Luận văn Nghiên cứu chế tạo vật liệu nanocomposit Cu - Silica ứng dụng để diệt nấm colletotrichum

các hoạt chất thân môi trƣờng có khả năng kháng nấm để làm nguyên liệu tạo chế phẩm diệt nấm phục vụ cho nền nông nghiệp phát triển bền vững đang là một vấn đề rất cấp thiết, cần đƣợc tiến hành. Cơ quan bảo vệ Môi trƣờng của Mỹ đã công nhận các hạt nano Cu là chất kháng khuẩn để diệt các vi khuẩn gram âm và gram dƣơng. So với các hạt nano kim loại nhƣ bạc, vàng, bạch kim có những tính chất, ứng dụng tƣơng tự; nano Cu đƣợc xem là một lựa chọn tốt để thay thế bởi giá thành rẻ hơn. Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã công bố khả năng của nano Cu chống lại nấm gây bệnh ở cây trồng nhƣ Phoma destructiva, Curvularia lunata, Alternaria alternata và Fusarium oxysporum [14, 27]. Tuy nhiên, nếu sử dụng trực tiếp nano Cu để xử lý thì hoạt lực của chúng có thể nhanh chóng bị mất đi do chúng phản ứng, tƣơng tác với chất 2 khác. Việc gắn các hạt nano Cu lên chất mang sẽ giúp các hạt nano giải phóng một cách từ từ, kéo dài hoạt lực diệt nấm của vật liệu, đồng thời giúp phân tán các hạt nano, ngăn chặn sự tích tụ của các hạt nano [32]. Một số vật liệu mang thƣờng đƣợc sử dụng để chế tạo nanocomposit nhƣ than hoạt tính, sét, sợi vải, hạt silica Qua quá trình khảo nghiệm, vật liệu silica đƣợc lựa chọn làm vật mang trong nghiên cứu này do silica có thể chế tạo đƣợc ở kích thƣớc nano, vật liệu có cấu trúc xốp và tính thân thiện môi trƣờng cao. Silica là dạng của anhyđrit axit silicsic có cấu trúc lỗ xốp rất phát triển, mạng lƣới của gel bao gồm các phân tử silic nằm giữa các nguyên tử oxy. Silica dễ dàng hấp phụ các chất phân cực cũng nhƣ các chất có tạo với nhóm hiđroxy các liên kết kiểu cầu hiđro. Silica có thể tái sinh ở nhiệt độ < 200oC. Do đó thích hợp làm vật mang để gắn hoạt chất. Để nâng cao tính ổn định của vật liệu sử dụng để diệt nấm, nano Cu đã đƣợc gắn lên chất mang silica. Việc nghiên cứu chế tạo thành công vật liệu nanocomposit Cu-silica là một nhiệm vụ quan trọng để ứng dụng trong diệt nấm gây bệnh trên cây trồng nhằm thay thế các chất diệt nấm, có tác dụng thiết thực trong bảo vệ môi trƣờng và bảo vệ sức khỏe con ngƣời. Do đó, trong khuôn khổ Luận văn này thực hiện nghiên cứu: “Nghiên cứu chế tạo vật liệu nanocomposit Cu-silica ứng dụng để diệt nấm Colletotrichum”. Mục tiêu nghiên cứu của Luận văn: chế tạo đƣợc vật liệu nanocomposit Cu- silica có hoạt tính kháng nấm Colletotrichum. Nội dung nghiên cứu chính của Luận văn gồm có: - Điều chế các hạt Cu có kích thƣớc nanomet; - Nghiên cứu chế tạo vật liệu nanocomposit Cu-silica; - Đánh giá hoạt lực kháng nấm Colletotrichum của vật liệu nanocomposit Cu-silica. 