Luận văn Nghiên cứu các đặc tính sinh học và tiềm năng ứng dụng của chủng vi khuẩn bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum sp 1901 phân lập tại rừng quốc gia Hoàng Liên

hompson và đồng tác giả (1994). Các trình tự tham khảo dùng trong nghiên cứu cây phát sinh chủng loại được lấy từ dữ liệu của DDBJ ( EMBL ( và GenBank ( Cây phát sinh được xây dựng theo Kimura (1980) sử dụng phương pháp của Saitou và Nei (1987). Đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn nghiên cứu 2.3.3.1. Nhiệt độ sinh trưởng thích hợp Chủng vi khuẩn được cấy zíc zắc vào các ống nghiệm có chứa môi trường NA thạch nghiêng, sau đó đặt các ống nghiệm này vào các máy ổn nhiệt ở dải nhiệt độ từ 15-70oC. Quan sát khả năng mọc sau 24 và 48 giờ. 2.3.3.2. pH sinh trưởng thích hợp Hút ra mỗi 100 µl môi trường đã nuôi cấy khởi động chủng vi khuẩn nghiên cứu vào các bình tam giác có chứa 100 ml môi trường NA dịch thể đã được đưa về pH tại các giá trị từ 2-9 ở 37oC. Sau 24 giờ tiến hành đo OD ở bước sóng 600 nm dịch nuôi cấy của tất cả các bình để so sánh tốc độ sinh trưởng. 2.3.3.3. Thử khả năng đồng hóa các nguồn đường Khả năng đồng hóa các loại đường khác nhau được thử nghiệm trên thanh thử API 50 CH (Biomerieux, Pháp) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Kết quả dương tính được ghi nhận sau 24 và 48 giờ ủ ở 37oC khi vi khuẩn có khả năng sinh trưởng và tạo thành một lớp huyền phù trong ống đường thí nghiệm. 2.3.3.4. Thử khả năng lên men các nguồn đường Khả năng lên men các loại đường khác nhau được thử nghiệm theo hướng dẫn của kit API 50 CHB (Biomerieux, Pháp). Trước khi tiến hành ủ ở 37oC, nhỏ dung dịch khoáng dầu lên các ống để tạo điều kiện kỵ khí cho vi khuẩn lên men. Kết quả lên men đường được đọc sau 24 và 48 giờ. Phản ứng dương tính khi các ống thử nghiệm chuyển từ màu đỏ sang vàng do vi khuẩn lên men đường và sản sinh axít hữu cơ làm thay đổi pH của môi trường. 2.3.3.5. Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào theo phương pháp thử trên bản thạch cơ chất Cấy zíc zắc chủng vi khuẩn thuần trên môi trường NA có chứa 0,1% cơ chất tinh bột tan, CMC, xylan, tributyrin, casein và natri phytate. Sau 4 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 37oC, hoạt tính của các loại enzyme được thử với các loại thuốc thử tương ứng (xem phụ lục C). 2.3.3.6. Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào theo kit API ZYM Theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Biomerieux, Pháp), hoạt tính enzyme được xác định dựa trên sự thay đổi màu sau khi ủ ở 37oC trong 4 giờ 30 phút. 2.3.3.7. Khả năng sinh kháng sinh theo phương pháp khuếch tán trên thạch Chủng vi khuẩn được cấy vạch trên môi trường thạch TSA, sau 30 giờ nuôi cấy ở 28oC, thỏi thạch nuôi cấy vi khuẩn được đục bằng ống kim loại và được chuyển sang môi trường NA đã cấy sẵn các vi khuẩn kiểm định là Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella sp., Shigella sp. và môi trường Czapeck đã cấy sẵn nấm kiểm định là Fusarium oxysporum. Hoạt tính kháng sinh được xác định dựa trên sự xuất hiện vòng ức chế xung quanh thỏi thạch. 