Luận văn Nghiên cứu đặc tính sinh học của các vi sinh vật phù hợp cho lên men thức ăn thô xanh dạng lỏng phục vụ chăn nuôi lợn

u: Y (mg/ml) = (12,253 X ∆ - 0,3215) X D Trong đó: ∆: giá trị hấp phụ cực đại ở bước sóng 390 nm. D: hệ số pha loãng. 6)Xác định lượng sinh khối khô Các chủng nấm men được nuôi trong ống nghiệm Hansen lỏng (10 ml) ở 30ºC, lắc 200 vòng/phút. Sau 48 giờ, li tâm thu sinh khối và xác định lượng sinh khối khô bằng cách sấy 80ºC và cân đến khối lượng không đổi (Rajashree, Muthukumar 2013). y = 12,253x - 0,3215 R² = 0,9991 0 2 4 6 8 10 12 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 N ồ n g đ ộ a ci d l a ct ic ( g /l ) Giá trị hấp phụ cực đại tại 390 nm 18 7) Xác định hàm lượng protein thô trong tế bào Để sàng lọc các chủng nấm men tạo ra hàm lượng protein cao, mỗi chủng được nuôi cấy trong 10 ml Hansen lỏng và được ủ ở 30ºC trong 48 giờ. Các tế bào nấm men được thu thập bằng cách ly tâm với tốc độ 8.000 vòng/phút trong 10 phút. Các tế bào được rửa bằng nước cất ba lần và được tái huyền phù trong dung dịch đệm ly giải. Sau đó, huyền phù tế bào được ủ trong 20 phút trong điều kiện lắc ở nhiệt độ phòng để tách tế bào. Sau khi ủ, mẫu được siêu âm trong 5 phút với đệm đồng nhất (Cole-Parmer Dụng cụ, Vernon Hills, Illinois, Hoa Kỳ) để tăng phá tế bào và giải phóng protein. Hàm lượng protein sau đó được xác định bằng phương pháp nhuộm Bradford (Shi, Li 2012). 8) Tuyển chọn các chủng có hoạt tính probiotic a) Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định * Nguyên tắc: Dựa vào sự khuếch tán của chất ức chế trong dịch nuôi cấy VK vào môi trường thạch, hoạt tính ức chế dịch nuôi VK là tạo vòng vô khuẩn quanh lỗ đục (Damayanti et al., 2014). * Cách tiến hành Nuôi lắc các chủng lactic trên MRS lỏng ở 37oC trong 48 giờ và Bacillus trên MPA lỏng ở 37oC trong 24 giờ. Ly tâm 5000 vòng/phút (2 phút) để loại bỏ sinh khối, thu dịch lên men của chủng VK lactic và chủng Bacillus. Cấy trang VSV kiểm định lên môi trường MPA. Dùng khoan nút chai vô trùng (đường kính d= 6 mm) khoan lỗ ở giữa đĩa chứa VSV kiểm định. Bổ sung dịch lên men của chủng VK lactic, Bacillus nghiên cứu vào lỗ khoan. Đặt mẫu trong tủ lạnh từ 4 – 8 giờ để dịch từ các lỗ khoan khuếch tán ra môi trường nuôi cấy VSV. Sau đó để tủ nuôi 24 giờ. Quan sát vòng kháng khuẩn. Hoạt tính đối kháng được xác định bằng cách đo đường kính vòng kháng khuẩn theo công thức D – d (mm). Trong đó: D: Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) d: Đường kính lỗ thạch (mm) b) Khả năng kháng kháng sinh * Nguyên tắc: Các chất kháng sinh có thể khuếch tán trên môi trường thạch, ức chế các VSV mẫn cảm với chúng và tạo ra vòng vô khuẩn. Những 19 VSV nào có khả năng kháng với chất kháng sinh thì có thể sinh trưởng và phát triển (Damayanti et al., 2014). * Cách tiến hành: Giống khảo sát được hoạt hóa trên MRS lỏng ở 37oC trong 