Luận văn Nghiên cứu chuyển gen ga20 mã hóa enzyme ga20 - Oxidase dưới sự điều khiển của promoter cad4 biểu hiện đặc hiệu ở xylem vào cây xoan ta (melia azedarach l.)

ng quan trọng trong chiến lƣợc phát triển lâm nghiệp ở nƣớc ta.Việc ứng dụng công nghệ sinh học để cải thiện chất lƣợng giống cây Xoan ta là rất cần thiết, có ý nghĩa quan trọng đối với kinh tế lâm nghiệp cũng nhƣ môi trƣờng sinh thái. Trong các hƣớng nghiên cứu chuyển gen tạo giống cây lâm nghiệp sinh trƣởng nhanh, hƣớng nghiên cứu tăng sinh tổng hợp chất điều tiết sinh trƣởng gibberellin (GA) dạng hoạt động là một trong những hƣớng đã thu đƣợc các kết quả tốt nhất. GA là một phytohormone thiết yếu điều khiển nhiều khía cạnh của quá trình tăng trƣởng và phát triển của cây, bao gồm nảy mầm hạt, kích thích ra hoa, kéo dài thân và hình thành gỗ do ảnh hƣởng đến khả năng phân chia và lớn lên của tế bào. GA20 mã hoá cho enzyme GA20-oxidase giữ vai trò chính trong việc điều khiển quá trình sinh tổng hợp GA dạng hoạt động ở tế bào thực vật. Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới về chuyển gen mã hóa cho GA20-oxidase vào các đối tƣợng thực vật khác nhau đã thu đƣợc kết quả GA20 có tác dụng kéo dài thân và gia tăng sinh khối. Tuy nhiên, một số tác giả nhận thấy sự biểu hiện quá mức của GA20 dƣới sự điều khiển của promoter cơ định mang lại những tính trạng bất lợi cho cây nhƣ giảm kích thƣớc lá và sự phát triển của rễ. Việc sử dụng promoter đặc hiệu mô, điều khiển hoạt động của gen đặc hiệu ở mô/cơ quan trong chuyển gen có khả năng khắc phục những nhƣợc điểm này. CAD4 là promoter của gen mã hóa cho enzyme Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase, đƣợc phân lập từ cây Dƣơng lai (Populus trichocarpa). Các nghiên cứu trƣớc đây đã chứng minh sự đặc hiệu xylem của CAD4. Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 2 Trên thế giới và tại Việt Nam, một số công trình nghiên cứu về chuyển gen vào Xoan ta đã đƣợc công bố nhƣ chuyển gen chỉ thị, gen tăng chất lƣợng gỗ hoặc gen kháng lại điều kiện bất lợi của môi trƣờng. Có rất ít các nghiên cứu về chuyển gen mã hóa cho GA dạng hoạt động vào Xoan ta, cho đến nay chỉ có một nghiên cứu duy nhất về chuyển gen mã hóa cho GA20-oxidase dƣới sự điều khiển của promoter cơ định 35S vào đối tƣợng thực vật này. Xuất phát từ các cơ sở trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu chuyển gen GA20 mã hóa enzyme GA20-oxidase dƣới sự điều khiển của promoter CAD4 biểu hiện đặc hiệu ở xylem vào cây xoan ta (Melia azedarach L.)”. Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 3 Chƣơng 1 - TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về cây Xoan ta Cây Xoan ta có tên khoa học là Melia azedarach L., là một trong các loài cây quan trọng thuộc họ Xoan (Meliaceae), bộ Bồ hòn (Sapindales), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta). Họ Xoan có khoảng 50 chi và 550 loài, có nguồn gốc từ phƣơng Đông, đặc biệt là ở Việt Nam, Iran, Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản, và phân bố khắp miền nhiệt đới [1]. Hình 1.1: Cây Xoan ta (Melia azedarach L.) [68] Về đặc điểm hình thái, Xoan ta là cây gỗ lớn, chiều cao có thể đạt