Luận văn Nghiên cứu đặc điểm kháng kháng sinh và gen liên quan ở các chủng salmonella đa kháng

ứu của Kim và cộng sự, 2012 khi nghiên cứu Salmonella kháng kháng sinh phân lập được ở thịt gà ở Hàn Quốc [77]. Từ các kết quả trên có thể nhận định rằng kiểu hình kháng kháng sinh phổ biến là khác nhau giữa các nghiên cứu. Việc xác định kiểu hình kháng kháng sinh ở các mẫu nghiên cứu là quan trọng. Kết quả kiểu hình này kết hợp với kết quả giải trình tự và kết quả phân tích tin sinh học sẽ cho biết gen nào liên quan và gen nào không liên quan cũng 68 như các đột biến gen liên quan đến kháng kháng sinh. Từ kết quả kiểu hình ở bảng 3.9, chúng tôi đã xác định được 9 chủng Salmonella đa kháng kháng sinh. Danh sách Salmonella đa kháng kháng sinh được trình bày trong bảng 3.10. Bảng 3.10. Danh sách Salmonella đa kháng kháng sinh Ký hiệu Tên chủng Nguồn phân lập Sal 5.1 S. Meleagridis Thịt lợn Sal 6 S. Derby Thịt lợn Sal 7 S. Give Thịt lợn Sal 11 S. Typhimurium S384 Thịt lợn Sal 12 S. Typhimurium S181 Thịt lợn Sal 1 S. Warragul Thịt gà Sal 4 S. Indiana Thịt gà Sal 7.1 S. Rissen Thịt gà Sal 8 S. Typhimurium S360 Thịt bò Kết quả bảng 3.10 cho thấy S. Typhimurium phổ biến nhất. Thịt lợn là nguồn phân lập được nhiều Salmonella đa kháng kháng sinh nhất (5 serovar), tiếp theo là thịt gà (3 serovar), ít nhất là thịt bò (1 serovar). Tỷ lệ kháng kháng sinh, tỷ lệ đa kháng, và kiểu hình kháng kháng sinh là khác nhau ở các nghiên cứu đã được công bố. Sự khác biệt này theo một số nhà nghiên cứu thì có thể là do lạm dụng kháng sinh trong điều trị và chăn nuôi, làm tăng áp lực chọn lọc lên vi khuẩn dẫn tới xuất hiện nhiều chủng Salmonella đa kháng kháng sinh khác nhau theo vùng địa lý [37]. Việc phát hiện ra tỷ lệ kháng kháng sinh cao trong các mẫu trong nghiên cứu này cho thấy rằng cần phải có cảnh báo về việc gia tăng sử dụng kháng sinh trong điều trị hoặc dự phòng. Điều này có thể gây ra áp lực chọn lọc, làm xuất hiện các chủng Salmonella kháng kháng sinh trong thực phẩm. Các nghiên cứu trên thế giới cho thấy các chủng Salmonella phân bố khác nhau theo quốc gia, theo nguồn bệnh. Tỷ lệ kháng kháng sinh và đa kháng kháng sinh cũng khác nhau theo các vùng địa lý. Vì vậy việc tiến hành nghiên 69 cứu tỷ lệ nhiễm Salmonella ở thực phẩm và đặc điểm kháng kháng sinh của chúng là hoàn toàn hợp lý và cần thiết. Kết quả nghiên cứu này có thể hữu ích trong việc xây dựng các mô hình đánh giá nguy cơ và ngăn ngừa lây truyền Salmonella từ thực phẩm sang người ở Việt Nam. Các kết quả nghiên cứu của chúng tôi nhấn mạnh sự cần thiết phải giám sát chặt chẽ tình hình sử dụng kháng sinh nhằm theo dõi tỷ lệ và xu hướng kháng kháng sinh ở các chủng Salmonella, nâng cao nhận thức và giúp thúc đẩy các biện pháp bảo vệ và làm giảm tỷ lệ kháng kháng sinh trong tương lai. 3.3. Kết quả phân tích các nhóm gen ở một số chủng Salmonella đa kháng kháng sinh Giải trình tự hệ gen phiên mã hiếm khi được sử dụng để xác định các gen kháng kháng sinh ở vi khuẩn. Thay vào đó, người ta thường sử dụng giải trình tự