3 CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN 1.1. Đặc điểm gây bệnh và biện pháp quản lý nấm Colletotrichum 1.1.1. Một số đặc điểm hình thái và gây bệnh của nấm Colletotrichum trên cây trồng Hàng nằm trên thế giới, bệnh cây gây ra những tổn thất to lớn cho nền nông nghiệp. Chúng phá hủy đến 537,3 triệu tấn các loại nông sản chủ yếu, chiếm 11,6% tổng sản lƣợng nông nghiệp trên thế giới (FAO, 2004). Một trong những tác nhân gây bệnh trên cây nông nghiệp là nấm Colletotrichum [8]. Bệnh do nấm Colletotrichum rất phổ biến trên cây trồng. Chúng có thể tấn công tất cả các cây cảnh, trái cây, các loài rau và gây ra bệnh thƣờng đƣợc gọi là “thán thƣ”. Trong đó, đốm lá là những nguyên nhân phổ biến nhất gây thiệt hại cho sản xuất. Sự biểu hiện triệu chứng phụ thuộc nhiều vào loài cây chủ, nhƣng thƣờng các tổn thƣơng ban đầu xuất hiện với vòng tròn nhỏ ƣớt. Theo thời gian, tổn thƣơng mở rộng và có màu từ nâu vàng đến nâu sẫm hoặc đen, vết bệnh hình tròn hoặc có hình dạng bất thƣờng và có thể bao quanh bởi một quầng sáng màu vàng. Vết bệnh cũng có thể hơi trũng xuống, thƣờng dẫn đến các vành lớn trên lá, hoa, nụ thân và quả [8]. a) Hoa phong lan; b) Quả nho; c) Cành trúc đào; d) Cây Protea (một loài hoa ở Nam Phi) Hình 1.1. Các triệu chứng của bệnh thán thư gây ra bởi nấm Colletotrichum 4 Tuy nhiên, bệnh đốm lá cũng có thể gây ra bởi một số loài nấm khác nhƣ Elsinoe, Phyllosticta và Phoma. Do đó, để phân biệt giữa đốm lá do nấm Colletotrichum hay các nấm khác đôi khi cũng gặp khó khăn. Colletotrichum gloeosporioides là loài chiếm ƣu thế thƣờng gặp trên các vƣờn ƣơm, đặc biệt ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Thông thƣờng, mỗi loài nấm thƣờng sẽ chỉ gây nhiễm trên một loài thực vật cụ thể. Tuy nhiên, đối với Colletotrichum gloeosporioides với phổ ký chủ rất rộng có thể gây bệnh thán thƣ trên nhiều loài thực vật khác nhau [9]. Ở Việt Nam, nấm Colletotrichum gây hại trên cây ăn trái thƣờng gồm 3 loài chính: Colletotrichum acutatum, Colletotrichum gloeosporioides, và loài nấm chƣa xác định tên Colletotrichum sp. Tác giả Lê Hoàng Lệ Thủy và cộng sự (2008) cho biết tại khu vực đồng bằng sông Cửu Long tần suất xuất hiện của loài Colletotrichum gloeosporioides cao nhất chiếm 85,72%, kế đến là loài Colletotrichum acutatum chiếm 11,42%, phần còn lại là loài nấm chƣa xác định đƣợc tên [6]. (a): Các dạng khuẩn lạc (b1), (b2): Hình dạng và kích thước bào tử 7,5 – 20 x 2,5 – 5 μm (c1), (c2): Hình dạng và kích thước đĩa áp 5 – 20 x 3,75 – 11,25 μm (d1), (d2): Gai Hình 1.2. Hình thái khuẩn lạc, bào tử, đĩa áp và gai của loài Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh thán thư trên xoài [6] 5 Bảng 1.1. Một số đặc tính của một số chủng nấm Colletotrichum [6] S T T Tên loài Hình dạng và kích thƣớc của bào tử Hạch nấm Màu sắc khuẩn lạc Gai Hình dạng và kích thƣớc đĩa áp 1 Colletotrichum acutatum Hình thoi, kích thƣớc: 8,75 – 17,75 x 3,25 – 5 µm - Cam có vệt xám, xám - Dạng chùy, đôi khi không đều. Kích thƣớc: 10 – 17,5 x 5 – 7,5 µm 2 Colletotrichum gloeosporioides Hình trụ một đầu hẹp lại, một đầu cùn; hình trụ hai đầu cùn; dạng thẳng một đầu hẹp lại một đầu cùn, vùng giữa có dạng “thắt co”. Màu đen, một số chủng không có hạch nấm Trắng, hồng, cam, cam xám, xám Dạng thẳng, hơi cong Màu nâu đậm, đen Dạng trứng và trứng ngƣợc có nếp nhăn, dạng xẻ thùy Kích thƣớc 5 – 20 x 3,75 – 11,25 µm 3 Colletotrichum sp . Hình trụ, một đầu cùn một đầu hẹp lại. Kích