tới 30m và đƣờng kính gần 100cm. Thân cây khá thẳng, tán lá thƣa, vỏ màu xám nâu, nứt hoặc rạn dọc, lúc non thƣờng có đốm xếp vòng quanh thân. Lá kép lông chim 2 - 3 lần, mọc cách. Lá chét mép có răng cƣa. Hoa đều, lƣỡng tính, màu tím nhạt, hợp thành cụm hình chùy ở nách lá phía đầu cành, có mùi thơm hắc, bầu nhụy có 5 - 6 ô. Quả hạch dài 1 - 2cm khi chín màu vàng, qua đông trên cành sang mùa Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 4 xuân mới rụng, vỏ trong hóa gỗ cứng có 5-6 ô, mỗi ô chứa một hạt. Gỗ xoan ta thuộc nhóm V, có lõi màu hồng hay nâu nhạt, giác xám trắng, gỗ nhẹ mềm. Gỗ xoan ta sau khi ngâm khá bền, không bị mối mọt nên thƣờng đƣợc dùng trong xây dựng, đóng đồ gia dụng, trang trí nộ i thất và điêu khắc [1]. Cây Xoan ta có mặt ở 6/9 vùng sinh thái lâm nghiệp, trong đó có vùng Trung tâm, vùng Đồng bằng Sông Hồng và vùng Nam Trung Bộ cây Xoan ta đứng đầu trong danh mục các cây trồng đƣợc ƣu tiên phát triển trong giai đoạn 2006- 2020 theo quyết định số 62/2006/QĐ-BNN ngày 16/08/2006 của Bộ trƣởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn [5]. Vì vậy, Xoan ta đƣợc đánh giá là một trong những cây trồng quan trọng trong chiến lƣợc phát triển lâm nghiệp ở nƣớc ta. Việc ứng dụng công nghệ sinh học để cải thiện chất lƣợng giống cây Xoan ta là rất cần thiết. Đối với cây lâm nghiệp nói chung và cây Xoan ta nói riêng, tốc độ sinh trƣởng và sản lƣợng gỗ là mối quan tâm hàng đầu. Một trong những hƣớng chuyển gen với mục tiêu chọn tạo giống cây lâm nghiệp sinh trƣởng nhanh đƣợc sử dụng phổ biến và thu đƣợc các kết quả tốt nhất là chuyển gen tăng sinh tổng hợp chất điều tiết sinh trƣởng gibberellin dạng hoạt động. 1.2. Chất điều tiết sinh trƣởng gibberellin (GA) và vai trò của GA20- oxidase trong quá trình tổng hợp GA dạng hoạt động 1.2.1. Giới thiệu chung về GA và con đƣờng sinh tổng hợp GA dạng hoạt động GA là các hợp chất sinh trƣởng thuộc dạng diterpenes có vai trò quan trọng trong việc điều hòa quá trình sinh trƣởng và có ảnh hƣởng đến các quá trình phát triển khác nhau ở thực vật bao gồm sự nảy mầm của hạt, sinh trƣởng của thân, ra hoa và tạo quả [15; 29; 49; 63; 64]. GA cũng đƣợc biết đến với vai trò kích thích phân chia tế bào ở tầng phát hiện và tăng trƣởng nhanh chóng của các sợi xylem kéo dài [20]. Ragni và cộng sự (2011) báo cáo rằng GA hoạt động nhƣ một tín hiệu dẫn truyền đƣợc vận Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 5 chuyển từ rễ đến tầng sinh gỗ để thúc đẩy sự tăng sinh mạch gỗ khi bắt đầu ra hoa [52]. Cho đến nay đã xác định đƣợc hơn 136 chất thuộc nhóm này, tuy nhiên chỉ một vài chất là có hoạt tính sinh học, ví dụ nhƣ GA1 và GA4 [64; 65]. Hàm lƣợng GA có hoạt tính cao nhất thông thƣờng ở những bộ phận đang lớn, ví dụ nhƣ các lá cây đang phát triển và các lóng thân đang dài ra. Những bộ phận này có mức độ biểu hiện cao của các gen tổng hợp GA, dẫn đến sự sinh tổng hợp GA dạng hoạt động [29]. Con đƣờng sinh tổng hợp GA dạng hoạt động đã đƣợc nghiên cứu trong thời gian dài và rất nhiều gen mã hóa cho các enzyme tham gia vào con đƣờng này đã đƣợc xác định [29; 30; 50]. GA đƣợc tổng hợp từ geranylgeranyl diphosphate (GGDP), một phân tử tiền chất của diterpenoid. Ba nhóm enzyme cần thiết cho quá trình tổng hợp GA dạng hoạt động từ GGDP ở thực vật bao gồm: terpene synthase (TPSs), cytochrome P450 monooxygenase (P450s) và dioxygenase phụ thuộc 2-oxoglutarate (2ODD). Hai TPSs là ent-copalyl diphosphate synthase (CPS) và ent-kaurene synthase (KS) tham gia vào quá trình chuyển hóa GGDP thành ent-kaurene (tetracylic hydrocarbon trung gian). Ent- kaurene sau đó đƣợc chuyển hóa thành GA12 bởi 2 P450s. Ent-kaurene oxidase (KO) xúc tác cho sự oxy hóa C-19 thành ent-kaurenoic acid, sau đó đƣợc biến đổi thành GA12. GA12 đƣợc chuyển hóa thành GA4 dạng hoạt động, thông qua việc oxy hóa liên tiếp C-20 và C-3 tƣơng ứng bởi hai ODDs tan là GA20-oxidase và GA3-oxidase. GA12 cũng là cơ chất của GA13-oxidase tạo ra sản phẩm là GA53, GA53 thông qua con đƣờng 13-hydroxylate sẽ đƣợc chuyển hóa thành GA1 là dạng hoạt động [64; 65] (Hình 1.2). Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 6 Hình 1.2: Con đƣờng sinh tổng hợp GA [64] Duy trì sự biểu hiện của GA dạng hoạt động ở mức toàn bộ cơ thể/ chỉ trên một số mô cơ quan nhất định một cách phù hợp và điều khiển sự đáp ứng của các loại mô khác nhau đối với GA có vai trò quan trọng đối với sự sinh trƣởng và phát triển của thực vật. Những nghiên cứu gần đây trên Arabidopsis, lúa nƣớc (Oryza sativa), lúa mạch đã chỉ ra những yếu tố điều hòa của những con đƣờng nhận biết tín hiệu GA [26; 49]. Bên cạnh đó, rất nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng sự tổng hợp GA đƣợc điều khiển thông qua sự điều hòa tổng hợp các ODD. Nghiên cứu về đột biến gen GA và cây đƣợc xử lý với chất hóa học nhằm ức chế tổng hợp GA đã cho thấy mức độ phiên mã của gen mã hóa cho GA20-oxidase GA3-oxidase tăng lên, trong khi mức độ dịch mã của gen mã hóa cho GA2- Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 7 oxidase giảm đi đáp ứng với nồng độ GA giảm xuống [34; 35; 50]. Ngƣợc lại, thực vật khi đƣợc xử lý với GA dạng hoạt động cho thấy sự giảm mức độ phiên mã của của gen mã hóa cho GA20-oxidase GA3-oxidase, tăng phiên mã của gen mã hóa cho GA2-oxidase [50, 64]. Sự tƣơng tác của các tín hiệu GA và sự tổng hợp cũng đƣợc chứng minh bằng các nghiên cứu về đột biến gen tín hiệu GA. Ví dụ, đột biến gai tăng cƣờng mức độ biểu hiện GA dạng hoạt động và phiên mã của gen mã hóa cho GA20-oxidase [34]. 1.2.2. Vai trò của GA20-oxidase đối với quá trình sinh tổng hợp GA Điều hòa quá trình sinh tổng hợp GA dạng hoạt động có ý nghĩa vô cùng quan trọng đối với sự phát triển của thực vật và khả năng đáp ứng của cây trƣớc điều kiện môi trƣờng [29]. Trong số các gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp GA dạng hoạt động, gen mã hoá cho GA20-oxidase (GA20) nắm giữ vai trò chính trong việc điều khiển quá trình này. GA20-oxidase xúc tác cho sự chuyển hoá GA12/GA53 thành GA9/GA20 thông qua ba phản ứng oxy hoá khử liên tiếp, mà GA9/GA20 lại là tiền chất trực tiếp để tạo thành GA1/GA4 có hoạt tính sinh học [22]. Tăng cƣờng sự tổng hợp GA20 dẫn đến mức độ tổng hợp GA dạng hoạt động tăng lên. Ở cây dƣơng, khi chuyển gen tăng cƣờng biểu hiện GA20 dƣới sự điều khiển của promoter cơ định 