DNA toàn bộ hệ gen. Việc giải trình tự hệ gen phiên mã cho phép nghiên cứu chức năng của các gen tốt hơn so với giải trình tự DNA. Trong nghiên cứu này chúng tôi muốn tập trung nghiên cứu hệ gen chức năng của vi khuẩn. Điều này là quan trọng vì các gen không cần thiết sẽ không biểu hiện và có xu hướng mất đi hoặc bị thoái biến [78]. Hơn nữa kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen không phân biệt được các gen đã bị bất hoạt trong hệ gen và các chức năng liên quan khác của gen đó (có thể chưa được biết tới). Ngoài ra, theo chúng tôi thì gen biểu hiện sẽ có mối liên quan với kiểu hình, cụ thể ở đây là kiểu hình kháng kháng sinh cao hơn so với gen không biểu hiện. Chúng tôi đã thực hiện giải trình tự hệ gen phiên mã của vi khuẩn Salmonella đa kháng kháng sinh phân lập được từ thực phẩm giống như phương pháp mà tác giả Marcelino và cộng sự đã công bố. Theo đó, mẫu vi khuẩn từ ruột chim ở Australia được lấy bằng tăm bông vô trùng và lưu trong hỗn dịch vận chuyển mẫu chuyên dụng VTM (viral transport media). VTM gồm các thành phần như canh thang BHI và các kháng sinh penicillin, streptomycin, gentamicin, và amphotericin B. VTM là dung dịch vận chuyển mẫu chuẩn được sử dụng để thu thập mẫu ở các vụ dịch cúm gia cầm. Dung dịch này sẽ tiêu diệt, ức chế hoặc làm giảm bớt số lượng các loài vi khuẩn nhạy cảm với kháng sinh 70 trên. Các kháng sinh này được sử dụng cho mục đích vận chuyển, không phải mục đích là để tạo áp lực với vi khuẩn mặc dù chúng có thể làm tăng biểu hiện của các gen kháng kháng sinh đối với các loài vi khuẩn phân lập được. Kết quả là nhóm nghiên cứu đã xác định được biểu hiện của 81 gen kháng kháng sinh có chức năng đề kháng 9 nhóm kháng sinh khác nhau, gồm các nhóm β-lactam, phenicol, quinolone, tetracycline, aminoglycoside, fosfomycin, trimethoprim, sulphonamide, và MLS (macrolides, lincosamide và streptogramin) [79]. Một điều hết sức quan trọng là các gen kháng kháng sinh cũng biểu hiện ở vi khuẩn nhạy cảm với kháng sinh trong điều kiện nuôi cấy thông thường [80]. Do đó trong nghiên cứu này chúng tôi không sử dụng chủng nhạy cảm với kháng sinh để đối chiếu. Thay vào đó chúng tôi sử dụng chính kiểu hình nhạy cảm và đề kháng với từng loại kháng sinh ở các chủng để tham chiếu với nhau. Từ đó rút ra dự đoán gen nào, hoặc đột biến nào có thể liên quan đến kháng kháng sinh ở vi khuẩn này. Để phân tích các nhóm gen ở Salmonella đa kháng kháng sinh, một số serovar đa kháng kháng sinh cần được lựa chọn để giải trình tự toàn bộ hệ gen phiên mã. Tuy nhiên, trong khuôn khổ của luận án này, chúng tôi chỉ lựa chọn 6 chủng theo tiêu chí tỷ lệ nhiễm cao, đề kháng nhiều kháng sinh và theo nguồn phân lập, gồm S. Derby, S. Give, S. Indiana, S. Typhimurium S384, S. Typhimurium S360, và S. Typhimurium S181. Các mẫu trên được tách RNA tổng số, nồng độ RNA được trình bày trong bảng 3.11. Bảng 3.11. Nồng độ RNA tổng số của các mẫu nghiên cứu. Mẫu Sal 4 Sal 6 Sal 7 Sal 8 Sal 11 Sal 12 Nồng độ (ng/µl) 201,3 133,9 54,9 320,7 72,8 279,9 A260/280 1,99 1,95 1,94 1,98 1,96 1,97 Kết quả bảng 3.11 cho thấy các mẫu RNA đều đạt yêu cầu về nồng độ và độ tinh sạch. Do đó chúng tôi tiến hành điện di các mẫu RNA tổng số trên gel agarose 0,8% để kiểm tra độ toàn vẹn. Kết quả được chỉ ra trong hình 3.9. 