thƣớc: 7,5 – 17,5 x 2,5 – 5 µm. - Trắng, hồng - Trứng ngƣợc và trứng ngƣợc có nếp nhăn. Kích thƣớc: 6,25 – 17,5 x 5 – 10 µm. Nấm Colletotrichum có thể qua đông trên các cây ký chủ khác nhƣ các cây họ cà, họ đậu, tàn dƣ thực vật và các quả bị bỏ lại trên đồng ruộng. Các loài 6 Colletotrichum sản sinh ra các hạch nấm nhỏ để tồn tại ở trạng thái ngủ nghỉ trong đất giữa mùa đông hoặc khi thời tiết bất thuận. Nhiệt độ tối ƣu cho sự phát triển của mầm bệnh từ 25 ÷ 28oC và pH 5,8 ÷ 6,5. Trong điều kiện nóng ẩm thông qua mƣa và tƣới tiêu bào tử đính trong các đĩa cành và các hạch nhỏ bị bắn từ nguồn bệnh tới các bộ phận khỏe của cây. Sự xâm nhiễm ban đầu bởi các loài nấm Colletotrichum có liên quan tới một loạt các quá trình bao gồm sự tiếp xúc bào tử lên bề mặt cây trồng, sự nảy mầm của bào tử, sự hình thành giác bám, sự xâm nhập vào biểu bì của cây, sự phát triển và định vị vào mô cây, sự sản sinh ra đĩa cành và bào tử phân sinh. Đầu tiên, tất cả các tác nhân gây bệnh tƣơng tác với cây chủ bằng cách sản xuất “appressorium” (tế bào chuyên biệt điển hình của nhiều tác nhân nấm gây bệnh sử dụng để lây nhiễm sang cây chủ) và sau đó thâm nhập vào lớp biểu bì chủ. Sau khi thâm nhập vào, các sợi nấm đầu tiên đƣợc hình thành. Sau đó, các sợi nấm này phát triển và lây lan để giết các tế bào chủ [23]. Trong nghiên cứu của Yashodha và cộng sự (1993) về các giai đoạn phát triển của Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh trên cây cau, tác giả nhận thấy rằng nấm đạt mức tăng trƣởng tối đa sau 10 ngày lây nhiễm [38]. 1.1.2. Thiệt hại do nấm bệnh Colletotrichum đến năng suất cây trồng Theo xếp hạng của tạp chí Bệnh học thực vật phân tử (2012) thì nấm Colletotrichum đƣợc xếp ở vị trí thứ 8 trong 10 nấm gây bệnh cây hàng đầu. Nấm Colletotrichum gây hại trên nhiều loại cây trồng có giá trị nhƣ: cây có múi, ớt, đậu tƣơng, cà chua. [31]. Trên cây ớt, loài nấm này có thể gây bệnh trên hầu hết các bộ phận của cây trong bất kỳ giai đoạn sinh trƣởng nào, tuy nhiên bệnh trên quả là có ý nghĩa kinh tế quan trọng hơn cả. Nấm mọc thành cụm, cụm bào tử màu hồng da cam. Triệu chứng trên quả lúc đầu là những vết bệnh dạng ngậm nƣớc và sau đó trở nên mềm nhũn đồng thời xuất hiện những vết lõm nhỏ, sạm lại (có màu nâu vàng hay màu rám nắng). Vết bệnh có thể bao trùm hết bề mặt quả và xuất hiện những thƣơng tổn phức tạp. Bề mặt của những vết bệnh trở nên ẩm ƣớt tạo thành đĩa cành với những lông gai màu đen trông rất cứng, những vòng tròn đồng tâm thƣờng xuất hiện bên trong vết lõm. Trong một vài trƣờng hợp vết bệnh màu nâu không phải là màu da cam và sau đó cũng hình thành lông cứng. 7 Năm 1989 tại Đài Loan xác định các loài nấm Colletotrichum capsici, Colletotrichum gloeosporioides, Glomerella cingulata gây hại trên quả ớt chín, trong đó có hai loài Colletotrichum capsici và Colletotrichum gloeosporioides là quan trọng hơn cả, làm giảm năng suất từ 10 – 80% ở một số quốc gia đang phát triển, đặc biệt là Thái Lan, gây thiệt hại nghiêm trọng trƣớc và sau khi thu hoạch. Cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) thuộc