sủi bọt: phản ứng dương (+). Không có hiện tượng sủi bọt: phản ứng âm (-). Pseudomonadaceae cho kết quả dương tính (+).  Thử nghiệm oxidase Mục đích: phát hiện vi sinh vật có hệ enzyme oxidase (hệ cytochrom C) Cơ sở hóa sinh: Cytochrom C khử + H+ + O2 Cytochrom C ôxi hóa + H2O Cytochrom C ôxi hóa + TMPD khử TMPD ôxi (màu xanh tím). Catalase 56 Oxidase (+) Thuốc thử: TMPD (0,1%) N,N,N’,N’-tetramethyl-p-phenylenediamine. Thực hiện: thuốc thử đã được đặt thử trong thanh giấy lọc (Bio-Rad). Lấy pipette Pasteur gặt một khuẩn lạc nghi ngờ và quệt lên thanh giấy đã được tẩm thuốc thử oxidase. Thử ngiệm được tiến hành đồng thời với Moraxella làm chứng dương. Đọc kết quả trong 30 giây đến 1 phút. Kết quả: Phản ứng (+): vùng giấy được quệt vi khuẩn chuyển màu tím tía. Phản ứng (-): vùng giấy được quệt vi khuẩn không đổi màu. Pseudomonadaceae cho kết quả (+) Hình 2.3. Thử nghiệm oxidase  Định danh P. aeruginosa bằng API 20E hoặc API 20NE Mục đích: xác định loài của Pseudomonadaceae Thực hiện: lấy ống nước muối sinh lý 2ml, kiểm tra McFarland trước khi cho vi khuẩn vào. Dùng que cấy gặt khuẩn lạc riêng lẻ từ đĩa môi trường nuôi cấy cho vào ống nước muối sinh lý, vortex tạo dịch huyền phù vi khuẩn đồng nhất có độ đục đạt 0,5 McFarland. Dùng pipette nhựa hút dịch huyền phù vi khuẩn nhỏ lần lượt vào Oxidase (-) 57 các giếng. Các giếng ADH, LDC, ODC, URE, H2S thì nhỏ thêm paraffin vào miệng giếng. Kết quả: đọc kết quả theo hướng dẫn của nhà sản xuất, kết hợp với phần mềm API Wep (đọc kết quả API 20E hoặc API 20NE) do nhà sản xuất cung cấp và các thử nghiệm bổ sung. (phụ lục) Hình 2.4. Kết quả API 20E của P. aeruginosa sau 24h 2.3.2.3. Làm kháng sinh đồ theo phương pháp Kirby – Bauer a. Mục đích: Đánh giá tính nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh để giúp cho các thầy thuốc lựa chọn các thuốc kháng sinh phù hợp cho bệnh nhân. Ngoài ra, đánh giá về tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn, qua đó sẽ đưa ra các biện pháp nhằm khống chế và ngăn chặn sự lây lan của vi khuẩn kháng thuốc trong bệnh viện và cộng đồng. b. Nguyên lý: Kháng sinh ở trong khoanh giấy sẽ khuếch tán vào thạch Meuler- Hinton (MH) có chứa các chủng vi khuẩn thử nghiệm và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh được biểu hiện bằng đường kính các vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh. c. Phương pháp thực hiện: Các bước tiến hành 58 Sơ đồ 2.3. Quy trình thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh bằng kỹ thuật khoanh giấy khuếch tán kháng sinh trên mặt thạch Phân lập vi khuẩn P. aeruginosa từ bệnh phẩm Tạo dịch huyền phù vi khuẩn trong ống EP 2ml tương đương 0,5 McFarland (nồng độ108 CFU/ml) Điều chỉnh độ đục vi khuẩn: hút 0,1ml cho vào ống EP 10 (nồng độ106 CFU/ml) Láng vi khuẩn