2.3.3.8. Khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng indole-3-acetic axít Khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng indole-3-acetic axít (IAA) được xác định theo phương pháp của Gutierrez (2009) [30]. 25 ml môi trường NA dịch thể có bổ sung L-tryptophan (Merck, Đức) ở nồng độ 5 mM được dùng để nuôi cấy chủng vi khuẩn ở 37oC và 160 v/p. Cứ sau 24 giờ hút ra 1,5 ml dịch nuôi cấy vi khuẩn đem ly tâm ở 8.000 v/p trong10 phút để loại bỏ tế bào. 1 ml dịch sau ly tâm được trộn đều với 1 ml dung dịch Salkowski R1 sau đó đem ủ hỗn hợp dịch trong tối 30 phút. Hoạt tính IAA được xác định bằng cách đo OD dịch hỗn hợp ở bước sóng 535 nm. Ngoài ra, khả năng kích thích sinh trưởng của chủng SP 1901 được thử nghiệm trong quá trình sinh trưởng của cây ngô. Ngô giống được ươm mầm đồng loạt sau 3-4 ngày rồi chọn những cây giống có chiều cao bằng nhau. Bổ sung 0,2; 0,4; 0,8 và 1 ml môi trường nuôi cấy chủng SP 1901 có chứa L-tryptophan vào phần gốc của cây giống. Quan sát quá trình sinh trưởng của cây ngô và so sánh chiều cao với đối chứng. 2.3.3.9. Khả năng sống sót trong môi trường dịch dạ dày nhân tạo Hút 6 ml dịch nuôi cấy giống khởi động chủng vi khuẩn nghiên cứu vào ống 15 ml, tiến hành ly tâm ở 4.000 v/p trong 10 phút, loại bỏ dịch. Hoàn trở lại với 3 ml NaCl 0,9% rồi trộn đều sau đó hút mỗi 0,5 ml vào trong 2 bình tam giác có chứa 25 ml môi trường dịch dạ dày nhân tạo gồm: NaCl (125 mmol/l), KCl (7 mmol/l), NaHCO3 (45 mmol/l) và pepsin (3 g/l). Dịch dạ dày nhân tạo đã được điều chỉnh về pH 2 và 3 bằng HCl 1 M. Hỗn hợp được ủ trong 3 giờ ở 37oC. Dịch sau khi ủ được pha loãng ở nồng độ 10-2 và được cấy đều lên đĩa thạch NA. Sau 24 giờ nuôi cấy vi sinh vật ở 37oC, đếm số khuẩn lạc mọc trên bề mặt thạch và so sánh với đối chứng [32]. 2.3.3.10. Khả năng chịu muối mật Hút mỗi 100 µl dịch nuôi cấy giống khởi động chủng vi khuẩn nghiên cứu vào các bình tam giác, mỗi bình chứa 25 ml môi trường NA dịch thể có bổ sung ox-bile (Sigma, Đức) với nồng độ lần lượt là 0,1%; 0,3%; 0,5% và 0,7%. Sau 24 giờ nuôi cấy ở 37oC tiến hành đo OD dịch nuôi cấy ở bước sóng 600 nm để so sánh khả năng chịu muối mật ở các nồng độ khác nhau. 2.3.3.11. Khả năng chịu muối Hút ra mỗi 100 µl vào các bình tam giác có chứa 25 ml môi trường NA dịch thể có bổ sung NaCl (Merck, Đức) với nồng độ lần lượt là 1%, 3%, 5%, 7% và 9%. Sau 24 giờ nuôi cấy ở 37oC tiến hành đo OD dịch nuôi cấy ở bước sóng 600 nm để so sánh khả năng chịu muối ở các nồng độ khác nhau. Lựa chọn môi trường và thời gian nuôi cấy thích hợp cho khả năng sinh enzyme ngoại bào cao Chủng vi khuẩn nghiên cứu được cấy trên đĩa Petri có chứa môi trường NA. Dùng que bông đã khử trùng gạt lấy phần sinh khối tế bào và hòa vào dung dịch nước muối sinh lý. Sau đó điều chỉnh để OD ở bước sóng 600 nm của tế bào về 1 (≈ 1 × 109 CFU/ml). Hút ra 0,5 ml dịch tế bào này vào 10 bình tam giác 250 ml chứa 100 ml các loại môi trường khác nhau (xem phụ lục C) rồi tiến hành nuôi cấy lắc 160 v/p ở 37oC. Cứ sau 10, 24, 34, 48, 58, 72, 82, 96 giờ hút ở mỗi bình ra 5 ml dịch nuôi cấy và tiến hành đo OD ở bước sóng 600 nm để xác định mật độ tế bào đồng thời xác định hoạt độ một số enzyme ngoại bào bằng phương pháp định tính và định lượng. Dựa vào kết quả thu được, lựa chọn môi trường và thời gian nuôi cấy thích hợp