cây họ cà trồng thƣơng mại, cho thu hoạch lá. Ở Trung Quốc, cây thuốc lá chiếm hơn 40% tổng sản lƣợng toàn cầu. Colletotrichum destructivum là tác nhân thƣờng gặp gây bệnh thán thƣ trên cây thuốc lá, ngoài ra còn bao gồm cả các loài Colletotrichum khác đã đƣợc báo cáo ở Trung Quốc. Tháng 8 năm 2014, giống thuốc lá “Yunyan 85” đƣợc trồng trên diện tích 3 ha tại Quý Châu đã phát bệnh đốm mất màu và hoại tử trên 90% lá của 2% số cây. Các triệu chứng bệnh bắt đầu từ các điểm rời rạc, màu vàng – xanh và sau đó kết hợp lại thành tổn thƣơng lớn hơn (3,4 ÷ 5,5 x 2,5 ÷ 3,3 cm). Trung tâm của các vết tổn thƣơng có màu trắng và rìa có màu nâu sẫm. Bệnh gây ảnh hƣởng nghiêm trọng tới cây trồng, làm giảm chất lƣợng lá và thiệt hại ít nhất đến 50% năng suất cây [12]. Trên đậu tƣơng, nấm gây hại trên thân, cuống lá, quả trên cây khi quả gần chín. Vết bệnh màu nâu tối hay đỏ nâu. Giai đoạn cuối trên mặt các vết bệnh có những chấm màu đen. Quả bị nhiễm bệnh, hạt thƣờng nhỏ. Hạt bị nhiễm bệnh nhăn nheo. Bệnh lan truyền qua hạt giống, nấm có thể gây thối hạt giống trƣớc khi nảy mầm hay gây bệnh cho mầm đậu tƣơng. Trên thân mầm hay trên lá mầm có thể có những vết bệnh màu nâu đen [5]. Đặc biệt, bệnh cũng gây hại rất nghiêm trọng trên xoài, nhất là giai đoạn ra hoa, ra trái non và sau thu hoạch. Đối với sầu riêng, bệnh thán thƣ do nấm Colletotrichum gây hại làm chết cây con mới trồng và ảnh hƣởng đến năng suất của cây trƣởng thành. Tỷ lệ cây sầu riêng bị thán thƣ trong vƣờn lên đến 60% ở đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) [7]. 1.1.3. Một số biện pháp quản lý nấm bệnh Colletotrichum Hiện nay để phòng trừ một số loại nấm gây hại cho cây trồng ngƣời ta đã sử dụng nhiều loại thuốc hóa học, tuy nhiên khi sử dụng với liều lƣợng cao trong thời gian dài đã làm mất cân bằng quần thể vi sinh vật có ích trong đất, tạo điều kiện để nấm bệnh, các loài côn trùng có hại cho cây trồng kháng thuốc. Dƣ lƣợng thuốc 8 trong sản phẩm nông nghiệp và đất đã làm ô nhiễm nguồn nƣớc ngầm, môi trƣờng và gây tác hại nghiêm trọng đối với sức khỏe con ngƣời và vật nuôi. Ở một số nƣớc phát triển, nhiều loại hóa chất BVTV phòng trừ nấm, bệnh đã bị hạn chế hoặc cấm sử dụng. Việc tìm kiếm các hoạt chất thân môi trƣờng có khả năng kháng nấm để làm nguyên liệu tạo chế phẩm diệt nấm phục vụ cho nền nông nghiệp phát triển bền vững đang là một vấn đề rất cấp thiết, cần đƣợc tiến hành. Điều đó sẽ mang lại lợi ích lớn cho xã hội. Một trong những biện pháp phòng trừ nấm đã đƣợc nghiên cứu thực hiện rất sớm ở Việt Nam là ứng dụng các vi sinh vật đối kháng nấm bệnh cây và đã đạt đƣợc những thành tựu sau [6]: i) Sử dụng vi sinh vật đối kháng nấm nhƣ một sinh vật chức năng trong sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh; ii) Tạo đƣợc các chế phẩm lên men xốp sử dụng nhóm vi nấm Trichoderma để phòng trừ nấm gây bệnh cây trồng, tuy nhiên tác dụng phòng trừ bệnh của chúng còn chậm. Sử dụng thuốc hóa học đƣợc coi là biện pháp phổ biến trong kiểm soát bệnh thán thƣ. Mặc dù chúng cho hiệu quả nhanh chóng