lên đĩa thạch MH và đợi khô mặt thạch Đặt khoanh giấy kháng sinh Đo vòng vô khuẩn Đọc và phân tích kết quả 59 - Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn có độ đục 0,5 McFarland: dùng que cấy lấy khoảng 2 khuẩn lạc cho vào ống nước muối sinh lý 2ml, vortex, đo độ đục McFarland bằng máy đo độ đục. Điều chỉnh cho đến khi độ đục vi khuẩn đạt 0,5 McFarland (có nồng độ 108 CFU/ml). Pha loãng 100 lần từ huyền dịch 0,5 McFarland trên để được huyền dịch nồng độ 106 CFU/ml. - Láng vi khuẩn lên đĩa thạch: Sử dụng huyền dịch nồng độ 106 CFU/ml (trong vòng 15 phút) láng đều lên mặt thạch Mueller-Hinton (MH). Hút huyền dịch thừa bỏ đi. Để khô mặt các đĩa thạch bằng cách đặt vào trong tủ ấm 15 phút trước khi đặt kháng sinh. - Đặt khoanh giấy kháng sinh: Lấy khoanh giấy kháng sinh ra khỏi tủ lạnh hoặc tủ âm, không được mở nắp, để ở nhiệt độ phòng khoảng 1 giờ để ổn định và làm giảm hơi nước tích tụ trên khoanh giấy kháng sinh. Trong vòng 15 phút sau khi láng vi khuẩn lên đĩa thạch, sử dụng dụng cụ để đặt kháng sinh (Disk-dispensing apparatus) để phân phối kháng sinh lên đĩa thạch (mỗi đĩa đặt 7 khoanh giấy kháng sinh). Để các đĩa thạch ở nhiệt độ phòng trong vòng 30 phút cho kháng sinh từ các khoanh giấy khuếch tán trên măt thạch. Lật ngược các đĩa thạch và ủ ở điều kiện 35±20C/16-18h. - Đọc kết quả và phân tích kết quả: dùng thước kẹp đo và ghi lại kích thước vòng vô khuẩn. So sánh kích thước vòng vô khuẩn của chủng thử nghiệm với vòng ức chế chuẩn theo tiêu chuẩn CLSI 2014, sau đó ghi lại kết quả của từng loại kháng sinh được thử nghiệm như là: nhạy cảm (S), trung bình (I) và kháng (R) 60 Hình 2.5. Đĩa kết quả kháng sinh đồ của P. aeruginosa Nếu có hiện tượng khuẩn lạc mọc trong vòng ức chế thì đây có thể xuất hiện sự thay đổi tính kháng của vi khuẩn hoặc do các huyền dịch vi khuẩn bị nhiễm. Các khuẩn lạc này nên được nuôi cấy, phân lập và thử nghiệm lại tính nhạy cảm với kháng sinh. 2.2.2.4. Thử nghiệm khả năng sản xuất carbapenemase bằng Hodge test Mục đích: Khảo sát khả năng sản xuất carbapenemase của P. aeruginosa. Chúng tôi tiến hành đồng thời và so sánh kết quả của hai phương pháp: Phương pháp Hodge test truyền thống và phương pháp Hodge test có bổ sung 10µl ZnSO4 (0,5M) vào đĩa kháng sinh Ertapenem 10µg [14], [34], [44]. Quy trình tiến hành - Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn E. coli ATCC 25922 (chủng chỉ định) trong nước muối độ đục 0.5 McFarland (pha loãng trực tiếp từ khuẩn lạc hoặc qua tăng sinh), sau đó pha loãng 1:10 trong nước muối. Láng huyền dịch vi khuẩn E. coli đã pha loãng 1:10 trên đĩa MH như phương pháp kháng sinh đồ thường quy. Để đĩa khô tự nhiên 3 đến 10 phút. Đối với phương pháp Hodge test truyền thống tiến hành đặt khoanh giấy Ertapenem 10µg trên đĩa. Đối