71 Hình 3.9. Hình ảnh điện di các mẫu RNA tổng số trên gel agarose 0,8%. Kết quả hình 3.9 cho thấy mỗi giếng có hai băng sắc nét tương ứng với vị trí của băng 18S và 28S. Sự xuất hiện của các băng này chứng tỏ RNA không bị phân cắt và mẫu đủ tiêu chuẩn cho thí nghiệm tiếp theo. Các mẫu RNA đạt tiêu chuẩn sẽ được sử dụng để lập thư viện cDNA bằng bộ kit TruSeq RNA Sample Preparation v2 và TruSeq Stranded mRNA Sample Preparation của hãng Illumina. Theo yêu cầu của bộ kit này, mẫu RNA tổng số khi sử dụng thiết lập thư viện phải đạt tiêu chuẩn giá trị toàn vẹn RNA (số RIN: RNA Integrity Number) trên 8,0. Cả sáu mẫu nghiên cứu này đều có giá trị RIN trên 8,0 khi kiểm tra tính toàn vẹn bằng bằng máy Bioanalyzer, kết quả được chỉ ra trong phụ lục 1. Theo đó, tất cả các mẫu cDNA đều đạt tiêu chuẩn để đưa vào máy giải trình tự. 3.3.1. Số lượng trình tự đọc (read) Từ kết quả trình tự thô của 6 mẫu nghiên cứu, chúng tôi tiến hành tinh sạch bằng phần mềm Trimmomatic, kết quả được trình bày trong bảng 3.12. Bảng 3.12. Tóm tắt số lượng trình tự RNA của Salmonella Mẫu Tổng số Read Số read tinh sạch GC (%) Q20 (%) Q30 (%) Sal 4 31,660,664 28,766,408 52,57 97,63 92,17 Sal 6 21,761,926 19,937,432 52,15 97,72 92,41 Sal 7 24,042,496 21,817,352 51,69 97,61 92,12 Sal 8 29,379,152 26,886,172 52,80 97,71 92,39 Sal 11 25,011,400 22,682,108 54,83 97,50 91,79 Sal 12 28,187,848 25,991,170 52,22 97,81 92,65 Chú thích: Sal 4 (S. Indiana), Sal 6 (S. Derby), Sal 7 (S. Give), Sal 8 (S. Typhimurium S360), Sal 11 (S. Typhimurium S384), Sal 12 (S. Typhimurium S181). 72 Từ bảng số liệu 3.12 cho thấy, tổng số có 160.043.486 read được tạo ra, sau khi tinh sạch trình tự bằng phần mềm Trimmomatic, tổng số lượng các read có điểm Q20 thu được là 146.080.642. Số lượng read nhiều nhất là ở Sal 4 (28.766.408) và ít nhất là ở Sal 6 (19.937.432). Trung bình mỗi mẫu có khoảng 24.346.773 read. Các trình tự read có điểm chất lượng Q20 này sẽ được sử dụng để lắp ráp de novo và sử dụng cho các phân tích tiếp theo. 3.3.2. Lắp ráp de novo Các read sau khi tinh sạch được lắp ráp với nhau tạo thành các contig. Các contig này sẽ được lắp ráp de novo để tạo thành hệ gen biểu hiện hoàn chỉnh. Kết quả lắp ráp de novo được trình bày trong bảng 3.13. Bảng 3.13. Kết quả lắp ráp de novo hệ gen biểu hiện của các Salmonella. Kết quả de novo Mẫu Sal 4 Sal 6 Sal 7 Sal 8 Sal 11 Sal 12 Size (bp) 4.695.722 4.775.274 4.955.078 4.920.467 5.123.401 4.863.792 GC (%) 52.1 52 51.9 51.8 51.9 52.1 N50 26.230 24.816 26.289 27.202 22.887 29.202 L50 54 60 63 60 67 54 NC 584 415 457 420 537 453 SCS (bp) 200 201 202 203 200 200 LCS (bp) 96.420 94.231 96.872 91.421 144.621 144.621 MSS (bp) 8.040,6 11.506,7 10.842,6 11.715,4 9.540,8 10.736 Chú thích: SCS (chiều dài contig nhỏ nhất), LCS (chiều dài contig lớn nhất), MSS (kích thước trung bình của trình tự). N50 là giá trị mà tại đó có ít nhất một nửa số contig của hệ gen có chiều dài lớn hơn hoặc bằng giá trị đó [81]. Giá trị N50 đánh giá độ liên tục, toàn vẹn của các contig nhưng không đánh giá được độ chính xác của trình tự [82]. Giá trị L50 là số lượng contig có chiều dài lớn hơn hoặc bằng N50 [83]. Kết quả trình tự tốt là có giá trị N50 cao và L50 thấp [84]. 