tuy nhiên có thể gây ra hiện tƣợng kháng thuốc khi chỉ sử dụng một hợp chất duy nhất với lƣợng nhiều. Etylen mangan bis dithiocarbamat đƣợc khuyến cáo rộng rãi để quản lý bệnh thán thƣ trên cây ớt. Việc ngâm hạt giống ớt trong dung dịch thiram 0,2% trong 12 giờ là cách tốt nhất để kiểm soát nấm bệnh Colletotrichum [21]. Ngoài ra, các loại thuốc diệt nấm khác nhƣ Mancozed 0,2%; ziram 0,1%, Blitox 50; Bavistin 0,1% và 0,5% hoặc hỗn hợp Bordeaux 1,0%... cũng có hiệu quả đối với nấm Colletotrichum. Thu dọn, tiêu huỷ tàn dƣ cây sau thu hoạch. Xử lý hạt giống bằng thuốc trừ nấm để chống mầm mốc trong bảo quản và trƣớc khi gieo trồng. Xử lý hạt giống trong nƣớc ấm 500C trong 3 giờ hoặc xử lý Carbendazim 0,2- 0,3%, Benlate-C; Rovral 50 WP (0,1- 0,2%). Theo Tổ chức Nông nghiệp và Khoa học sinh học Quốc Tế (CABI) thuốc có hợp chất gốc đồng: Benzamidazole, Dithiocarbamtes, Triazole và các thuốc trừ nấm nhƣ: Chlorithalonil, Imazalil, Prochloraz có hiệu quả trừ nấm do thuốc có khả năng xâm nhập vào mô cây, phá hủy sự xâm nhiễm tiềm ẩn của nấm. Tuy nhiên, việc sử dụng các chất hóa học có thể đem lại các tác động không tốt đối với ngƣời nông dân và các vấn đề về môi trƣờng [21]. 9 1.2. Công nghệ nano và nghiên cứu ứng dụng các hạt nano kim loại để kháng nấm Khoa học nano: là ngành khoa học nghiên cứu về các hiện tƣợng và sự can thiệp (manipulation) vào vật liệu tại các quy mô nguyên tử, phân tử và đại phân tử. Tại các quy mô đó, tính chất của vật liệu khác hẳn với tính chất của chúng tại các quy mô lớn hơn. Công nghệ nano: là ngành công nghệ liên quan đến việc thiết kế, phân tích, chế tạo và ứng dụng các cấu trúc, thiết bị và hệ thống bằng việc điều khiển hình dáng, kích thƣớc trên quy mô nanomet [2]. Vật liệu nano: là vật liệu trong đó ít nhất một chiều có kích thƣớc nano mét. Đây là đối tƣợng nghiên cứu của khoa học nano và công nghệ nano, nó liên kết hai lĩnh vực trên với nhau. Tính chất của vật liệu nano bắt nguồn từ kích thƣớc của chúng, vào cỡ nanomét, đạt tới kích thƣớc tới hạn của nhiều tính chất hóa lý của vật liệu thông thƣờng. Đây là lý do mang lại tên gọi cho vật liệu. Kích thƣớc vật liệu nano trải một khoảng từ vài nm đến vài trăm nm phụ thuộc vào bản chất vật liệu và tính chất cần nghiên cứu. Hình 1.3. Hình ảnh thể hiện “lĩnh vực” nano (màu đỏ) so với một số đối tượng vật lý và sinh học theo thang kích thước 10 1.2.1. Một số tính chất của vật liệu nano 1.2.1.1. Hiệu ứng bề mặt Khi kích thƣớc của vật liệu giảm thì tỉ số giữa số nguyên tử trên bề mặt và tổng số nguyên tử của vật liệu tăng lên. Do nguyên tử trên bề mặt có nhiều tính chất khác biệt so với tính chất của các nguyên tử ở bên trong lòng vật liệu nên khi kích thƣớc vật liệu giảm đi thì hiệu ứng có liên quan đến các nguyên tử bề mặt, hay còn gọi là hiệu ứng bề mặt tăng lên. Khi kích thƣớc của vật liệu giảm đến nanomet thì các tính chất liên quan đến các nguyên tử bề mặt thể hiện một cách rõ rệt. Kích thƣớc hạt càng bé thì hiệu ứng càng lớn và ngƣợc lại [2]. Bảng 1.2. Số nguyên tử và năng lượng bề mặt của hạt nano hình cầu Đƣờng kính