Luận văn Nâng cao khả năng sinh tổng hợp và tinh sạch hoạt chất acarbose từ chủng actinoplanes sp. kctc 9161

chọn được chủng cho khả năng sinh tổng hợp acarbose cao. Kết quả từ 12 chủng Actinoplanes sp. nghiên cứu đã lựa chọn được 6 chủng sinh tổng hợp acarbose cao dựa trên sắc ký đồ TLC và hoạt tính ức chế α-glucosidase. Môi trường thích hợp cho lên men sinh tổng hợp acarbose chủng Actinoplanes sp. gồm (g/l): 30 glucose, 30 maltose, 10 bột ngô, 20 bột đậu tương, 1 monosodium glutamate, 2 CaCl2, 0,5 FeSO4, 1 K2HPO4 và 2,5 CaCO3, pH 7,2. Chủng Actinoplanes sp. sinh tổng hợp acarbose cao nhất sau 144 giờ nuôi cấy, ở 28°C. Chủng Actinoplanes sp. VTCC-A1094 và VTCC-A1779 có hoạt tính ức chế α-glucosidase cao nhất lần lượt là 92% và 81% (Đỗ Thị Tuyên, et al., 2011). Quyền Đình Thi và cs (2011) đã tiến hành nâng cao sinh tổng hợp acarbose từ các dòng đột biến Actinoplanes sp. VTCC-A1779. Kết quả cho thấy, từ 60 dòng đột biến, đã chọn được 6 dòng sinh tổng hợp acarbose cao hơn chủng gốc và 6 dòng có hoạt tính ức chế α-glucosidase trên 60%. Trong đó 2 dòng sinh tổng hợp acarbose cao nhất là dòng 37 (đột biến nồng độ NTG 0,3 M, 120 phút) ức chế 68% hoạt tính α-glucosidase và dòng 43 (ở nồng độ NTG 0,3 M, 120 phút) ức chế 63% hoạt tính α-glucosidase cao hơn 3 lần so với chủng gốc (Quyền Đình Thi, et al., 2012). Hà Thị Tâm Tiến và cs (2013) đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản đến sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp. VTCC-A1779 và các biến thể. Kết quả cho thấy, nhiệt độ bảo quản ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển và hiệu suất sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp. VTCC-A1779 và 2 dòng đột biến A242, A313. Các chủng dòng Actinoplanes sp. sinh trưởng tốt nhất và ổn định nhất khi bảo quản ở -80°C. Sinh tổng hợp acarbose đều ổn định sau khi bảo quản ở 4°C, -20°C, với hoạt tính ức chế α-glucosidase ổn định so với chủng gốc (Hà Thị Tâm Tiến, et al., 2013). Nguyễn Thị Nương và cs (2013) khi tối ưu thành phần môi trường lên men sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 cho thấy: Môi trường thích hợp cho lên men sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 bao gồm (g/l): 30 maltose, 30 glucose, 10 bột ngô, 1 sodium glutamate, 2 CaCl2, 0,5 FeCl3, 1 K2HPO4, 2,5 CaCO3, pH = 7,0. Thời gian thích hợp cho sinh tổng hợp acarbose cao ở 168 giờ, 28°C với tốc độ lắc 200 vòng/phút. Chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 cho hoạt tính ức chế α-glucosidase cao nhất đạt 52,24% trong môi trường lên men MT1 (Nguyễn Thị Nương, et al., 2013). VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu và hóa chất Chủng giống Chủng xạ khuẩn Actinoplanes sp. KCTC 9161 sinh tổng hợp acarbose cao, do Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật Hàn Quốc cung cấp. Hóa chất Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết như: acarbose chuẩn, p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG), enzyme α-glucosidase, nitrosoguanidine (NTG) (Sigma), NaCl, K2HPO4, KH2PO4.3H2O, Na2CO3, Na2HPO4, NaH2PO4, MgSO4, KCl, CaCl2, CaCO3, peptone, glycerol (Merck), maltose (Ấn Độ), glucose, ethanol, ethyl acetate, methanol, acid fomic, H2SO4, (Trung Quốc), bột ngô, bột đậu tương, thạch, monosodium glutamate (Việt Nam)... Hạt sắc ký: silica gel 60 kích thước hạt 0,06 - 0,2 mm dạng SiO2, sephadex G100 kích thước 40-120 μm (Sigma), amberlite IRA400 dạng Cl- (Sigma), amberlite XAD 1600T, amberlite IRA67 (Sigma), DEAE-sepharose (Sweden), than hoạt tính (Việt Nam), bản sắc ký lớp mỏng silica gel 60 F254 (Merck). Môi trường Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu được pha theo bảng 2.1. Bảng 2.1. Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật Tên môi trường Thành phần (g/l) Môi trường thạch 20 glucose, 5 peptone, 1 K2HPO4, 0,5 MgSO4, 0,5 KCl, 20 thạch. Môi trường nhân giống 20 glucose, 5 peptone, 1 K2HPO4, 0,5 MgSO4, 0,5 KCl. Môi trường lên men MT1 (Quyền Đình Thi, et al., 2012) 30 maltose, 30 glucose, 10 bột ngô, 2,0 CaCl2, 1,0 monosodium glutamate, 2,5 CaCO3, 1,0 K2HPO4. Môi trường lên men MT2 (Đỗ Thị Tuyên, et al., 2011) 30 maltose, 10 bột ngô, 1,0 monosodium glutamate, 2,0 CaCl2, 2,5 CaCO3, 1,0 K2HPO4. Môi trường lên men MT3 (Nhà cung cấp giống KCTC) 30 sucrose, 0,1 casein, 0,2 peptone, 2,0 CaCl2, 2,5 CaCO3, 1,0 K2HPO4. Môi trường lên men MT4 (Wang, et al., 2011) 43 maltose, 40 glucose, 17 bột đậu tương, 5,0 monosodium glutamate, 5,0 glycerol, 2,0 CaCl2, 2,5 CaCO3, 1,0 K2HPO4. Môi trường lên men MT5 (Sun, et al., 2012) 50 maltose, 30 glucose, 17 bột đậu tương, 5,0 monosodium glutamate, 5,0 glycerol, 2,0 CaCl2, 2,5 CaCO3, 1,0 K2HPO4. Thiết bị thí nghiệm Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu thuộc phòng Công nghệ sinh học enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam theo bảng 2.2. Bảng 2.2. Danh sách các thiết bị thí nghiệm được sử dụng Tên thiết bị Xuất xứ Box cấy vi sinh vật Clean Bench TCV.02-1 Việt Nam Cân phân tích BL 150S Sartorius (Đức) Máy đo pH HI 2211 Hanna (Rumani) Máy lắc rung ProvocellPM Esco (Mỹ) Máy ly tâm lạnh to CF16RXII Hitachi (Nhật) Máy li tâm lạnh Hettich Mikro 22R Hettich (Đức) Máy nuôi lắc Certomat® HK Sartorius (Đức) Hệ thống máy Elisa Bioteck (Mỹ) Tủ sấy (Trung Quốc) Nồi khử trùng ES-315 Tomy (Nhật) Tủ lạnh 4oC GR-N45VTV Toshiba (Nhật) Tủ lạnh sâu -20oC VCF-280 Deawoo (Hàn Quốc) Phương pháp nghiên cứu Lên men chìm nuôi cấy vi sinh vật Chủng giống xạ khuẩn Actinoplanes sp. KCTC 9161 được hoạt hóa trên môi trường thạch, sau 4 ngày xuất hiện các khuẩn lạc màu cam. Một khuẩn lạc riêng rẽ được nuôi vào bình 100 ml chứa 25 ml môi trường nhân giống. Sau 96 giờ được tiếp chuyển sang bình 1000 ml chứa 250 ml môi trường lên men theo các công thức thí nghiệm tối ưu (Wei, et al., 2010). Lựa chọn môi trường lên men sinh tổng hợp acarbose của chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 Chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 được nuôi nhân giống sau 96 giờ, tiếp 10% dịch nhân giống vào mỗi bình 1000 ml chứa 250 ml môi trường lên men MT1, MT2, MT3, MT4, MT5 với các thành phần như bảng 2.3. Chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 được nuôi lên men sinh tổng hợp acarbose trong điều kiện 28oC, 200 vòng/phút trong 144 giờ. Bảng 2.3. Các môi trường khảo sát nghiên cứu Môi trường Thành phần môi trường (g/l) glucose maltose Sucrose BN BĐT casein glutamate peptone glycerol khoáng MT1 30 30 - 10 - - 1 - - + MT2 - 30 - 10 - - 1 - - + MT3 - - 30 - - 0,1 - 0,2 - + MT4 40 43 - - 17 - 5 - 5 + MT5 30 50 - - 17 - 5 - 5 + Ghi chú: -: không tham gia, +: có tham gia, MT: môi trường, BN: bột ngô, BĐT: bột đậu tương Sau khi chọn được môi trường thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp acarbose của chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161, nguồn cacbon và nitơ sẽ được bổ sung vào môi trường theo nồng độ khác nhau để chọn được nồng độ tối ưu. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy Chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 được nuôi trong môi trường lên men thích hợp đã chọn được ở mục 2.2.2 trong điều kiện 28oC, 200 vòng/phút để khảo sát khả năng sinh tổng hợp acarbose tăng dần theo thời gian nuôi cấy. Dải thời gian lựa chọn để nghiên cứu từ 24 đến 216 giờ với khoảng cách lấy mẫu là 24 giờ. Các chỉ tiêu đánh giá dựa trên sắc ký đồ TLC và hoạt tính ức chế α-glucosidase. Ảnh hưởng của nguồn carbon và nitrogen khi nuôi cấy Nguồn carbon và nitrogen không những ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng mà còn ảnh hưởng lớn đến năng suất sinh tổng hợp acarbose của chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161. Để xác định được môi trường tối ưu cho sinh tổng hợp acarbose các nồng độ maltose (20, 30, 40, 50 và 60 g/l), glucose (10, 20, 30, 40 và 50 g/l) và bột ngô (0, 5, 10, 15, 20 và 25 g/l) lần lượt được tối ưu trong điều kiện 28oC, 200 vòng/phút trong 192 giờ. Ảnh hưởng của tốc độ lắc, nhiệt độ và pH khi nuôi cấy Để xác định tốc độ lắc, nhiệt độ và pH nuôi cấy tối ưu, chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 được nuôi trong môi trường lên men trong 192 giờ ở các điều kiện nghiên cứu: tốc độ lắc 100, 150, 200 và 220 vòng/phút; nhiệt độ 25, 28, 30 và 37oC; pH 6,0; 6,5, 7,0; 7,5; 8,0 và 8,5 trong đó thông số tốt nhất của nghiên cứu trước sẽ được chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. Tốc độ lắc, nhiệt độ và pH tối ưu cho sinh tổng hợp acarbose cao được xác định dựa trên sắc ký đồ TLC và hoạt tính ức chế α-glucosidase. Gây đột biến bằng NTG N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) là một hóa chất gây ra đột biến điểm, làm biến đổi các base gây ra sự kết cặp sai. NTG sẽ alkyl hóa cả 4 loại nucleotide. Tuy nhiên, đột biến hầu như chỉ xảy ra khi nhóm alkyl được thêm vào ở oxy số 6 của guanine tạo ra O-6-alkylguanine. Sự alkyl hóa này dẫn đến sự kết cặp nhầm với thymine gây ra đột biến G-X thành A-T trong lần sao chép tiếp theo. Tiến hành: chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 được nuôi trên đĩa thạch ở 28oC trong 5 ngày. Bào tử hòa vào dung dịch 0,2% tween 20. Dịch bào tử được trộn với dung dịch NTG ở các nồng độ 5, 10, 15 và 20 µg/ml. Mỗi nồng độ đều được xử lý trong 30, 60 và 90 phút ủ 25oC, 300 vòng/phút. Dịch sau ủ, ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC. Thu cặn bào tử và tiếp tục rửa với 0,2% tween 20 lặp lại 4-5 lần. 200 µl dịch bào tử được trải trên mỗi đĩa thạch lặp lại 3 lần và nuôi ở 28oC, sau 5 ngày tính số khuẩn lạc mọc trên các đĩa. Nuôi lên men để kiểm tra khả năng sinh tổng hợp acarbose của các dòng đột biến (Quyền Đình Thi, et al., 2012). Sắc ký lớp mỏng TLC Nguyên lý: Sắc ký lớp mỏng bao gồm lớp gel mỏng tráng trên bề mặt kính hoặc nhôm, là pha cố định và hệ thống dung môi hay pha chuyển động được lựa chọn để tạo ra sự phân tách các chất phân tử nhỏ dựa trên sự cạnh tranh của chất tan và pha động để có được chỗ liên kết với pha tĩnh. Do đó, các chất có tính phân cực khác nhau sẽ di chuyển lên bản sắc ký với các tốc độ khác nhau và được tách ra ở các vị trí khác nhau (Phan Tuấn Nghĩa, 2012). Tiến hành: Dịch sau lên men được ly tâm 12000 vòng/phút, 15 phút. Dịch nổi chiết bằng dung môi ethanol theo tỷ lệ 1 mẫu : 4 dung môi trong thời gian 30 phút. Dịch chiết được ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, loại tủa, thu dịch nổi và kiểm tra hoạt chất acarbose trên sắc ký lớp mỏng. Bản sắc ký silica gel (Merck) 60 F254, dày 0,25 mm với pha động là hệ dung môi gồm 94% (ethyl acetate : methanol = 1:1) và 6% (nước : acid formic = 5:2). Các phân tử đường được phát hiện bằng xông hơi acid H2SO4 10% trong ethanol và hiện màu ở nhiệt độ 110oC trong 10 phút. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của hoạt chất acarbose Nguyên lý: α-glucosidase là enzyme cắt liên kết α-1,4. Cơ chất sử dụng là pNPG (Yamaki, Mori, 2006), pNPG khi bị α-glucosidase thủy phân sẽ sinh ra p-nitrophenyl có màu vàng và hấp thụ bước sóng 415 nm. Enzyme α-glucosidase sẽ bị ức chế một phần bởi hoạt chất acarbose trong mẫu thí nghiệm. Do đó, lượng p-nitrophenyl sinh ra sẽ ít hơn so với khi không có mặt acarbose. Tiến hành: Sử dụng khay vi thể 96 giếng, thí nghiệm được lặp lại 3 lần, có đối chứng, mỗi giếng gồm: 20 µl mẫu thí nghiệm (giếng đối chứng thay bằng 20 µl đệm potasium phosphate 0,5 M, pH 6,7), 50 µl emzyme α-glucosidase nồng độ 25 mg/ml, 50 µl cơ chất pNPG 3 mM và 120 µl đệm potasium phosphate 0,5 M, pH 6,7. Hỗn hợp được ủ ở 37oC trong 45 phút, sau đó thêm 50 µl Na2CO3 0,67 M vào mỗi giếng để dừng phản ứng. Hỗn hợp phản ứng được đo ở bước sóng 415 nm trên máy Elisa reader (Biotek, ELx800, USA). Một đơn vị α-glucosidase được định nghĩa như là lượng enzyme giải phóng 1 µmol của pNPG ở điều kiện thí nghiệm. Mức độ ức chế α-glucosidase được tính theo công thức: % Ức chế = A415 ĐC – A415 TN x 100 A415 ĐC Trong đó: A415ĐC và A415TN là giá trị OD mẫu đối chứng và mẫu thí nghiệm đo tại bước sóng 415 nm. Tách chiết và tinh sạch acarbose Tách chiết và tinh sạch sơ bộ Dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 sau 192 giờ được ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 15 phút để loại cặn tế bào, sau đó ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút để loại bỏ các chất không tan khác. Dịch nổi được tủa với ethanol theo tỷ lệ 1 mẫu: 4 ethanol (v/v) trong 30 phút, sau đó ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút. Dịch nổi thu được kiểm tra bằng TLC. Tinh sạch acarbose bằng sắc ký cột Sắc ký lọc gel sephadex G100 Cột sephadex G100 là cột phân tách hỗn hợp theo nguyên tắc lọc gel, các chất có kích thước khác nhau có thời gian đi qua hệ thống gel khác nhau. Gel sephadex G100 được ngâm với nước trước khi nhồi 24 giờ. Cột được cân bằng với đệm sodium phosphate 0,05 M, pH 7,5 trong 6 giờ. 10 ml mẫu được đưa lên cột và rửa chiết bằng đệm sodium phosphate 0,05 M, pH 7,5 thu các phân đoạn, mỗi phân đoạn 2 ml. Sắc ký cột hấp thụ silica gel Hạt silica gel được ngâm trong ethanol trước khi nhồi 24 giờ. Cột được