48 giờ và Bacillus trên MPA lỏng ở 30oC trong 24 giờ. Trang 5 µl dịch nuôi cấy VK lên đĩa chứa môi trường thạch MRS và trên môi trường thạch MPA. Đặt các khoanh giấy đã được tẩm kháng sinh lên mặt thạch và để tủ lạnh trong 4 giờ. Sau đó để tủ nuôi 37oC và 30oC. Quan sát kết quả sau 48 giờ nuôi cấy đối với VK lactic và 24 giờ đối với Bacillus. Độ nhạy kháng sinh được xác định bằng cách đo đường kính vùng ức chế D – d (mm) như mô tả trước đó (Williams 1989). Chủng VK được coi là nhạy cảm (S) với kháng sinh khi D – d > 10 mm, trung gian (I) khi 5,0 < D – d < 9,9 mm hoặc kháng (R) khi D – d < 4,9 mm. c) Khả năng chịu muối mật * Nguyên tắc: muối mật được coi là chất kháng khuẩn trong đường tiêu hóa, bảo vệ ruột khỏi sự xâm nhập của các VSV gây bệnh. Do vậy, VSV probiotic khi qua ruột non chịu tác động của muối mật. Ở ruột non, nơi dịch mật toàn phần tiết ra có thể có nồng độ cao nhất khoảng 2%. Khả năng sống sót sau tác dụng của muối mật là một trong những tiêu chuẩn quan trọng của VSV probiotic. * Cách tiến hành: Tiến hành khảo sát khả năng chịu muối mật với các nồng độ muối mật 0,3%; 0,5%; 1%; 2%; 3% ở những thời điểm 0; 6; 12; 24 giờ đối với VK lactic và những thời điểm 0; 3; 6; 9; 12; 24 giờ đối với VK Bacillus. Chuẩn bị giống: LAB được nuôi cấy 48 giờ trong môi trường MRS lỏng, VK Bacillus được nuôi cấy 24 giờ trong môi trường MPA lỏng. Chuẩn bị môi trường MRS lỏng và MPA lỏng có bổ sung mật lợn (Becton, Dickinson and Company, USA) ở các nồng độ 0% (đối chứng); 0,3%; 0,5%; 1%, 2%. Dùng pipet vô trùng hút 5 µl dịch nuôi cấy (107 – 108 tế bào/ml môi trường) vào môi trường MRS lỏng và MPA lỏng có bổ sung mật lợn ở các nồng độ 0,3; 0,5; 1; 2 và đối chứng 0% (không chứa mật lợn). Nuôi ở nhiệt độ 37oC và 30oC. Tiến hành đo OD ở bước sóng 630 nm ở các thời điểm 0; 6; 12; 24 giờ đối với VK lactic và 0; 3; 6; 9; 12; 24 giờ đối với VK Bacillus. Ghi nhận kết quả. Tính tỷ lệ tế bào sống sót thông qua mối tương quan giữa giá trị OD với mật độ tế bào tại mẫu đối chứng và mẫu thí nghiệm (Menconi et al., 2014). 20 d) Khả năng chịu pH axit * Nguyên tắc: dựa vào khả năng chịu pH axit (1 - 3) của các chủng probiotic. Do vậy, chúng tôi khảo sát khả năng chịu đựng pH axit ở pH 1; 2; 3 tại các thời điểm từ 0; 6; 12; 24 giờ đối với VK lactic và 0; 3; 6; 9; 12; 24 giờ đối với VK Bacillus * Cách tiến hành: VK lactic được nuôi cấy 48 giờ trong môi trường MRS lỏng và VK Bacillus được nuôi cấy 24 giờ trong môi trường MPA lỏng. Chuẩn bị môi trường MRS lỏng và MPA lỏng với pH 1; 2; 3 và mẫu đối chứng (pH 7). Dùng pipet vô trùng hút 5 µl dịch nuôi cấy (107– 108 tế bào /ml môi trường) vào các môi trường đã chuẩn bị. Nuôi ở nhiệt độ 37oC và 30oC. Tiến hành đo OD ở bước sóng 630 nm ở các thời điểm từ 0; 6; 12; 24 giờ. Ghi nhận kết quả. Tính tỷ lệ tế bào sống sót thông qua mối tương quan giữa giá trị OD với mật độ tế bào tại mẫu đối chứng và mẫu thí nghiệm (Menconi et al., 2014). 