cho khả năng sinh enzyme ngoại bào cao. Phương pháp xác định protein Chuẩn bị dải pha loãng dung dịch Bovine serum albumin (BSA – Sigma, Đức) ở các nồng độ 50; 100; 200; 300; 400 và 500 (µg/ml). Hút 1 ml dịch có chứa BSA ở các nồng độ trên tiến hành phản ứng Lowry (xem mục 2.2.6.3.) Từ kết quả trên, ta dựng được đồ thị đường chuẩn độ hấp phụ theo nồng độ BSA và xây dựng công thức: y = 0,001x – 0,014 Trong đó y là độ hấp phụ (OD750), x là nồng độ BSA (µg/ml). Hình 2.1. Đồ thị đường chuẩn theo thang BSA (µg/ml). Phương pháp xác định hoạt độ enzyme ngoại bào 2.3.6.1. Phương pháp xác định hoạt độ xylanase Hoạt độ của xylanase được xác định theo phương pháp DNS của Miller (1959) và Bailey (1992) [20] [40]. Hóa chất: Thuốc thử DNS (xem phụ lục A), cơ chất xylan 1% pha trong đệm Tris-HCl 0,05 M pH 7. Cách tiến hành: Hỗn hợp phản ứng gồm 50 µl enzyme + 150 µl xylan 1% được ủ ở 50oC trong 10 phút. Sau 10 phút, bổ sung 600 µl DNS để dừng phản ứng. Hỗn hợp được ngâm 5 phút trong bể đun sôi, sau đó vớt ra ngâm 5 phút trong nước đá. Mẫu blank được bổ sung DNS ngay từ đầu để bất hoạt enzyme, sau đó thêm cơ chất xylan 1% và tiến hành như trên. Bổ sung 4,2 ml nước cất, đo OD ở bước sóng 500 nm. Dựng đường chuẩn: Sấy khô đường xylose (Merck, Đức) trong 5 giờ ở 80oC. Làm dải pha loãng dung dịch xylose trong H2O ở các nồng độ 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4; 1,6; 1,8 và 2,0 (mg/ml). Hòa 200 μl mỗi dung dịch đường ở dãy pha loãng trên với 600 μl dung dịch DNS, ngâm 5 phút trong bể đun sôi, sau đó vớt ra ngâm 5 phút trong nước đá để làm bền màu. Bổ sung 4,2 ml nước cất, đo độ hấp phụ ở bước sóng 500 nm (blank bằng mẫu có chứa xylose 0 mg/l). Với mỗi nồng độ lặp lại 2 lần và lấy giá trị trung bình. Từ kết quả trên, ta dựng được đồ thị đường chuẩn độ hấp phụ theo nồng độ đường xylose và xây dựng công thức: y = 1,161x – 0,114 Trong đó y là độ hấp phụ (OD500), x là nồng độ xylose (mg/ml). Hình 2.2. Đồ thị đường chuẩn theo thang xylose (mg/ml). Xác định hoạt độ của xylanase: Một đơn vị hoạt độ của xylanase là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1 μmol/phút đường xylose dưới điều kiện của thí nghiệm. Hoạt độ của enzyme được xác định theo công thức: x × 1.000 × 20 Hoạt độ U = ——————— 150 × 10 Trong đó: x là lượng đường khử tính theo đường chuẩn, x × 1.000 là lượng đường khử theo đường chuẩn đổi ra µg, 20 là hoạt độ xylanase tính theo 1 ml dịch thử, 150 là khối lượng phân tử của xylose và 10 là thời gian (phút) ủ của phản ứng. 2.3.6.2. Phương pháp xác định hoạt độ amylase Hoạt độ của amylase được xác định theo phương pháp trong nghiên cứu của Mishra và Behara (2008) [41]. Hóa chất: Thuốc thử DNS (xem phụ lục A), dung dịch tinh bột tan 1% pha trong Tris-HCl 0,1 M pH 7. Cách tiến hành: Hồ hóa dịch tinh bột tan bằng cách ủ ở 100oC trong 30 phút. Hỗn hợp phản ứng gồm 100 µl enzyme + 100 µl cơ chất tinh bột tan 1% được ủ ở 50oC trong 30 phút. Dừng phản ứng bằng cách bổ sung 600 µl DNS sau đó đưa vào bể đun sôi trong 10 phút rồi làm lạnh nhanh. Mẫu blank được thêm 600 µl DNS ngay từ đầu để bất hoạt enzyme. Hút 4,2 ml nước cất vào hỗn hợp phản ứng, đo OD ở bước sóng 575. Dựng đường chuẩn glucose: Sấy khô đường glucose (Merck, Đức) ở 105oC trong 2 giờ. Làm dải pha loãng dung dịch glucose trong nước ở các nồng độ 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4; 1,6; 1,8 và 2,0 (mg/ml). Hòa 200 μl mỗi dung dịch đường ở dãy pha loãng trên với 600 μl dung dịch DNS, đun sôi trong 10 phút sau đó làm lạnh nhanh bằng nước đá. Bổ sung 4,2 ml nước cất, đo độ hấp phụ ở bước sóng 575 nm (blank bằng mẫu có chứa glucose 0 mg/l). Với mỗi nồng độ lặp lại 2 lần và lấy giá trị trung bình. Từ kết quả trên, ta dựng được đồ thị đường chuẩn độ hấp phụ theo nồng độ đường glucose và xây dựng công thức: y = 0,476x – 0,019 Trong đó y là độ hấp phụ (OD575); x là nồng độ glucose (mg/ml). Hình 2.3. Đồ thị đường chuẩn theo thang glucose (mg/ml). Xác định hoạt độ amylase: Một đơn vị hoạt độ của amylase là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1 μmol/phút đường glucose dưới điều kiện của thí nghiệm. Hoạt độ của enzyme được xác định theo công thức: x × 1000 × 10 Hoạt độ U = ——————— 180 × 30 Trong đó: x là lượng đường khử tính theo đường chuẩ,; x × 1.000 là lượng đường khử theo đường chuẩn đổi ra µg, 10 là hoạt độ xylanase tính theo 1 ml dịch thử, 180 là khối lượng phân tử của xylose và 30 là thời gian (phút) phản ứng. 2.3.6.3. Phương pháp xác định hoạt độ protease Hoạt độ của protease được xác định theo phương pháp trong nghiên cứu của Lazim (2009) [37]. Hóa chất: Casein 2%, Tris-HCl 0,1 M pH 7, TCA 2%, Copper sulfate reagent, WS1, và WS2 (xem phụ lục A). Cách tiến hành: Nhỏ 25 µl enzyme cần định lượng vào ống nghiệm thủy tinh. Thêm tiếp 250 µl casein 2% và 475 µl Tris-HCl 0,1 M pH 7. Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 55oC trong 15 phút. Sau đó bổ sung 500 µl TCA 2% để dừng phản ứng. Mẫu blank được thêm 500 µl TCA 2% ngay từ trước khi ủ để bất hoạt enzyme. Lắc đều, ly tâm hỗn hợp phản ứng ở 10.000 v/p trong 10 phút, nhiệt độ thường. Hút 1 ml dịch trong sau ly tâm thực hiện phản ứng Lowry [44]. Theo đó, 1 ml dịch trong sau ly tâm phản ứng với 1ml WS1, lắc đều, ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Sau đó bổ sung 500 µl WS2 vào hỗn hợp phản ứng trên, lắc đều. Sau 30 phút tiến hành đo OD ở bước sóng 750 nm. Dựng đường chuẩn L-tyrosine: Làm dải pha loãng dung dịch L-tyrosine (Merck, Đức) trong HCl 0,1 M ở các nồng độ 10, 20, 40, 60, 80 và 100 (µg/ml). Hút 1 ml dịch có chứa L-tyrosine ở các nồng độ trên thực hiện phản ứng Lowry. Từ kết quả trên, ta dựng được đồ thị đường chuẩn độ hấp phụ theo nồng độ L-tyrosine và xây dựng công thức: y = 0,017x + 0,004 Trong đó y là độ hấp phụ (OD750); x là nồng độ L-tyrosine (µg/ml). Hình 2.4. Đồ thị đường chuẩn theo thang L-tyrosine (µg/ml). Xác định hoạt độ của protease: Một đơn vị hoạt độ của protease là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1 μg/phút L-tyrosine dưới điều kiện của thí nghiệm. Hoạt độ của enzyme được xác định theo công thức: x × 40 Hoạt độ U = ———— 15 Trong đó: x là lượng L-tyrosine tính theo đường chuẩn, 40 là hoạt độ protease tính theo 1 ml dịch thử và 15 là thời gian (phút) phản ứng. Tách chiết và tinh sạch enzyme ngoại bào 2.3.7.1. Cô đặc dịch nuôi cấy bằng hệ thống lọc tiếp tuyến Chủng vi khuẩn nghiên cứu được nuôi cấy trên 1 lít môi trường với nhiệt