cân bằng với dung môi ethanol trong 1 giờ, sau đó cho 10 ml mẫu dịch lên men lên cột và rửa chiết bằng dung môi ethanol thu các phân đoạn, mỗi phân đoạn 2 ml. Sắc ký trao đổi anion DEAE-sepharose Dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi anion giữa các ion trong mẫu với nhóm trao đổi ion (dimethylaminoethyl liên kết với polysaccharide polymer tích điện dương) của chất giá. Khi mẫu qua cột các ion tích điện âm sẽ gắn vào cột và sau đó được đẩy ra khỏi cột bằng dung dịch muối có chứa ion có ái lực mạnh hơn đối với nhóm trao đổi ion của chất giá. Gel DEAE-sepharose được nhồi lên cột và rửa với nước 4-6 giờ để loại hết cồn trong dịch bảo quản. Cột được cân bằng với đệm sodium phosphate 0,05 M, pH 6,9 trong 6 giờ. Đưa 10 ml mẫu lên cột và thu mẫu bằng dung dịch NaCl 0,1 M pha trong đệm sodium phosphate 0,05 M, thu các phân đoạn, mỗi phân đoạn 2 ml. Sắc ký trao đổi anion amberlite IRA400 Dựa trên phản ứng trao đổi ion giữa các ion trong mẫu với nhóm trao đổi ion polystyrene divinylbenzene của chất giá. Hạt amberlite IRA400 được ngâm hoạt hóa bằng HCl 5% trong 2 giờ trước khi nhồi lên cột, sau đó rửa cột bằng nước đến khi pH trong cột đạt 2. 10 ml mẫu được đưa lên cột và rửa bằng hỗn hợp dung môi methanol: nước = 4:1 (v/v) thu các phân đoạn, mỗi phân đoạn 2 ml. Sắc ký trao đổi anion amberlite IRA67 Amberlite IRA67 là chất trao đổi anion dạng base yếu dựa trên mạng acrylic của chất giá để trung hòa các chất acid mạnh. Hạt amberlite IRA67 được ngâm hoạt hóa bằng HCl 5% trong 2 giờ trước khi nhồi lên cột, sau đó rửa cột bằng nước đến khi pH trong cột đạt 7. 10 ml mẫu được đưa lên cột và rửa giải bằng nước để trung hòa dung dịch có chứa acarbose. Sắc ký trao đổi cation amberlite XAD 1600T Amberlite XAD 1600T là chất trao đổi cation dạng acid mạnh dựa trên mạng polystyrene. 10 ml mẫu được đưa lên cột và rửa cột bằng nước sau đó thu mẫu bằng hỗn hợp nước : acetone = 9:1 (v/v) (Hong, et al., 2003). Sắc ký cột hấp phụ than hoạt tính Dựa trên khả năng hấp phụ của than hoạt tính với các chất màu hay các loại đường khác nhau. Các chất hấp phụ yếu hơn sẽ bị loại ra trước với nồng độ dung môi thấp và ngược lại các chất hấp phụ mạnh sẽ được đẩy ra sau cùng nồng độ dung môi cao hơn. Tiến hành : 2,5 g than hoạt tính được đun cách thủy 1 giờ trước khi nhồi cột để đuổi hết các bọt khí có trong các hạt than, 50 ml dịch lên men ly tâm 4000 vòng/phút trong 20 phút để loại sinh khối tế bào, sau đó hấp phụ vào than hoạt tính trong điều kiện pH 2-3, khuấy nhẹ 1 giờ và để ở 4oC trong 12 giờ. Hỗn hợp được rửa với 200 ml nước cất 3 đến 5 lần. Dịch than có chứa acarbose được nhồi lên cột và giải hấp phụ acarbose bằng ethanol theo gradien nồng độ từ 0% đến 20% trong đó rửa bằng 20 ml ethanol 5%, 40 ml ethanol 10 %, 100 ml ethanol 15% và 20 ml ethanol 20%. Các phân đoạn thu được TLC để kiểm tra khả năng tinh sạch acarbose. Sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Hàm lượng acarbose được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC). HPLC là quá trình tách một hỗn hợp chất trong cột sắc ký ở trạng thái lỏng. Các chất mẫu phân tích phải được hòa tan trong một chất lỏng phù hợp thường chính là pha động chạy sắc ký. Các mẫu dịch lên men được phân tích bằng hệ thống HPLC