hạt nano (nm) Số nguyên tử Tỷ số nguyên tử trên bề mặt (%) Năng lƣợng bề mặt (erg/mol) Năng lƣợng bề mặt trên năng lƣợng tổng (%) 10 30.000 20 4,8.10 11 7,6 5 4.000 40 8,6.10 11 14,3 2 250 80 2,04.10 12 14,3 1 30 90 9,23.10 12 82,2 1.2.1.2. Hiệu ứng kích thước Hiệu ứng kích thƣớc của vật liệu nano đã làm cho vật liệu này có nhiều đặc điểm khác với các vật liệu truyền thống. Mỗi một tính chất của vật liệu đều đƣợc quy định bởi một độ dài đặc trƣng hay còn gọi là kích thƣớc tới hạn. Các tính chất của vật liệu có độ dài đặc trƣng đều ở kích thƣớc nanomet mà ngày nay ngƣời ta thƣờng nói là “vật liệu nano” [2]. Hình 1.4. Ảnh hưởng của số lượng nguyên tử đến diện tích bề mặt riêng Tổng số nguyên tử: 10 Diện t ích bề mặt nguyên tử: 10 Chiếm: 100% Tổng số nguyên tử: 92 Diện t ích bề mặt nguyên tử: 74 Chiếm: 80% Tổng số nguyên tử: 792 Diện t ích bề mặt nguyên tử: 394 Chiếm: 50% 11 Ở vật liệu khối, kích thƣớc vật liệu lớn hơn nhiều lần so với độ dài đặc trƣng với các tính chất vật lí đã biết. Nhƣng khi kích thƣớc của vật liệu có thể so sánh với độ dài đặc trƣng đó thì tính chất có liên quan đến độ dài đặc trƣng bị thay đổi đột ngột, khác hẳn so với tính chất đã biết trƣớc đó. Không có sự chuyển tiếp một cách liên tục về tính chất khi đi từ vật liệu khối đến vật liệu nano. Khi nói đến vật liệu nano, ngƣời ta đã nghiên cứu đến tính chất đi kèm của vật liệu đó. Cùng một vật liệu, cùng một kích thƣớc, khi xem xét tính chất này thì khác so với vật liệu khối nhƣng cũng có thể xem xét tính chất khác thì lại không có gì khác biệt. Tuy nhiên, hiệu ứng bề mặt luôn luôn thể hiện dù ở bất cứ kích thƣớc nào. Ví dụ: đối với kim loại, quãng đƣờng tự do trung bình của điện tử có giá trị vài chục nm. Khi dòng điện chạy qua một dây dẫn kim loại, nếu kích thƣớc của dây rất lớn so với quãng đƣờng tự do trung bình của điện tử trong kim loại này thì chúng ta sẽ có định luật Ohm cho dây dẫn. Định luật cho thấy sự tỉ lệ tuyến tính của dòng và thế đặt ở hai đầu sợi dây. Nếu thu nhỏ kích thƣớc của sợi dây cho đến khi nhỏ hơn độ dài quãng đƣờng tự do trung bình của điện tử trong kim loại thì sự tỉ lệ liên tục giữa dòng và thế không còn nữa mà tỉ lệ gián đoạn với một lƣợng tử độ dẫn là e 2 /ħ, trong đó e là điện tích của điện tử, ħ là hằng số Planck. Lúc này hiệu ứng lƣợng tử xuất hiện. Có rất nhiều tính chất bị thay đổi giống nhƣ độ dẫn, tức là bị lƣợng tử hóa do kích thƣớc giảm đi. Hiện tƣợng này đƣợc gọi là hiệu ứng chuyển tiếp cổ điển - lƣợng tử trong các vật liệu nano do việc giam hãm các vật thể trong một không gian hẹp mang lại (giam hãm lƣợng tử). 1.2.2. Phương pháp chế tạo hạt nano kim loại Có hai phƣơng pháp cơ bản để chế tạo vật liệu nano là phƣơng pháp cơ lý – “từ trên xuống” và phƣơng pháp hóa học – “từ dƣới lên”. Phƣơng pháp “từ trên xuống” bao gồm sự phân rã dần dần các vật liệu lớn để tạo ra đƣợc đơn vị kích thƣớc nano bằng các phƣơng pháp khác nhau nhƣ phƣơng pháp nghiền, biến dạng Phƣơng pháp “từ dƣới lên” bao gồm việc lắp ghép các nguyên tử, phân tử để hình thành các cấu trúc nano [2, 9]. 