độ, pH và thời gian thích hợp, sau đó ly tâm dịch ở 6.000 v/p trong 15 phút để loại bỏ tế bào. Dịch sau ly tâm được cô đặc bằng hệ thống lọc tiếp tuyến với màng lọc 300 kDa và 10 kDa để loại bỏ những hợp chất có khối lượng phân tử nằm ngoài 2 khoảng trên. 2.3.7.2. Tủa enzyme bằng muối ammonium sulfate Đầu tiên, dịch có chứa enzyme bị tủa ammonium sulfate ((NH4)2SO4) ở nồng độ bão hòa 30%, sau đó hỗn hợp được ngâm trong đá 30 phút, ly tâm ở 9.500 v/p trong 15 phút ở 4oC. Hút phần dịch trong sang ống nghiệm khác, tiếp tục bổ sung từ từ (NH4)2SO4 đến khi đạt nồng độ 80% (xem phụ lục C). Hỗn hợp được ủ và ly tâm như trên. Loại bỏ dịch, phần tủa được hòa tan bằng 1 ml đệm dùng chạy sắc ký trao đổi ion. 2.3.7.3. Sắc ký trao đổi ion Cột được cân bằng với đệm (xem phụ lục A) và điều chỉnh tốc độ dòng là 3 ml/phút trước khi đưa mẫu lên. Dùng pipet đưa mẫu lên cột. 20 phân đoạn đầu (thể tích mỗi phân đoạn là 5 ml) rửa cột bằng đệm. 20 phân đoạn sau thôi cột bằng gradient NaCl (từ 0 đến 1 M) nhằm đẩy những enzyme bám cột trôi ra ngoài. Tiến hành định tính và định lượng các enzyme ngoại bào của 40 phân đoạn. Phân đoạn nào có hoạt độ enzyme cao được bảo quản để dùng trong các thí nghiệm tiếp theo. 2.3.7.4. Sắc ký lọc gel Phần dịch thu được sau khi chạy sắc ký trao đổi ion tiếp tục được tủa bằng muối ammonium sulfate. Hòa tan tủa trong 1 ml đệm phosphate 50 mM pH 7 có bổ sung NaCl nồng độ 0,15 M dùng để chạy sắc ký lọc gel với cột Hiload 16/60, thể tích cột là 120 ml. Điều chỉnh tốc độ dòng chảy của cột sắc ký lọc gel là 1 ml/phút, dùng pipet đưa dịch chứa enzyme lên cột, thu 40 phân đoạn (thể tích mỗi phân đoạn là 3 ml). Tiến hành định tính và định lượng nhanh các enzyme ngoài bào ở 40 phân đoạn. Cuối cùng, để xác định trọng lượng phân tử cũng như đánh giá mức độ tinh sạch của enzyme, chúng tôi tiến hành chạy điện di protein trên gel polyacrylamide SDS-PAGE. 2.3.7.5. Điện di SDS-PAGE Mức độ tinh sạch và trọng lượng phân tử của enzyme được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide có chứa SDS (SDS-PAGE) của Laemmli (1970). Thành phần bản gel xem phụ lục A. Sau khi đổ lớp resolving gel ta bổ sung ngay một lớp nước lên trên và chờ 30 phút để gel đông. Sau đó loại bỏ lớp nước và đổ tiếp lớp stacking gel lên trên, gắn lược và chờ tiếp 30 phút nữa. Đặt bản gel vào buồng điện di và nạp mẫu. Mẫu enzyme được trộn đều với SDS reducing buffer (xem phụ lục A) với tỷ lệ thể tích là 1:4. Xử lý mẫu ở 94oC trong 4 phút sau đó tra mẫu vào giếng và để ổn định trong 5 phút trước khi chạy. Chạy điện di với hiệu điện thế là 110 V trong 1 giờ 45 phút. Sau khi chạy điện di xong, tiến hành nhuộm bản gel SDS-PAGE như sau: nhuộm gel trong bể nhuộm với 100 ml dung dịch Coomassie Brilliant Blue R-250 trong 30 phút. Sau đó, bản gel được ngâm 1 giờ trong dung dịch Destain (xem phụ lục A) rồi được rửa bằng nước. Quan sát các băng, so sánh với thang chuẩn (marker) và chụp ảnh. Xác định đặc tính enzyme ngoại bào Dịch enzyme ngoại bào thu được sau khi chạy sắc ký lọc gel được sử dụng cho các thí nghiệm nghiên cứu đặc tính enzyme. 2.3.8.1. Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzyme Hỗn hợp phản ứng gồm enzyme và cơ chất dùng trong các phương pháp định lượng được ủ ở các nhiệt độ khác nhau từ 30-70oC rồi giữ lạnh. Sau khi ủ xong đồng thời bất hoạt enzyme. Tiến hành xác định hoạt độ và so sánh. 2.3.8.2. Khả năng bền nhiệt của enzyme Dịch enzyme được xử lý tại các nhiệt độ 60, 70 và 80 oC trong khoảng thời gian 10, 20 và 30 phút. Sau đó thực hiện các phản ứng định lượng để xác định hoạt độ. 2.3.8.3. pH thích hợp cho hoạt động của enzyme Cơ chất được hòa tan bằng các loại đệm có giá trị pH khác nhau từ 3-9 (xem phụ lục C) sau đó dùng cơ chất này để thực hiện các phản ứng định lượng enzyme. 2.3.8.4. Thử khả năng bền axít Enzyme bị xử lý với citrate phosphate pH 3 trong 20, 40, 60, 80, 100 và 120 phút, sau đó bổ sung sodium phosphate 0,2 M để đưa về pH 7 rồi bổ sung cơ chất và tiến hành phản ứng định lượng. 2.3.8.5. Ảnh hưởng của các ion kim loại và hóa chất đến hoạt độ của enzyme Hỗn hợp phản ứng định lượng được bổ sung các ion kim loại (bảng 4.9. phần phụ lục) sao cho đạt nồng độ 2, 5 và 10 mM. Sau đó tiến hành các phản ứng định lượng enzyme. 2.3.8.6. Sắc ký lớp mỏng 225 µl cơ chất xylan 1% (pha trong Tris-HCl 0,05 M pH 7) được ủ với 225 µl xylanase ở 50oC trong các khoảng thời gian khác nhau. Sản phẩm thủy phân sau đó được chấm lên bản chạy sắc ký lớp mỏng 20 × 20 cm TLC Cellulose Plastic (Merck, Đức) và chạy trên dung môi (xem phụ lục A). Sau đó tiến hành nhuộm bản sắc ký bằng dung dịch hỗn hợp phthalic axít và aniline (xem phụ lục A). 12 µl hỗn hợp gồm D-xylose (X1), xylobiose (X2), xylotriose (X3) và xylotetraose (X4) (nồng độ từng loại trong hỗn hợp là 1 mg/ml) được chấm lên bản chạy sắc ký dùng làm chất chuẩn. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN LỰA CHỌN CHỦNG VI KHUẨN NGHIÊN CỨU Tuyển chọn chủng Dựa vào màu sắc, kích thước và hình thái bề mặt khuẩn lạc, 63 chủng vi khuẩn đã được lựa chọn và phân loại dựa trên phương pháp phân tích trình tự gen 16S rRNA (Trung và cs, 2011). Dựa trên cơ sở dữ liệu Eztaxon-e cập nhật đến ngày 16/05/2012, 41 chủng trong số này được phân loại vào chi Bacillus. Cây phân loại dựa trên trình tự 16S rDNA Để lựa chọn các chủng thuộc nhóm B. subtilis, chúng tôi tiến hành xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa vào trình tự gen 16S rRNA cùng với 9 loài trong nhóm B. subtilis (Vos et al., 2009). Kết quả cho thấy, duy nhất chủng SP 1901 có quan hệ gần gũi với các loài trong nhóm B. subtilis. (hình 3.1.) Hình 3.1. Cây phát sinh chủng loại của 37 chủng vi khuẩn Bacillus phân lập tại rừng Quốc gia Hoàng Liên và 9 loài thuộc nhóm vi khuẩn B. subtilis dựa trên phân tích trình tự 16S rDNA. Vòng tròn chỉ vị trí phân loại của chủng SP 1901. Cây phân loại dựa trên trình tự đa gen Phân loại các loài trong nhóm B. subtilis nói chung và B. amyloliquefaciens nói riêng đòi hỏi phải có sự tổ hợp của nhiều phương pháp phân loại hiện đại. Dựa vào kỹ thuật phân tích trình tự đa gen Multilocus Sequence Analysis (MLSA), Rooney và cộng sự (2009) đã phát hiện một nhóm loài nằm tách biệt với các loài trong nhóm B. subtilis subsp. subtilis và B. subtilis subsp. spizizenii trên cây phân loại xây dựng từ 6 trình tự gen gyrA, rpoB, purH, polC, groEL và 16S rRNA [45]. Trên cơ sở phân tích dữ liệu khối phổ MALDI - TOF và thành phần axit béo (FAME), ông đã đề xuất một nhóm loài mới đó là loài phụ B. subtilis subsp. inaquosorum. Mặc dù nghiên cứu của Borriss và cộng sự (2010) không đề xuất kỹ thuật phân tích trình tự đa gen nhưng trên cây phân loại 6 gen của Rooney và cộng sự đã chỉ rõ sự tách biệt giữa 2 nhóm B. amyloliquefaciens DSM 7 và B. amyloliquefaciens FZB42. Vì vậy, khi phân tích cây phát sinh chủng loại trên nhóm vi khuẩn B. subtilis phân lập từ thực phẩm lên men tại Nhật Bản, Kobo và cộng sự (2011) đã ứng dụng phân tích trình tự 6 gen và đã phân tách rõ ràng các chủng dưới loài B. amyloliquefaciens. Tra cứu trình tự tương đồng đoạn 16S rDNA của chủng SP 1901 trên cơ sở dữ liệu ngân hàng gen NCBI không đưa ra kết quả phân loại chính xác đến loài nhưng trên cơ sở dữ liệu EzTaxon đã phân loại chủng SP 1901 đến loài B. amyloliquefaciens subsp. plantarum. Để xác minh kết quả trên, chúng tôi tiến hành phân tích trình tự 5 gen khác là gyrA, rpoB, purH, polC và groEL kết hợp với trình tự gen 16S rRNA để tiến hành xây dựng cây phân loại cho chủng SP 1901 cùng với các loài trong nhóm B. subtilis đã công bố [45] [23]. Kết quả phân tích cho thấy chủng SP 1901 được xếp vào nhóm loài B. amyloliquefaciens subsp. plantarum và phân tách hoàn toàn với nhóm loài B. amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens cũng như những loài trong nhóm B. subtilis. (hình 3.2.) Với kết quả thu được chúng tôi kết luận chủng SP 1901 là loài B. amyloliquefaciens subsp. plantarum. B. subtilis subsp. subtilis NRRL NRS-744 B. subtilis subsp. inaquosorum NRRL B-23052 B. subtilis subsp. spizizenii NRRL B-23049 B. tequilensis NRRL B-41771 B. vallismortis NRRL B-14890 B. mojavensis NRRL B-14698 B. atrophaeus NRRL NRS-213 B. amyloliquefaciens subsp. plantarum NRRL B-23189 B. amyloliquefaciens subsp. plantarum NRRL B-23190 B. amyloliquefaciens subsp. plantarum NRRL BD-621 B. amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42 B. amyloliquefaciens subsp. plantarum Mito-5-13 B. amyloliquefaciens subsp. plantarum Mito-7-4 B. amyloliquefaciens subsp. plantarum Tikusei-14-1 SP 1901 B. amyloliquefaciens subsp. plantarum Hitachioomiya-8-2 B. amyloliquefaciens subsp. plantarum NRRL BD-557 B. amyloliquefaciens subsp. plantarum NRRL BD-545 B. amyloliquefaciens subsp. plantarum NRRL B-41580 B. amyloliquefaciens subsp. plantarum strain NRRL B-4257 B. amyloliquefaciens subsp. plantarum NRRL BD-569 B. amyloliquefaciens subsp. plantarum NRRL BD-568 B. amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens NRRL BD-601 B. amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens DSM 7 B. amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens NRRL B-14393 B. licheniformis DSM 13 B. sonorensis NRRL B-23154 B. pumilus NRRL NRS-272 B. cereus ATCC 14579 100 92 100 100 100 93 100 100 100 100 100 55 82 60 100 0.05 Hình 3.2. Cây phát sinh chủng loại của các loài vi khuẩn thuộc nhóm B. subtilis. Cây được xây dựng dựa trên đoạn 5.547 bp kết nối từ 6 gen gyrA, rpoB, purH, polC, groEL và 16S rRNA. Trình tự 6 gen này đã được đăng tải trên ngân hàng gen NCBI với mã hiệu trình tự lần lượt là JX403999, JX404000, JX404001, JX404002, JX404003 và JX404004. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG SP 1901 Đặc điểm hình thái Chủng B. amyloliquefaciens subsp. plantarum SP 1901 là vi khuẩn hiếu khí, hình que, kích thước tế bào (3,2-3,9) × (0,9-1,0) µm, đứng riêng rẽ hoặc xếp đôi. Chủng SP 1901 có khả năng sinh nội bào tử hình trụ, thường nằm lệch về một phía tế bào nhưng không làm biến dạng hình que đặc trưng của chúng. Trên môi trường nuôi cấy NA, khuẩn lạc dạng tròn, có màu trắng sữa. Bề mặt khuẩn lạc khô, lồi và sần sùi, mép khuẩn lạc có dạng hình răng cưa. Khuẩn lạc bám chắc vào thạch sau 2 ngày nuôi cấy. (c) (b) (a) Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc chủng SP 1901 (a), hình thái tế bào khi nhuộm gram (b) và soi nổi (c). Đặc điểm sinh học của chủng SP 1901 3.2.2.1. pH sinh trưởng tối ưu, khả năng chịu muối NaCl, khả năng chịu dịch dạ dày và khả năng chịu muối mật (d) (c) (b) (a) Hình 3.4. pH sinh trưởng tối ưu (a). Khả năng chịu muối NaCl (b). Khả năng chịu dịch dạ dày (c). Khả năng chịu muối mật (d). Chủng SP 1901 có khả năng sinh trưởng tốt trong dải pH từ 5-9, tối ưu ở pH 7. Loài vi khuẩn này có khả năng tồn tại và phát triển sau khi bị xử lý trong dịch dạ dày nhân tạo ở pH 2 và pH 3 sau 3 giờ ở 37oC. Ở môi trường muối mật, chúng có khả năng sinh trưởng tốt trên môi trường có chứa 0,1% Ox-bile nhưng từ 0,3% trở lên thì sinh trưởng yếu. Chủng SP 1901 có khả năng chịu muối rất cao, chúng sinh trưởng tốt trên môi trường có nồng độ muối từ 1,0-7,0%. Thậm chí ở môi trường có bổ sung muối ở nồng độ 1,0-3,0% chúng sinh trưởng mạnh hơn cả khi không được bổ sung muối. 3.2.2.2. Khả năng sinh IAA Hình 3.5. Khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng IAA của chủng SP 1901 sau 24, 48 và 72 giờ. Khi được nuôi trên môi trường NA dịch thể có bổ sung L-tryptophan, chủng SP 1901 có khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng IAA mạnh nhất sau 24 giờ. Bên cạnh đó, cây ngô khi được bổ sung 0,8 ml dịch nuôi cấy này có chiều cao hơn 4 cm so với cây không được bổ sung (sau 10 ngày). (a) (b) Đối chứng SP 1901 Hình 3.6. Khả năng sinh IAA làm cho dung dịch chuyển từ màu vàng sang đỏ (a). Ảnh hưởng của chủng SP 1901 lên khả năng sinh trưởng của cây ngô sau 10 ngày trồng (b). Các loài thuộc chi Bacillus có khả năng sinh IAA rất cao. Wahyudi và cộng sự (2011) đã phân lập được 90 trên tổng số 118 loài Bacillus tại vùng rễ của cây đậu tương có khả năng sinh IAA. Hàm lượng IAA trong môi trường nuôi cấy có bổ sung L-tryptophan trong dải 0,81 - 86,82 mg/l. Trong đó chủng Bacillus Cr-4 sinh IAA mạnh nhất (86,82 mg/l). Tác giả đã thử nghiệm khả năng kích thích sinh trưởng của các chủng này lên hạt đậu tương và kiểm tra độ dài của rễ, số lượng rễ phụ trong quá trình nảy mầm. Kết quả cho thấy có sự kích thích đáng kể đến độ dài của rễ và số lượng rễ phụ so với đối chứng [19]. Idris và cộng sự (2007) đã thử nghiệm khả năng kích thích sinh trưởng của chủng B. amyloliquefaciens FZB42 lên bèo tấm, kết quả cho thấy có sự gia tăng đáng kể trọng lượng bèo tươi khi thu hoạch so với đối chứng [31] 3.2.2.3. Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu Chủng SP 1901 có khả năng sinh trưởng tốt trong dải nhiệt độ từ 20 đến 55oC, nhiệt độ tối ưu từ 40 đến 45oC. Nhiệt độ (oC) 24 giờ 48 giờ Nhiệt độ (oC)