73 Bảng số liệu 3.13 cho thấy kích thước hệ gen phiên mã của các mẫu nghiên cứu dao động từ 4,69 Mb (Sal 4) đến 5,1 Mb (Sal 11), giá trị GC dao động quanh 52%, giá trị N50 cao và L50 thấp. Kết quả này tương tự với kết quả giải trình tự toàn bộ hệ gen của S. Derby 07CR553 công bố bởi Kérouanton và cộng sự, 2015 [85]. Từ đó có thể kết luận là trình tự của 6 mẫu nghiên cứu trong luận án này có chất lượng tốt. 3.3.3. Chú thích chức năng các gen Để hạn chế việc bỏ sót các gen biểu hiện trong các chủng nghiên cứu, nhiều công cụ phân tích, phát hiện gen đã được sử dụng. Số lượng các gen phát hiện được ở các công cụ này là khác nhau. Kết quả phát hiện các gen của các công cụ này khác nhau là do phương pháp phân tích của chúng khác nhau, và hiện chưa có một phương pháp chuẩn, thống nhất trong việc chú thích các gen được chấp nhận trên thế giới. Mỗi phương pháp chú thích các gen đều có những tiến bộ và hạn chế riêng [86]. Năm 2017, Baek và cộng sự công bố rằng có nhiều gen kích thước nhỏ, mã hóa cho protein có chiều dài dưới 100 amino acid không phát hiện được khi chú thích hệ gen của vi khuẩn [87]. Do đó, cần phải tiến hành các nghiên cứu sâu hơn về các gen trên trong các mẫu nghiên cứu. Warren và cộng sự, 2010 công bố rằng số lượng các gen được tìm thấy bằng các công cụ, phần mềm ít hơn số lượng gen thực tế có trong hệ gen [88]. Vì vậy, việc xác định các gen ở sinh vật prokaryot bằng các công cụ, các phần mềm cần phải được phát triển thêm để dự đoán chính xác các gen trong hệ gen. Số lượng các trình tự mã hóa tìm được bởi các cơ sở dữ liệu khác nhau trong nghiên cứu này được trình bày trong bảng 3.14. 74 Bảng 3.14. Trình tự mã hóa ở 6 mẫu nghiên cứu Cơ sở dữ liệu Số lượng các trình tự mã hóa Sal 4 Sal 6 Sal 7 Sal 8 Sal 11 Sal 12 RAST 4.807 4.917 5.154 5.097 5.357 5.000 PATRIC 4.807 4.917 5.154 5.049 5.357 5.000 BASys 4.973 5.100 5.336 5.253 5.566 5.209 Genious R11 4.400 4.513 5.022 5.207 5.304 5.309 Chú thích: Sal 4 (S. Indiana), Sal 6 (S. Derby), Sal 7 (S. Give), Sal 8 (S. Typhimurium S360), Sal 11 (S. Typhimurium S384), Sal 12 (S. Typhimurium S181). Số liệu ở bảng 3.14 cho thấy, số lượng trình tự mã hóa ở Sal 4, Sal 6, Sal 7, Sal 8, và Sal 11 thu được từ cơ sở dữ liệu BASys là lớn hơn so với trình tự mã hóa thu được ở ba cơ sở dữ liệu còn lại. Với Sal 12 thì trình tự mã hóa lớn nhất thu được là từ kết quả phân tích của phần mềm Geneious R11. 