35S dẫn đến mức độ biểu hiện của GA dạng hoạt động tăng lên gấp 20 lần, làm tăng tốc độ sinh trƣởng và kéo dài thân [20]. Ngƣợc lại, một số nghiên cứu trên các loài thực vật khác nhau đã cho thấy đột biến tắt gen này gây ra hiện tƣợng đột biến ―lùn‖ ở cây lúa; khoai tây [11, 21]. Các nghiên cứu gần đây về tách dòng gen mã hóa cho enzyme sinh tổng hợp GA mở ra triển vọng cải biến sự biểu hiện của chúng trong cây chuyển gen để nghiên cứu về chức năng và cơ chế điều hòa. Gen mã hóa cho enzyme đa chức năng GA20-oxidase đã đƣợc tách dòng từ nhiều loài khác nhau nhƣ bí ngô, Arabidopsis, đậu, thuốc lá, khoai tây và dƣơng...[42, 66] Coles và cộng sự (1999) đã tăng cƣờng biểu hiện gen mã hóa cho enzyme GA20-oxidase trong cây Arabidopsis thaliana và nhận thấy các cây chuyển gen Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 8 nở hoa sớm hơn và chiều dài thân cao hơn so với cây đối chứng. Trong khi đó ở những cây chuyển gen ức chế hoạt động của enzyme này cho kết quả ngƣợc lại [36]. Chính vì vậy, việc sử dụng các phƣơng pháp sinh học nhằm tăng cƣờng sinh tổng hợp GA dạng hoạt động ở các loài cây lâm nghiệp sẽ là một hƣớng nghiên cứu triển vọng trong việc tạo giống cây lâm nghiệp sinh trƣởng nhanh. Khi tăng cƣờng biểu hiện gen mã hóa cho GA20-oxidase ở cây dƣơng chuyển gen, sự sinh trƣởng kéo dài của lóng thân và tăng sinh khối gỗ đã đƣợc ghi nhận [11, 21, 35-37]. Nghiên cứu chi tiết về sự biểu hiện gen trong quá trình hình thành gỗ của cây chuyển gen tăng cƣờng tổng hợp GA20-oxidase cho thấy mức độ phiên mã cao nhất xảy ra trong giai đoạn đầu của quá trình biệt hóa xylem [35, 36]. Đặc tính kéo dài thân của các dòng chuyển gen tăng cƣờng mã hóa GA20-oxidase tƣơng quan tỷ lệ thuận với hiệu suất quang hợp [8], ra hoa sớm và giảm kích thƣớc lá [37]. Cụ thể, cây Dƣơng lai chuyển gen tăng cƣờng mã hóa GA20-oxidase có tốc độ sinh trƣởng tăng lên cùng với sự hình thành sinh khối gỗ . Vùng xylem của những cây chuyển gen này có chiều dài sợi gỗ tăng lên 8% so với cây không chuyển gen [20]. Do và cộng sự (2015) đã nghiên cứu chuyển gen GA20 dƣới sự điều khiển của promoter cơ định 35S vào cây Panicum virgatum L. và thu đƣợc kết quả dòng chuyển gen có lá, ngọn và thân dài hơn, với khối lƣợng khô tăng lên gấp 2 lần so với dòng không chuyển gen [17]. Tuy nhiên, biểu hiện quá mức GA20 dƣới sự điều khiển của promoter cơ định có thể gây nên các tính trạng bất lợi cho cây. Cây dƣơng chuyển gen mã hóa GA20-oxidase cho thấy biểu hiện ra rễ kém gây trở ngại trong quá trình chuyển cây ra môi trƣờng đất [20]. Cũng trên đối tƣợng này, Jeon và cộng sự (2016) khi tiến hành chuyển cấu trúc 35S::PdGA20 và DX15::GA20 đã nhận thấy cây dƣơng chuyển gen điều khiển bởi promoter cơ định 35S có các kiểu hình không mong muốn nhƣ lá kém phát triển, trong khi cây chuyển gen GA20 điều khiển bởi promoter DX15- một loại promoter đặc hiệu vùng xylem - không mang những kiểu Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 9 hình bất lợi này [37]. Do đó, việc sử dụng promoter đặc hiệu nhằm mục đích kiểm soát mức độ biểu hiện của GA20 ở một số mô, cơ quan nhất định là rất cần thiết. 