với phương pháp Hodge 61 test có bổ sung ZnSO4, tiến hành dùng pipetman hút 10µl ZnSO4 (0,5M) nhỏ vào đĩa kháng sinh sau khi đã đặt lên đĩa thạch [34], [38], [39], [42]. - Tạo đường cấy vi khuẩn P. aeruginosa: Sử dụng đầu que cấy tròn (vòng đầu que cấy có thể tích 10-μl) hoặc tăm bông, nhặt 3–5 khuẩn lạc cần thử nghiệm vạch một đường thẳng từ mép của khoanh giấy kháng sinh tới mép của đĩa petri. Đường cấy có đường kính ít nhất 20–25 mm, sử dụng chủng K. pneumonia có kết quả Hogde test dương làm đối chứng. - Ủ qua đêm ở 350 C ± 20 C trong 16-24 giờ. Đọc kết quả. - Kết quả : Sau khi ủ tăng sinh trên MH, khảo sát sự tăng sinh (biểu hiện bằng các khuẩn lạc tạo thành hình lan quạt) tại vùng giao thoa giữa vệt cấy và chu vi vùng ức chế của chủng chỉ định (E. coli ATCC 25922) - Có tăng sinh = carbapenemase dương tính. - Không tăng sinh = carbapenemase âm tính. Hình 2.6. Thử nghiệm Hodge test 1. K. pneumonia ATCC BAA 1705 kết quả dương tính 2. K. pneumonia ATCC BAA 1706 kết quả âm tính 3. Chủng lâm sàng, kết quả dương tính. Vùng ức chế E. coli ATCC 25922 bằng ertapenem Có tăng sinh E. coli ATCC 25922. K. pneumonia ATCC BAA 1705 sinh carbapenemase gây bất hoạt ertapenem trong môi trường. Do đó không đủ carbapenemase để ức chế E. coli ATCC 25922, tạo hình lan quạt. E. coli ATCC 25922 62 2.3.2.5. Giữ chủng Sau khi định danh đến loài, môi trường LB (20% glycerol) được sử dụng để giữ chủng, ống giữ chủng được bảo quản ở tủ lạnh -200C. Chủng được lưu giữ để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo. 2.3.2.6. Phương pháp PCR phát hiện gene mã hóa cho enzyme carbapenemase Mục đích: phát hiện một số gene mã hóa cho enzyme carbapenemase của P. aeruginosa. Nguyên tắc: sử dụng đoạn mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn gene mã hóa enzyme kháng kháng sinh của vi khuẩn. Quá trình này được lặp lại nhiều lần để tổng hợp hàng triệu bản sao của đoạn gene từ một vài phân tử ADN ban đầu, qua đó có thể phát hiện được các đoạn gene dưới đèn UV sau khi điện di. Tiến hành:  Tách chiết ADN: sử dụng quy trình tách chiết bằng nhiệt - Các chủng được lấy ra từ tủ -200C, được cấy lên đĩa TSA ủ ở điều kiện 35±20C/24h. - Cho 1ml Tris HCl 10mM (pH=8) vào ống Microtube có ghi nhãn. - Lấy khuẩn lạc vi khuẩn mọc trên môi trường TSA sau 24 – 48h bằng tăm bông vô trùng, hòa vào dung dịch Tris HCl, vortex dung dịch huyền phù vi khuẩn đạt độ đục 3,0 McFarland. - Đặt Microtube vào máy ủ lắc nhiệt Thermo-Shaker TS 100 (1000C trong 10 phút). - Microtube chứa ADN vi khuẩn được lưu trữ ở nhiệt độ -200C để tiến hành cho phản ứng PCR. 63  Pha primer - Primer dạng bột khô được cộng thêm 1 lượng TE 1x phù hợp, để đạt nồng độ 100µM (theo hướng dẫn của nhà sản xuất). - Nồng độ mồi trong PCR là 25µM: hút 25µl primer 100µM + 75 µl H2O