3.3.4. Phân tích các nhóm gen ở các chủng Salmonella nghiên cứu Sử dụng nhiều công cụ tin sinh học khác nhau như RAST, PATRIC 3.5.2, và BASys, Geneious R11, ARG-ANNOT, và CARD chúng tôi thu được kết quả của hệ gen biểu hiện như sau: Ngoài một số lượng rất lớn (chiếm đa số) các gen liên quan đến hoạt động sống của tế bào như: housekeeping gen, các gen liên quan đến quá trình phân chia tế bào, hô hấp tế bào... Chúng tôi đã xác định được các nhóm gen quan trọng biểu hiện ở Salmonella đa kháng như sau: 3.3.4.1. Nhóm gen kháng kháng sinh Để xác định các gen kháng kháng sinh có trong trình tự de novo của sáu mẫu nghiên cứu, chúng tôi đã sử dụng các công cụ ResFinder, ARG-ANNOT, CARD, PATRIC 3.5.2. Kết quả tóm tắt các gen kháng kháng sinh và kiểu hình kháng kháng sinh được trình bày trong bảng 3.15 và danh sách chi tiết các gen kháng kháng sinh được trình bày trong bảng 3.16. 75 Bảng 3.15. Kết quả tóm tắt các gen kháng kháng sinh và kiểu hình kháng kháng sinh ở các mẫu nghiên cứu KS Mẫu nghiên cứu (Kiểu hình kháng kháng sinh/gen kháng kháng sinh) Sal 4 Sal 6 Sal 7 Sal 8 Sal 11 Sal 12 AM (R) blaOXA-1 blaTEM family PBPE** (R) blaTEM family (R) blaTEM family PBPE** (R) blaTEM family (R) blaTEM family PBPE** (R) blaTEM family PBPE** GN (R) aac family* aph family* ant family* kdpE (S) aac(6')-Iy kdpE (S) aac (6')-Iy, aac6-Iy, aadA8, aadA17; kdpE (S) aac (6')-Iaa, aac3-IIa, aadA17, aadA8b aph3-IIa kdpE (R) aac family* aph family* kdpE (S) aac(6')-Iaa, aac6-Iaa, aph(6)-Id, aph(3'')-Ib strA, strB kdpE STR (R) aac family* aph family* ant family* kdpE (R) aac(6')-Iy kdpE (R) aac (6')-Iy, aac6-Iy aadA8, aadA17 kdpE (R) aac (6')-Iaa, aac3-IIa aadA17, aadA8b aph3-IIa kdpE (R) aac family* aph family* kdpE (R) aac(6')-Iaa, aac6-Iaa aph(6)-Id, aph(3'')-Ib strA, strB kdpE CIP (R) aac(6')Ib-cr, gyrA, gyrB, parC (S) gyrA, gyrB, parC (S) qnr-S1, qnr-S3, gyrA, gyrB, parC, parE (S) qnrS1, qnr-S3, qnr-S5, gyrB, parC (S) gyrA, gyrB, parC (S) gyrA, gyrB, parC C (R) floR, cmlA1, catB3, catB4, catB8 (S) floR, cmlA1 (R) floR, cmlA1, cmlA5, cat2 (R) floR, cmlA1, cmlA5, cat2 (R) floR, cmlA1 (S) cmlA1 TE (R) tet(A), tet(R) (R) tet(A), tet(M), tet(S) (R) tet(A), tet(M), tet(R), tet(S) (R) tet(A), tet(B), tet(C), tet(M), tet(R), tet(S) (R) tet(A), tet(B), tet(C), tet(R) (R) tet(A) SXT (R) sul1, sul2, dfrA12 (S) (R) sul2, sul3, dfrA12 (R) sul2, sul3, dfrA12 (R) sul2, dfrA14, dfrA5 (S) sul2 Chú thích: *Aac (Acetylation) family; Aph (Phosphorylation) family; Ant (Adenylylation) family; ** Penicillin Binding Protein E. coli. KS (kháng sinh), AM (ampicillin), GN (gentamycin), STR (streptomycin), CIP (ciprofloxacin), C (chloramphenicol), TE (tetracycline), SXT (sulfamethoxazol/trimetoprim). 76 Salmonella thường đề kháng 5 kháng sinh là ampicillin, chloramphenicol, streptomycin, sulfonamide, và tetracycline (ACSSuT) [89]. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của chúng tôi, ngoài S. Typhimurium (Sal 8, Sal 11) còn có S. Indiana (Sal 4) và S. Give (Sal 7) có kiểu gen và kiểu hình đề kháng 5 kháng sinh trên. Kết quả ở bảng 3.15 cũng cho thấy tổng số có 42 kiểu hình được tạo ra từ kết quả kháng sinh đồ. Có 29 kiểu hình kháng kháng sinh có biểu hiện của các gen kháng kháng sinh. Có 12 kiểu hình nhạy cảm kháng sinh có biểu hiện của gen kháng kháng sinh. Chỉ có duy nhất một kiểu hình nhạy cảm là không có biểu hiện của gen kháng kháng sinh đó là Sal 6 nhạy cảm với kháng sinh SXT và không có biểu hiện của gen kháng kháng sinh nào. Như vậy, sự phù hợp giữa kiểu gen và kiểu hình là (29+1)/42 = 71,4%. Và sự không phù hợp giữa kiểu gen và kiểu hình kháng kháng sinh là 12/42 = 28,6%. Tỷ lệ phù hợp giữa kiểu gen với kiểu hình ở các chủng Salmonella nghiên cứu là 71,4% (30/42 kiểu hình). Kết quả này tương tự với kết quả nghiên cứu của tác giả Owen và cộng sự, 2017. Theo tác giả này, kết quả về sự phù hợp giữa kiểu gen và kiểu hình kháng kháng sinh ở các chủng vi khuẩn phân lập được từ bò là 72,7% [90]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi thấp hơn so với các kết quả nghiên cứu của một số tác giả khác như McDermott và cộng sự năm 2016 (99%) [91] và Zankari và cộng sự năm 2013 (99,74%) [92]. Mặc dù có sự phù hợp cao giữa kiểu gen và kiểu hình, tuy nhiên còn một tỷ lệ lớn (28,6%) kiểu gen và kiểu hình không phù hợp. Đáng chú ý nhất là năm mẫu (Sal 6, Sal 7, Sal 8, Sal 11, và Sal 12) có biểu hiện của các gen kháng kháng sinh nhóm quinolone (qnrS1, qnr-S3, qnr-S5, gyrB, parC) nhưng lại nhạy cảm với kháng sinh này. Tiếp theo là các mẫu nhạy cảm với gentamycin, 4/6 mẫu (Sal 6, Sal 7, Sal 8 và Sal 12) có biểu hiện của các gen kháng kháng sinh nhóm aminoglycoside (aac(6')-Iaa, aac6-Iaa, aph(6)-Id, aph(3'')-Ib, strA, và strB). Tương tự như vậy, các gen kháng kháng sinh nhóm phenicol floR và cmlA1 biểu hiện trong hai chủng nhạy cảm với chloramphenicol (Sal 6 và Sal 12). Hai mẫu Sal 7 và Sal 8 có kiểu hình kháng kháng sinh giống nhau là AM, 77 STR, C, TE, SXT, Sal 6 và Sal 12 có kiểu hình kháng kháng sinh giống nhau là AM, STR, TE. Tuy nhiên, kiểu gen kháng kháng sinh của Sal 7 khác Sal 8, kiểu gen kháng kháng sinh của Sal 6 khác Sal 12. Sự không phù hợp giữa kiểu gen và kiểu hình trong nghiên cứu này có thể giải thích là do các gen kháng kháng sinh biểu hiện ở mức độ chưa đủ. Điều này làm vi khuẩn không có khả năng kháng kháng sinh [93]. Ngoài ra, có thể là do có nhiều cơ chế kháng kháng sinh cùng tham gia kháng một loại kháng sinh. Có nhiều cơ chế kháng kháng sinh ở Salmonella, bao gồm sản xuất enzyme để bất hoạt kháng sinh, giảm tính thấm của màng tế bào, hoạt động của hệ thống bơm thải thuốc và thay đổi mục tiêu tác dụng của thuốc. Các gen kháng kháng sinh có thể được truyền ngang giữa các vi khuẩn thông qua biến nạp, tải nạp, và tiếp hợp. Một số lượng lớn các gen có liên quan đến những con đường này và liên quan đến điều hòa biểu hiện gen. Trong một số trường hợp, sự biểu hiện của gen kháng kháng sinh có thể không liên quan đến kiểu hình kháng thuốc [94]. Ngoài ra, sự không phù hợp giữa kiểu gen và kiểu hình có thể là do các cơ chế kháng kháng sinh khác chưa được tìm ra. Việc tìm ra cơ chế kháng kháng sinh mới ở vi khuẩn còn nhiều hạn chế vì hầu hết các nghiên cứu đều tập trung vào nuôi cấy vi khuẩn và tìm các gen kháng kháng sinh đã biết