với hệ dung môi acetonitrile : nước = 3:1 (v/v), tốc độ dòng chảy 0,5 ml/phút, thời gian chạy 30 phút. Hàm lượng acarbose được xác định dựa trên sắc ký đồ HPLC của chuẩn acarbose tại nồng độ xác định. Sắc ký lỏng ghép khối phổ Dựa trên nguyên tắc mẫu nghiên cứu sau khi được tách chất trên hệ thống sắc ký lỏng các chất sẽ đi vào nguồn ion hóa, tại đây các chất sẽ được ion hóa, sau đó các ion sẽ được tách ra và phân mảnh qua một loạt các phân tích sẽ thu được sơ đồ phân mảnh ion. Dựa vào sơ đồ này kết hợp với ngân hàng giữ liệu các chất đã biết có thể xác định được khối lượng phân tử cũng như hàm lượng của chất cần nghiên cứu. Các mẫu dịch lên men và dịch tinh sạch được phân tích trên hệ thống HPLC ghép khối phổ. Hàm lượng acarbose được xác định dựa trên sắc ký khối phổ của chuẩn acarbose. Xác định cấu trúc phân tử acarbose bằng cộng hưởng từ hạt nhân Cấu trúc phân tử acarbose được xác định theo phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR). Dựa trên nguyên tắc spin hạt nhân dưới tác dụng của từ trường ngoài. NMR hoạt hóa spin hạt nhân khi nguyên tố có số proton hoặc neutron lẻ. Như vậy, 1H và 13C sẽ cho ta tín hiệu NMR. Trong phân tử tùy theo cấu trúc mà tần số cộng hưởng của proton (hay 13C) khác nhau. Tổng số các mũi cộng hưởng đó tạo thành phổ NMR của phân tử. Kết hợp với các số liệu thu được từ máy đo khối phổ sẽ cho phép xác định cấu trúc hóa học của chất cần nghiên cứu. Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu được tính toán theo phương pháp phân tích thống kê toán học. Quá trình xử lý số liệu được thực hiện trên máy tính với ứng dụng chương trình excel. Dùng hàm average để tính trung bình và hàm studv để phân tích sai số với ba lần lặp lại thí nghiệm. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Lựa chọn môi trường nuôi cấy Chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 được nuôi lên men sinh tổng hợp acarbose trong 5 loại môi trường khác nhau MT1, MT2, MT3, MT4 và MT5 (Bảng 2.3), nhằm lựa chọn một môi trường tốt nhất, có khả năng sinh tổng hợp acarbose cao thông qua các thông số như: sắc ký đồ TLC của hoạt chất acarbose và hoạt tính ức chế α-gluocsidase. Sắc ký đồ TLC của hoạt chất acarbose trong các môi trường lên men khác nhau được thể hiện trên hình 3.1. Dịch nuôi trong môi trường MT1, MT2, MT4, MT5 đều xuất hiện băng ngang chuẩn acarbose với hệ số Rf = 0,28 tương ứng với chuẩn acarbose. Trong đó, dịch nuôi trong môi trường MT1 có thành phần chứa maltose, glucose và bột ngô xuất hiện băng acarbose đậm (làn 1), môi trường MT2 thành phần chỉ có maltose và bột ngô, không có glucose băng acarbose xuất hiện mờ hơn môi trường MT1 (làn 2). 1 2 3 4 5 C Hình 3.1. Sắc ký đồ TLC các mẫu acarbose sinh tổng hợp từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 trong các môi trường lên men 1: MT1, 2: MT2, 3: MT3, 4: MT4, 5: MT5 Môi trường MT4 và MT5 thành phần có maltose, glucose và bột đậu tương với tỷ lệ khác nhau đều xuất hiện băng đậm acarbose, chỉ khác nhau ở các băng phụ, trong đó môi trường MT4 có nhiều glucose và ít maltose xuất hiện băng phụ đậm (làn 4) còn môi trường MT5 có ít glucose và nhiều maltose hơn thì có các băng phụ mờ hơn (làn 5). Trong 5 môi trường nghiên cứu chỉ có môi trường MT3 với thành phần không có