1.3. Giới thiệu chung về promoter đặc hiệu và promoter đặc hiệu xylem CAD4 1.3.1. Promoter đặc hiệu Mức độ biểu hiện của gen ở sinh vật nhân sơ cũng nhƣ ở sinh vật nhân chuẩn đƣợc quyết định bởi một trình tự DNA upstream đặc hiệu gọi là promoter. Quá trình phiên mã đƣợc bắt đầu khi protein nhận biết trình tự DNA đặc hiệu của promoter, dẫn đến hoạt động của RNA polymerase. Promoter điều khiển biểu hiện của gen thông qua các trình tự nhận biết tƣơng tác với phức hợp khởi đầu phiên mã và nhiều nhân tố phiên mã khác. Các trình tự nhận biết này thƣờng bao gồm một promoter lõi với trình tự tăng cƣờng upstream nằm gần với phần cấu trúc của gen. Phiên mã có thể đƣợc kích hoạt bởi những trình tự tăng cƣờng (enhancer) độc lập về vị trí, khoảng cách hoặc hƣớng của chúng đối với promoter. Promoter đƣợc chia thành hai vùng: vùng lõi promoter và vùng điều khiển upstream. Lõi promoter gồm một chuỗi 50-100 bp nằm gần điểm khời đầu phiên mã, tƣơng tác với các yếu tố phiên mã và đảm bảo việc khởi đầu phiên mã chính xác bởi RNA polymerase II. Lõi promoter bao gồm hai yếu tố di truyền quan trọng là hộp TATA (hiện diện trong hầu hết các promoter) và hoặc một yếu tố khời đầu (Inr) nằm chồng lên điểm khởi đầu phiên mã. Vùng promoter ngƣợc dòng gồm 1-2 kb hoặc hơn bao gồm nhiều nhân tố cis đóng vai trò nhƣ các vùng gắn cho sự điều khiển biểu hiện gen đặc hiệu. Theo khả năng biểu hiện, promoter đƣợc chia làm hai loại chính: promoter không đặc hiệu hay còn gọi là promoter cơ định và promoter đặc hiệu bao gồm promoter đặc hiệu mô tế bào, đặc hiệu giai đoạn phát triển và promoter cảm ứng. Promoter đặc hiệu mô tế bào là loại promoter điều khiển gen biểu hiện đặc hiệu ở các mô trong cơ thể. Có rất nhiều promoter đặc hiệu với các loại mô khác nhau đã đƣợc phân lập và nghiên cứu trong việc tạo cây trồng chuyển gen nhƣ promoter biểu hiện đặc hiệu rễ, hoa, hạt và mạch dẫn. Hormone hoặc stress phi Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 10 sinh học có thể điều khiển sự hoạt động của các promoter đặc hiệu mô tế bào. Tuy nhiên một số promoter đặc hiệu mô tế bào có thể hoạt động ở mức độ thấp hoặc kém đặc hiệu, đặc biệt là khi chúng điều khiển biểu hiện gen ở một loài khác xa di truyền. Promoter đặc hiệu mạch dẫn bao gồm promoter đặc hiệu phloem và promoter đặc hiệu xylem. Chuyển gen vào thực vật sử dụng promoter đặc hiệu phloem/xylem cho phép gen đích biểu hiện đặc hiệu ở mạch dẫn và là một biện pháp đầy hứa hẹn trong việc kiểm soát các bệnh ở hệ mạch [19]. Một số promoter đặc hiệu xylem đã đƣợc nghiên cứu nhƣ promoter GRP 1.8 (từ cây Đậu Pháp), PAL (từ cây Cải dầu), CsPP (từ cây Chanh), CAD4 (từ cây Dƣơng lai) [6; 18; 41]. 1.3.2. Promoter đặc hiệu xylem CAD4 Gen CAD4 đƣợc phân lập từ cây Dƣơng lai (Populus trichocarpa - P. trichocarpa) [6; 41- 43]. CAD4 là một trong những gen mã hóa cho Cinamyl Alcohol Dehydrogenase (CAD) – enzyme đóng vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp lignin. Trong các thành phần cấu tạo nên thành tế bào xylem thứ cấp, lignin đƣợc coi là một trong những thành phần quan trọng nhất, chiếm từ 15-35% khối lƣợng khô của cây. Lignin tạo nên sự vững chắc, tính không thấm và chống lại sự phân hủy sinh học [40]. Lignin đƣợc tìm thấy trong hầu hết những cây có mạch, có chức năng điều khiển sự vận chuyển các chất trong thực vật (một phần tham gia vào việc giữ vững cho thành tế bào, mặt khác tham gia điều chỉnh sự vận chuyển của chất lỏng), cho phép cây lớn lên và cạnh tranh để giành ánh sáng mặt trời [7]. Lignin có cấu trúc phức tạp, là một polyphenol có mạng không gian mở. Thành phần thay đổi theo từng loại gỗ, tuổi cây hoặc vị trí của nó trong cấu trúc gỗ. CAD xúc tác cho phản ứng khử ba loại hydroxy-cinnamaldehydes(p- coumaraldehyde, coniferaldehyde, sinapaldehyde) để tạo thành các ancol hydroxy-cinnamyl tƣơng ứng, các tiền chất trực tiếp của lignin [58]. Ở cây một lá mầm và cây hai lá mầm, hoạt động của CAD đƣợc điều hòa tăng cƣờng bởi các stress sinh học và phi sinh học . CAD đƣợc mã hóa bởi một họ gen, trình tự đầy Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 11 đủ của họ gen này cho đến nay đã đƣợc xác định trong hệ gen của một số cây mô hình nhƣ Arabidopsis, Oryza; Populus cũng nhƣ một số loài khác [6, 40, 58]. Trong các thành viên thuộc họ gen CAD phân lập từ cây dƣơng, gen mã hóa cho CAD4 đƣợc xem là gen CAD quan trọng nhất trong con đƣờng tổng hợp lignin dựa vào cây phát sinh loài và các nghiên cứu biểu hiện [6, 9]. Cây dƣơng chuyển gen với sự giảm hoạt động của CAD4 đã thể hiện sự biến đổi cấu trúc của lignin, do đó xác nhận lại vai trò quan trọng của CAD4 trong quá trình tổng hợp lignin [40]. Barakat và cộng sự (2009) khi nghiên cứu về mức độ biểu hiện của 15 gen CAD phân lập từ cây Dƣơng bằng phản ứng định lƣợng RT-PCR đã thu đƣợc kết quả CAD4 biểu hiện mạnh ở vùng xylem, gấp 100 lần mức độ biểu hiện ở xylem của các gen CAD còn lại nhƣng lại biểu hiện yếu ở các bộ phận khác nhƣ lá, vỏ cây và cuống lá [6]. Sự biểu hiện đặc hiệu xylem của CAD4 là do promoter CAD4 quy định. Lê Thị Vân Anh và cộng sự (2015) khi nghiên cứu sự điều khiển biểu hiện gen GUS của CAD4 (pPtCAD4 trong nghiên cứu) trên cây Dƣơng lai (P. trichocarpa) đã thu đƣợc kết quả biểu hiện mạnh của GUS ở vùng xylem (mức độ biểu hiện của GUS ở các bộ phận khác nhau của cây Dƣơng chuyển gen đƣợc thể hiện trong Hình 1.3, màu đỏ thể hiện mức độ cao hơn màu vàng). Tác giả cũng chuyển gen PtIREG1- GFP (chống chịu kim loại Nikel) dƣới sự điều khiển của CAD4 vào cây Dƣơng lai và thu đƣợc kết quả ở các dòng chuyển gen, PtIREG1-GFP biểu hiện đặc hiệu ở mô gỗ, mức độ biểu hiện cao từ 12-28 lần so với cây không chuyển gen nhƣng thấp hơn so với các dòng chuyển cùng gen đích dƣới sự điều khiển của promoter cơ định [41]. Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 12 Hình 1.3: Mức độ biểu hiện của gus dƣới sự điều khiển của promoter CAD4 trong các mô và cơ quan khác nhau [41] Sau khi lựa chọn đƣợc promoter thích hợp để điều khiển biểu hiện của gen chuyển theo mục đích mong muốn, việc sử dụng phƣơng pháp chuyển gen và vector chuyển gen phù hợp là vô cùng quan trọng. Để chuyển gen vào thực vật, một trong những phƣơng pháp hữu hiệu đƣợc sử dụng phổ biến hiện nay là phƣơng pháp chuyển gen gián tiếp vào thực vật thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. 