trước thông qua các kỹ thuật sinh học phân tử như PCR, NGS. Cách tiếp cận này làm cho chúng ta hiểu biết chưa đầy đủ về hệ gen kháng kháng sinh ở vi khuẩn [95]. Đáng chú ý trong nghiên cứu này là sự phù hợp giữa kiểu gen và kiểu hình của hai kháng sinh thuộc nhóm aminoglycoside là streptomycin và gentamycin ở các mẫu nghiên cứu là hoàn toàn khác nhau. Streptomycin là một trong những kháng sinh có tỷ lệ phù hợp giữa kiểu gen và kiểu hình cao nhất ở các mẫu nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu này ngược với kết quả nghiên cứu của tác giả Patrick và cộng sự, 2013. Theo đó, sự không phù hợp giữa kiểu gen và kiểu hình lớn nhất lại ở kháng sinh streptomycin. Có tới 35 mẫu Salmonella phân lập được nhạy cảm với streptomycin nhưng tất cả đều mang gen kháng kháng sinh này. Mặc dù streptomycin là một trong những kháng sinh được sử 78 dụng nhiều trong chăn nuôi và được giám sát chặt chẽ bởi hệ thống giám sát vi khuẩn kháng kháng sinh Hoa Kỳ (National Antimicrobial Resistance Monitoring System: NARMS). Ngược lại, trong các kiểu hình kháng kháng sinh, tỷ lệ không phù hợp giữa kiểu gen và kiểu hình ở kháng sinh GN lại rất thấp. Kết quả này tương tự như nghiên cứu của tác giả McDermott và cộng sự, 2016 [91], theo đó, gentamycin cũng là kháng sinh có tỷ lệ không phù hợp giữa kiểu gen và kiểu hình cao ở các mẫu nghiên cứu. Tất cả những kết quả khác nhau này có thể được lý giải là do mối quan hệ giữa kiểu hình kháng kháng sinh và sự biểu hiện của gen kháng kháng sinh không phải luôn luôn đúng [96]. Trong hầu hết các trường hợp có thể dựa vào kiểu gen để dự đoán kiểu hình kháng kháng sinh. Ví dụ, Sal 6 không có biểu hiện của gen kháng trimethoprim-sulfamethoxazole và nhạy cảm với kháng sinh này. Sal 4 đề kháng với ciprofloxacin có biểu hiện của gen aac(6')Ib-cr, và các mẫu Sal 6, Sal 7, Sal 8, Sal 11, và Sal 12 không có biểu hiện của gen aac(6')Ib-cr và nhạy cảm với ciprofloxacin, điều này gợi ý rằng gen aac(6')Ib-cr có thể giúp Salmonella đề kháng quinolone. Kết quả này phù hợp với công bố của tác giả Lu và cộng sự năm 2015 [97]. Hoặc biểu hiện của các gen kháng kháng sinh trong các kiểu hình kháng thuốc như trong Salmonella đề kháng với AM, STR, TE (Sal 4, Sal 6, Sal 7, Sal 8, Sal 11, Sal 12), GN (Sal 4, Sal 11), CIP (Sal 4), C (Sal 4, Sal 7, Sal 8, Sal 11), và SXT (Sal 4, Sal 7, Sal 8, Sal 11). Việc chuyển các gen kháng kháng sinh vào các chủng nhạy cảm kháng sinh có thể tạo ra các chủng kháng kháng sinh [98]. Điều này giải thích cho việc có thể dựa vào kiểu gen để dự đoán kiểu hình kháng kháng sinh ở các mẫu nghiên cứu trên. Tuy nhiên, sự có mặt của gen kháng kháng sinh không có nghĩa là chúng sẽ biểu hiện, hoặc biểu hiện đủ mạnh để tạo ra kiểu hình kháng kháng sinh. Sự biểu hiện của các gen kháng kháng sinh ở kiểu hình nhạy cảm kháng sinh trong nghiên cứu này là một ví dụ. Giải trình tự thế hệ mới còn có một ưu điểm: đây là phương pháp khả thi cho mục đích giám sát các gen kháng kháng sinh ở vi khuẩn [92]. 