glucose, maltose và bột ngô hay bột đậu tương mà thay vào đó là sucrose, casein và peptone không sinh tổng hợp acarbose, dịch nuôi không có băng ngang chuẩn acarbose trên sắc ký đồ (làn 3). Kết quả sinh tổng hợp acarbose của chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 trong các môi trường lên men còn được khẳng định bởi hoạt tính ức chế α-glucosidase của hoạt chất acarbose trong dịch lên men (Hình 3.2). Dịch lên men trong môi trường MT1, MT2, MT4, MT5 đều có hoạt tính ức chế α-glucosidase, trong đó dịch lên men trong môi trường MT1 có khả năng ức chế cao nhất đạt 52,2%, dịch lên men trong môi trường MT5 có khả năng ức chế đạt 51,0%, khả năng ức chế của dịch lên men môi trường MT4 đạt 46,6% và MT2 đạt 45,1%. Dịch lên men trong môi trường MT3 không có hoạt tính ức chế α-glucosidase. Kết quả về hoạt tính ức chế α-glucosidase phù hợp với kết quả TLC về khả năng sinh tổng hợp acarbose trong các môi trường lên men. Hình 3.2. Hoạt tính ức chế α-glucosidase trong các môi trường lên men Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với kết quả nghiên cứu trên chủng Actinoplanes sp. A56, maltose và dịch chiết ngô là hai yếu tố quan trọng có tác động đến sinh tổng hợp acarbose (Choi, Shin, 2003, Wang, et al., 2011, Wei, et al., 2010). Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu trên chủng Actinoplanes sp. VTCC-A1779 (Đỗ Thị Tuyên, et al., 2011). Trong 5 môi trường được khảo sát môi trường MT4 bao gồm các thành phần glucose, maltose, bột ngô, bột đậu tương, monosodium glutamate và khoáng chất cho khả năng sinh tổng hợp acarbose cao nhất từ chủng từ chủng Actinoplanes sp. VTCC-A1779 và VTCC-A1094. Từ những kết quả trên có thể nhận thấy, môi trường MT1 đã đáp ứng được mục tiêu lựa chọn, vừa đảm bảo cho quá trình sinh trưởng của chủng sinh tổng hợp acarbose cao, có hoạt tính ức chế α-glucosidase mạnh, đồng thời bảo đảm giá trị kinh tế bởi nguồn nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm. Vì vậy, môi trường MT1 được lựa chọn để khảo sát các điều kiện tối ưu chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 sinh tổng hợp acarbose. Tối ưu các thành phần môi trường và các điều kiện nuôi cấy Ảnh hưởng của thời gian Chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 được nuôi lên men trong môi trường MT1 bao gồm (g/l): 30 maltose, 30 glucose, 10 bột ngô, 1,0 monosodium glutamate, 2,0 CaCl2, 2,5 CaCO3, 1,0 K2HPO4 trong điều kiện 28oC, 200 vòng/phút trong 216 giờ, cứ 24 giờ lấy mẫu 1 lần để nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp acarbose. 1 2 3 4 5 6 7 8 C Hình 3.3. Sắc ký đồ TLC các mẫu acarbose sinh tổng hợp từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 theo thời gian 1: 48 giờ; 2: 72 giờ; 3: 96 giờ; 4: 120 giờ; 5: 144 giờ; 6: 168 giờ; 7: 192 giờ; 8: 216 giờ; C: chuẩn acarbose. Sắc ký đồ TLC hình 3.3 cho thấy, từ 48 đến 72 giờ nuôi lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 chưa sinh tổng hợp acarbose, chưa có vạch ngang chuẩn trên sắc ký đồ TLC (làn 1 và 2). Sau 96 giờ lên men (làn 3) acarbose bắt đầu được tổng hợp, xuất hiện băng mờ ngang chuẩn. Băng acarbose xuất hiện đậm dần theo thời gian. Dịch lên men cho băng acarbose đậm nhất tại 192 giờ và nhạt hơn sau 216 giờ, chứng tỏ acarbose được sinh tổng hợp nhiều nhất trong khoảng 192 giờ và càng để lâu acarbose sẽ bị chuyển hóa thành các chất khác. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của hoạt chất acarbose trong giai đoạn đầu của quá trình lên men từ 24 đến 72 giờ hầu như không có. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của acarbose trong dịch lên men tăng dần theo thời gian từ 18,6% sau 96 giờ lên đến 50,3% sau 168 giờ và đạt cao nhất tại 192 giờ ức chế 55,2%, sau đó hoạt tính lại giảm xuống 52,2% sau 216 giờ (Hình 3.4). Như vậy, thời gian thích hợp lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 là 192 giờ, hoạt chất acarbose được sinh tổng hợp nhiều nhất, thể hiện trên sắc ký đồ TLC có băng ngang chuẩn đậm nhất và hoạt tính ức chế α-glucosidase cao nhất (55,2%). Hình 3.4. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 theo thời gian. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với một số nghiên cứu trước đây, Sun và cs (2012) khi tối ưu các điều kiện nuôi cấy để tăng khả năng sinh tổng hợp acarbose từ chủng A. utahensis ZJB-08196, sau 192 giờ khả năng sinh tổng hợp acarbose cao nhất, đạt 6113 mg/l acarbose (Sun, et al., 2012). Thời gian thích hợp lên men chủng Actinoplanes sinh tổng hợp acarbose từ 144 đến 192 giờ (Li, et al., 2012, Wei, et al., 2010, Xue, et al., 2013). Ảnh hưởng của nguồn maltose Maltose không chỉ là nguồn carbon quan trọng cung cấp cho xạ khuẩn phát triển sinh tổng hợp acarbose trong môi trường lên men, maltose còn là đơn vị cấu thành trực tiếp trong phân tử acarbose. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, nồng độ maltose trong dịch nuôi cấy đóng vai trò quan trọng trong việc tăng khả năng sinh tổng hợp acarbose (Wang, et al., 2011, Wei, et al., 2010). Chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 được nuôi trong môi trường MT1 với các nồng độ matlose khảo sát từ 20, 30, 40, 50 và 60 g/l. Kết quả khảo sát cho thấy khả năng sinh tổng hợp acarbose tỷ lệ thuận với nồng độ maltose. Trên sắc ký đồ TLC (Hình 3.5a) cho thấy, trong tất cả các môi trường có nồng độ maltose khác nhau đều xuất hiện băng acarbose ngang với chuẩn có hệ số Rf = 0,28. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của acarbose trong các môi trường cũng tăng tỷ lệ thuận với nồng độ maltose từ 36,6% tại nồng độ 20 g/l maltose lên đến 51,9% tại nồng độ 50 g/l maltose. Tuy nhiên, khi nồng độ maltose cao (60 g/l) thì hoạt tính ức chế α-glucosidase lại giảm xuống chỉ còn 49,20% (Hình 3.5b). C 1 2 3 4 5 (a) (b) Hình 3.5. Sắc ký đồ TLC (a) và hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) về ảnh hưởng của nồng độ maltose đến khả năng sinh tổng hợp acarbose chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 1-5: nồng độ maltose từ 20 đến 60 g/l, C: chuẩn acarbose Như vậy nồng độ maltose thích hợp nhất cho sinh tổng hợp acarbose chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 trong điều kiện khảo sát là 50 g/l. Phần lớn các công trình nghiên cứu trên thế giới đều chỉ ra rằng maltose cần phải duy trì ở nồng độ cao trong suốt quá trình nuôi cấy sinh tổng hợp acarbose. Wei và cs (2010) khi lên men chủng Actinoplanes A56 trong môi trường có nồng độ maltose đạt 61,25 g/l, cho năng suất 1043 mg/l acarbose (Wei, et al., 2010). Lên men