12 Hình 1.5. Phương pháp chế tạo vật liệu cấu trúc nano: a) “từ trên xuống”; b) “từ dưới lên” Về mặt lý thuyết, cả hai phƣơng pháp sử dụng đều có thể chế tạo đƣợc vật liệu có độ tinh khiết cao. Tuy nhiên, phƣơng pháp “từ trên xuống” không thể chế tạo đƣợc các hạt nano có hình dạng giống hệt nhau và phân bố của chúng là không đồng nhất. Thông thƣờng, các vật liệu đƣợc chế tạo bằng phƣơng pháp này có chứa các hạt lớn dẫn đến, tính hoạt động cuả chúng giảm. Một nhƣợc điểm khác của phƣơng pháp “từ trên xuống” đó là khả năng lặp lại thấp. Bằng phƣơng pháp “từ dƣới lên”, quá trình chế tạo không đòi hỏi thiết bị đắt tiền, các bƣớc thực hiện đơn giản, có thể chế tạo số lƣợng lớn, đồng thời có thể đƣợc kiểm soát với độ chính xác lớn hơn nhiều, và có thể điều chỉnh đƣợc kích thƣớc hạt và hình thái học [9]. 1.2.3. Một số nghiên cứu ứng dụng các nano kim loại để kháng nấm 1.2.3.1. Trên Thế Giới Trong nghiên cứu của Habeeb Khadri và cộng sự (2013) [16], tác giả đã chế tạo nano bạc bằng cách đun sôi bột hạt ô liu trong nƣớc cất đã đƣợc vô trùng, sau đó lọc qua giấy lọc để thu lấy phần dịch. Dịch này sẽ đƣợc thêm vào dung dịch AgNO3 nhƣ một tác nhân khử sinh học khử Ag + về Ag o . Kết quả, tác giả đã thu đƣợc các hạt nano bạc với kích thƣớc dao động trong khoảng 1 ÷ 50 nm, trong đó kích thƣớc chủ yếu là 30 ÷ 40 nm. 13 Với dung dịch nano bạc chế tạo đƣợc, tác giả đã thử hoạt tính kháng nấm đối với một số chủng nấm gây bệnh trên cây trồng nhƣ Aspegillus niger, Aspergillus flavus, Rhizoctonia bataticola, Sclerotium rolfssi, Alternaria macrospora là những tác nhân tƣơng ứng gây bệnh lở cổ rễ, thối rễ, thối thân và đốm lá cho cây trồng ở những hàm lƣợng khác nhau. Kết quả cho thấy đã có hiệu lực kháng nấm của nano bạc trên các chủng nấm nghiên cứu. Tùy vào từng chủng nấm khác nhau mà mức độ ức chế của nano bạc với chúng khác nhau, tuy nhiên khi hàm lƣợng của nano bạc tăng, tƣơng ứng với vùng ức chế sẽ lớn hơn. Trong các chủng nấm nghiên cứu, chủng Aspergillus niger nhạy cảm với nano bạc hơn cả, vùng ức chế lên đến 1,6 cm. Trong khi đó, đối với chủng Rhizoctonia bataticola thì khả năng kháng nấm thấp hơn, vùng ức chế đạt 1,3 cm. Bảng 1.3. Hoạt lực kháng một số chủng nấm của nano bạc Chủng nấm Vùng kháng nấm (cm) 25 µl 50 µl 75 µl 100 µl Aspergillus niger 0,5 0,8 1,2 1,6 Aspergillus flavus 0,3 0,6 1,0 1,4 Rhizoctonia bataticola 0,4 0,5 0,9 1,3 Sclerotium rolfsii 0,3 0,7 1,0 1,4 Alternaria macrospora 0,4 0,8 1,1 1,5 Standard (Clotrimazole antibiotic) 0,5 0,7 1,1 1,4 Một nghiên cứu khác của Jolanta Pulit và cộng sự (2013) đã sử dụng nano bạc với kích thƣớc hạt thay đổi từ 10 ÷ 10.000 nm đƣợc điều chế bằng phƣơng pháp khử AgNO3 với chiết xuất từ quả mâm xôi để thử nghiệm hoạt tính kháng nấm với Cladosporlum cladosporlodes và Aspergillus niger tại các nồng độ khác nhau. Kết quả cho thấy, với nano bạc chế tạo đƣợc đã có hiệu ứng ức chế đối với sự phát triển của hai loài nấm nghiên cứu trên. Nhìn chung, khi nồng độ của nano bạc tăng thì hiệu quả ức chế nấm cao hơn, đặc biệt đối với Cladosporlum cladosporlodes, với nồng độ nano bạc