1.4. Tình hình nghiên cứu về tạo giống cây lâm nghiệp biến đổi gen và nghiên cứu chuyển gen vào cây Xoan ta 1.4.1. Tình hình nghiên cứu về tạo giống cây lâm nghiệp biến đổi gen Trong những năm gần đây, với sự phát triển nhanh chóng của các kỹ thuật sinh học phân tử, nhiều quá trình sinh lý của thực vật liên quan đến sinh trƣởng và phát triển đã đƣợc nghiên cứu một cách cặn kẽ, nhiều thông tin thu đƣợc đã góp phần tạo ra các ứng dụng to lớn trong cải thiện giống cây trồng nói chung và cây lâm nghiệp nói riêng. Nhiều gen chìa khóa tham gia vào điều khiển tăng trƣởng đã đƣợc phân lập, thiết kế với các promoter mạnh và chuyển vào một số Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 13 cây trồng, kết quả thu đƣợc rất khả quan. Các hƣớng nghiên cứu chính trong chuyển gen vào cây lâm nghiệp bao gồm chuyển gen tăng cƣờng khả năng chống chịu các điều kiện môi trƣờng bất lợi, kháng sâu bọ, cải thiện hàm lƣợng cellulose và lignin... Một trong những hƣớng nghiên cứu gần đây đƣợc quan tâm nhất đó là chuyển gen liên quan đến sự hình thành gỗ nhằm mục tiêu cải thiện chất lƣợng gỗ. Các loại hormone có vai trò điều hòa nhiều quá trình sinh trƣởng và phát triển của thực vật trong đó có sinh trƣởng thân và ra hoa. Chuyển gen mã hóa cho các loại hormone để tăng cƣờng sự sinh trƣởng của thân là một hƣớng nghiên cứu đầy triển vọng nhằm mục đích thay đổi các đặc điểm hình thái và giải phẫu ở cây trồng. Tiêu biểu là gen GA20 mã hóa cho enzyme đa chức năng GA20 oxidase là enzyme chìa khóa trong điều hòa sinh tổng hợp gibberellin có hoạt tính kích thích sự biệt hóa và kéo dài mạch xylem làm cây thân gỗ tăng trƣởng về chiều cao và đƣờng kính. Một trong các công trình tiêu biểu là chuyển gen GA20 vào cây Dƣơng lai, kết quả cho thấy tất cả các dòng chuyển gen đều có tốc độ sinh trƣởng nhanh và sinh khối tăng cao hơn so với cây đối chứng không chuyển gen, ở chồi khối lƣợng khô tăng 64%, ở thân tăng 126% [8; 37]. Gen GS1 (cytosolic glutamine synthetase) mã hóa cho octamer protein/enzyme tham gia vào quá trình sinh tổng hợp glutamine từ glutamic acid và NH4 +, tăng cƣờng khả năng hấp thu và tái sử dụng hiệu quả nguồn nitơ (GS; EC 6.3.1.2). Gallardo và cộng sự (1999) đã chuyển cấu trúc gen GS1 dƣới sự điều khiển của promoter 35S vào cây Dƣơng lai, kết quả cho thấy cây chuyển gen sinh trƣởng nhanh hơn so với cây đối chứng là 76% (cây 2 tháng tuổi) và 21,3% (cây 6 tháng tuổi) [24]. Nghiên cứu chuyển gen vào cây rừng đã đƣợc thực hiện ở nhiều nƣớc trên thế giới nhƣ Singapore, Trung Quốc, Đài Loan, Australia, Brazil, Ấn Độ, ... Nếu nhƣ vào năm 1996 cây nông nghiệp biến đổi gen chính thức đƣợc trồng thƣơng mại hoá, thì đến năm 2002, Trung Quốc là nƣớc duy nhất đã có 2 loài cây lâm Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 14 nghiệp biến đổi gen đƣợc trồng thƣơng mại hoá. Đó là cây dƣơng (P. nigra) chuyển gen Bt kháng côn trùng ăn lá đƣợc trồng khảo nghiệm trên 80 hecta vào năm 1999 và trồng thƣơng mại 200-300 hecta vào năm 2002; cây dƣơng lai 741(P. alba X [P. davidiana + P. simonii] X P. tomentosa) chuyển gen Cry1A(c) và API kháng côn trùng ăn lá đƣợc trồng khảo nghiệm năm 2001 và trồng thƣơng mại năm 2003. Tại Mỹ, có khoảng 124 giống cây trồng chuyển gen đang đƣợc trồng thử nghiệm. Các giống cây lâm nghiệp chuyển gen cải thiện khả năng hình thành gỗ (tăng tốc độ sinh trƣởng, cải thiện hàm lƣợng cellulose) ngày càng đƣợc quan tâm nghiên cứu, trồng khảo nghiệm và sớm đƣa vào thƣơng mại hóa [21; 56]. 