79 Bảng 3.16. Kết quả chi tiết các gen kháng kháng sinh biểu hiện ở các mẫu nghiên cứu. Mẫu Kháng sinh Tên gen Sal 12 Nhóm β-Lactam blaTEM-1, blaTEM-10, blaTEM-42, blaTEM-102, blaTEM-117, blaTEM-118, blaTEM-169, blaTEM-187, blaTEM-191, blaTEM-192, blaTEM-1B, blaTEM-214, blaTEM-217, Penicillin Binding Protein E. coli Nhóm aminoglycoside aph(6)-Id, aph(3'')-Ib, aac6-Iaa, aadA1, strA, strB, kdpE Nhóm quinolone gyrA, gyrB, parC Nhóm phenicol cmlA1 Nhóm tetracycline tet(A) Nhóm sulfonamide sul2 Nhóm trimethoprim - Nhóm khác dnaA, uhpT, glpT, pmrF, bacA Sal 11 Nhóm β-Lactam blaTEM-1, blaTEM-10, blaTEM-42, blaTEM-59, blaTEM-89, blaTEM-102, blaTEM-117, blaTEM-118, blaTEM-169, blaTEM-187, blaTEM-191, blaTEM-192, blaTEM-1B, blaTEM- 217, Penicillin Binding Protein E. coli Nhóm aminoglycoside aadA17, aadA11, aadA13, aadA1-pm, aadA23, aadA24, aadA3, aac(3)-IId, aac(6')-Iaa, aac(3)-IIa, aac3-IId, aac6-Iaa, aac3-IIa, aph(3')-Ia, aph(6)-Id, aph3''Ia, aph3-Ia, aph3-IIa, aphA1, strA, strB, kdpE Nhóm quinolone qnrS1, gyrB, parC Nhóm phenicol floR, cmlA1 Nhóm tetracycline tet(A), tet(B), tet(C), tet(R) Nhóm sulfonamide sul2 Nhóm trimethoprim dfrA14, dfrA5 Nhóm khác mphA, mrx, arr-2, dnaA, uhpT, glpT, lnu(F), linG, pmrF, bacA 80 Mẫu Kháng sinh Tên gen Sal 8 Nhóm β-Lactam blaTEM-1, blaTEM-10, blaTEM-42, blaTEM-59, blaTEM-89, blaTEM-99, blaTEM-102, blaTEM-117, blaTEM-118, blaTEM-169, blaTEM-187, blaTEM-191, blaTEM-192, blaTEM- 1B, blaTEM-217 Nhóm aminoglycoside aac (6')-Iaa, aadA17, aadA8b, aac3-IIa, aph3-IIa, kdpE Nhóm quinolone qnrS1, qnrS3, qnr-S5, gyrB, parC Nhóm phenicol floR, cmlA1, cmlA5, cat2 Nhóm tetracycline tet(A), tet(S), tet(M), tet(R) Nhóm sulfonamide sul2, sul3 Nhóm trimethoprim dfrA12 Nhóm khác dnaA, uhpT, glpT, pmrF, bacA Sal 7 Nhóm β-Lactam blaTEM-1, blaTEM-10, blaTEM-42, blaTEM-59, blaTEM-89, blaTEM-99, blaTEM-102, blaTEM-117, blaTEM-118, blaTEM-169, blaTEM-187, blaTEM-191, blaTEM-192, blaTEM- 1B, blaTEM-217, Penicillin Binding Protein E. coli Nhóm aminoglycoside aac (6')-Iy, aac6-Iy, aadA8, aadA17, kdpE Nhóm quinolone qnr-S1, qnrS3, gyrA gyrB, parC, parE Nhóm phenicol cmlA1, cmlA5, cat2, floR Nhóm tetracycline tet(A), tet(B), tet(C), tet(S), tet(M), tet(R) Nhóm sulfonamide sul2, sul3 Nhóm trimethoprim dfrA12 Nhóm khác dnaA, uhpT, glpT, pmrF, bacA Sal 6 Nhóm β-Lactam blaTEM-1, blaTEM-10, blaTEM-42, blaTEM-59, blaTEM-89, blaTEM-102, blaTEM-117, blaTEM-118, blaTEM-169, blaTEM-187, blaTEM-191, blaTEM-192, blaTEM-1B, blaTEM- 214, blaTEM-217 Nhóm aminoglycoside aac(6')-Iy, aadA1, kdpE Nhóm quinolone gyrA, gyrB, parC 81 Mẫu Kháng sinh Tên gen Nhóm phenicol floR, cmlA1 Nhóm tetracycline tet(A), tet(S), tet(M) Nhóm sulfonamide - Nhóm trimethoprim - Nhóm khác dnaA, fosA7, glpT, uhpT, pmrF, bacA Sal 4 Nhóm β-Lactam blaOXA-1, blaTEM-1B, blaTEM-1, blaTEM-10, blaTEM-153, blaTEM-192, blaTEM-193, blaTEM-194, blaTEM-220, Penicillin Binding Protein E. coli Nhóm aminoglycoside aac(3)-Iva, aac(6')Ib-cr, aac(6')-Iy, aac(3)-Ib, aac(6)-Ib, aac(6)-31, aac(6)-Iaa, aac(6)-Ib, aacA4, aac-Iva, aac(6')-Ib-cr, aph(4)-Ia, aph(3'