là 12,5 ppm đã có thể ức chế sự phát triển của nó tới 60% và tại 50 ppm thì đạt tới khoảng 90% [18]. Nhiều nghiên cứu kết hợp các hạt nano kim loại trong các chất mang khác nhau tạo thành vật liệu nanocomposit nhằm tăng cƣờng hoạt tính của các hạt nano kim loại do chất mang giúp bảo tồn tính ổn định về cấu trúc của các hạt nano kim loại. 14 Trong kết quả nghiên cứu của Tsvetelina Angelova và cộng sự (2014), tác giả đã chế tạo vật liệu Ag – Silica bằng phƣơng pháp sol – gel thủy phân trong môi trƣờng axit với sự có mặt của hydroxyprolyl cellulose (HPC) hoặc hydroxypropyl cellulose methylcellulose (HPMC) và hàm lƣợng của bạc thay đổi từ 0,5 – 2,5% theo khối lƣợng [37]. Từ đó, tác giả sử dụng vật liệu chế tạo đƣợc để nghiên cứu hoạt lực của nó trong kháng nấm Aspergillus niger bằng phƣơng pháp đo vùng ức chế và đếm tế bào. Kết quả thí nghiệm bằng phƣơng pháp đo vùng ức chế cho thấy, sau khi ủ ở nhiệt độ 30oC sau 12 giờ quan sát chƣa thấy có nhiều thay đổi. Tiếp tục ủ sau 36 giờ đã có thể quan sát thấy vùng ức chế và sau 60 giờ, vùng ức chế này đã hình thành rất rõ ràng. Nhìn chung, khi tăng hàm lƣợng bạc, kích thƣớc vùng ức chế lớn hơn tƣơng ứng. Kết quả đo vùng ức chế nấm của tác giả đƣợc thể hiện dƣới bảng sau: Bảng 1.4. Kích thước trung bình của vùng ức chế nấm (mm) của 2 vật liệu SiO2- HPC-Ag và SiO2-HPMC-Ag Hàm lƣợng của nano Ag (% khối lƣợng) 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 Kích thƣớc trung bình vùng ức chế nấm SiO2-HPC-Ag 0 1,33 1,55 2,24 2,34 2,82 SiO2-HPMC-Ag 0 1,32 1,48 2,23 2,25 2,27 So sánh hoạt lực kháng nấm Aspergillus niger dựa vào kích thƣớc vùng ức chế của hai vật liệu trên có thể thấy SiO2-HPC-Ag có hoạt lực cao hơn so với SiO2-HPMC- Ag. Trong thí nghiệm tiếp theo, tác giả sử dụng vật liệu nghiên cứu hoạt lực kháng nấm bằng phƣơng pháp đếm tế bào với hàm lƣợng của Ag thay đổi từ 0,5 – 2,5%. Ở thí nghiệm này cũng có thể thấy rõ ràng rằng so với đối chứng, vật liệu SiO2-HPC-Ag và SiO2-HPMC-Ag đã sử dụng có hoạt tính cao trong việc ức chế quá trình sinh trƣởng của nấm Aspergillus niger. Hơn nữa, khi hàm lƣợng của Ag tăng, hoạt lực kháng nấm của vật liệu càng cao hơn. Đồng ở dạng nano với nồng độ thấp có khả năng kháng khuẩn rất mạnh. Cơ quan bảo vệ Môi trƣờng của Mỹ đã công nhận đồng nano là chất kháng khuẩn để diệt các vi khuẩn gram âm và gram dƣơng. Trong nghiên cứu của Kanhed và cộng sự (2014) đã cho thấy khả năng của các hạt nano đồng đƣợc chế tạo bằng phƣơng pháp khử, kích thƣớc hạt 3 – 10 nm chống lại nấm gây bệnh ở cây trồng nhƣ Phoma 15 destructiva, Curvularia lunata, Alternaria alternata và Fusarium oxysporum [30]. Sahar M Ouda (2014) đồng thời phát hiện nano đồng và nano đồng kết hợp với nano bạc có khả năng kìm hãm và diệt hai loại nấm Uernaria alternata và Botrytis cinere gây bệnh trên nhiều loại cây trồng khác nhau [32]. 1. Phoma distructiva, 2. Curvularia lunanta, 3. Alternaria alternata, 4. Fusarium oxysporum; A. Nano Cu, B. Isopropyl ancohol C. Chất kháng nấm bavistin (50% Carbendazime), D. Nano Cu + bavistin Hình 1.6. Hoạt tính kháng nấm