1.4.2. Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào cây Xoan ta Trên thế giới và ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu về đặc điểm lâm sinh học, công dụng của Xoan ta đối với con ngƣời và môi trƣờng sinh thái nhƣng các nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học để cải tiến chất lƣợng giống cây Xoan ta lại chƣa đƣợc quan tâm đúng mức. Đã có một số công trình trong và ngoài nƣớc nghiên cứu về tái sinh cây Xoan ta bằng nuôi cấy in vitro [2;3]. Tuy nhiên, các nghiên cứu này mới chỉ tập trung vào việc xây dựng quy trình tái sinh in vitro phục vụ bảo tồn, nhân giống vô tính, chọn lọc dòng tế bào biến dị soma chịu mặn và công tác chuyển gen. Số lƣợng công trình công bố về chuyển gen cải thiện giống cây Xoan ta còn rất ít. Trên thế giới mới chỉ có duy nhất một công trình công bố về chuyển gen chỉ thị (gen GFP) và gen chọn lọc kanamycin (gen nptII) vào cây Xoan ta) [46]. Ở Việt Nam cũng đã có một số công trình công bố về chuyển gen vào cây Xoan ta: chuyển gen chỉ thị (gen gus) và gen chọn lọc chất diệt cỏ PPT (gen bar) [2]; chuyển gen 4Cl tăng chất lƣợng gỗ [45]; chuyển gen codA, P5CSm tăng cƣờng khả năng chống chịu các điều kiện bất thuận của môi trƣờng. Các kết quả nghiên cứu này là tiền đề quan trọng để cải thiện giống cây Xoan ta hiện nay. Trƣớc những công dụng to lớn của cây Xoan ta đối với nền kinh tế lâm nghiệp, việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học nhằm tạo các giống Xoan ta Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 15 có khả năng sinh trƣởng nhanh rất có ý nghĩa. Dựa trên cơ sở của các nghiên cứu chuyển gen vào Xoan ta và các nghiên cứu chuyển gen mã hóa cho GA dạng hoạt động (ví dụ nhƣ GA20) thông qua vi khuẩn A. tumefaciens trƣớc đây, chúng tôi thực hiện nghiên cứu chuyển gen GA20 dƣới sự điều khiển của promoter CAD4 đặc hiệu xylem vào cây Xoan ta nhằm đánh giá ảnh hƣởng của gen chuyển đối với khả năng sinh trƣởng của cây Xoan ta, phục vụ cho công tác tạo các dòng Xoan ta sinh trƣởng nhanh và cho sinh khối gỗ lớn. Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Lê Mộng Chân, Lê Thị Huyên (2000), Thực Vật rừng, NXB. Nông nghiệp. 2. Đỗ Xuân Đồng, Bùi Văn Thắng, Hồ Văn Giảng, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2011), ―Nghiên cứu chuyển gen mã hóa gibberellin 20-oxidase vào cây Xoan ta (Melia azedarach L.) bằng Agrobacterium tumefaciens‖, Tạp chí Công nghệ sinh học, 9 (2): 217-222. 3. Bùi Văn Thắng, Hà Văn Huân, Nguyễn Văn Việt, Hồ Văn Giảng (2007), ―Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây Xoan ta (Melia azedarach L.) phục vụ cho chuyển gen‖, NXB KH&KT, Hội nghị Khoa học toàn quốc về Nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống. 4. Hồ Văn Giảng, Hà Văn Huân, Vũ Kim Dung, Chu Hoàng Hà, Bùi Văn Thắng (2011), ―Tạo giống Xoan ta (Melia azedarach L.) sinh trƣởng nhanh bằng kỹ thuật chuyển gen‖, T