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại vi sinh vật bằng phương pháp sinh học phân tử a) Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc Các chủng VSV được nuôi cấy trên môi trường thạch tương ứng ở 30oC (vi khuẩn trêm môi trường MPA và nấm men trên môi trường Hansen), vi khuẩn lactic trên môi trường MRS (37oC). Hình thái khuẩn lạc và khả năng phát triển của chủng được quan sát sau 24 giờ và 48 giờ nuôi cấy (Dowarah et al., 2018). b) Quan sát hình thái tế bào Chủng VSV được nuôi trong môi trường lỏng MPA, MRS, Hansen ở nhiệt độ 30oC, 37oC trên máy lắc tốc độ 200 vòng/phút trong thời gian 18 - 20 giờ. Tế bào vi khuẩn và vi khuẩn lactic trong dịch nuôi cấy được nhuộm Gram và quan sát hình thái dưới kính hiển vi quang học Olympus BH2 (Dowarah et al., 2018). c) Xác định khả năng sử dụng nguồn carbon, nito Khả năng sử dụng nguồn carbon của chủng vi khuẩn nghiên cứu được xác định trên môi trường thạch MK trong các ống nghiệm có bổ sung 1% (w/v) các nguồn đường/ nguồn nito khác nhau. Khử trùng các ống nghiệm chứa môi trường thạch theo phương pháp Pasteur. Tiếp đó, cấy vi khuẩn vào các ống thạch nghiêng và nuôi 1 - 3 ngày ở nhiệt độ 30oC (đối với vi khuẩn, nấm men), 21 37oC (đối với vi khuẩn lactic). Môi trường khoáng MK được lựa chọn làm đối chứng âm. Quan sát khả năng phát triển trên các môi trường để xác định khả năng sử dụng các nguồn carbon, nito khác nhau của các chủng VSV (Bayane et al., 2006). d) Xác định khả năng chịu muối và dải nhiệt độ, pH thích hợp cho sinh trưởng của vi khuẩn Để xác định khả năng phát triển của VSV ở các nồng độ muối khác nhau, VSV được nuôi cấy trên môi trường thạch MPA (đối với vi khuẩn), MRS (đối với vi khuẩn lactic) và Hansen (đối với nấm men). Các môi trường có bổ sung NaCl nồng độ tăng dần từ 1 - 10% ở 25oC (đối với nấm men), 37oC (đối với vi khuẩn và vi khuẩn lactic). Quan sát sự phát triển của vi khuẩn trên môi trường sau 1 - 3 ngày nuôi cấy. Để xác định dải nhiệt độ và pH thích hợp cho sinh trưởng của vi khuẩn, chủng vsv được nuôi cấy trên môi trường thạch MPA (đối với vi khuẩn), MRS (đối với vi khuẩn lactic) và Hansen (đối với nấm men) ở các nhiệt độ khác nhau (10, 20, 30, 37, 40, 45 và 50oC) và dải pH khác nhau (từ pH 2,0 – pH 12,0). Quan sát sự phát triển của vi khuẩn trên môi trường sau 1 - 3 ngày nuôi cấy (Menconi et al., 2014) e) Phương pháp phân loại chủng vi sinh vật được tuyển chọn dựa trên phân tích trình tự gen mã hóa 16S rDNA (đối với vi khuẩn) và vùng ITS rDNA (đối với nấm men) DNA tổng số của vi khuẩn được tách theo phương pháp của Dowarah et al. (2018). DNA tổng số của nấm men được tách chiết theo phương pháp (Souza Liberal et al., 2005). Gen mã hóa 16S rDNA của VK được khuếch đại bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 27F (5’-TAACACATGCAAGTCGAACG-3’) và 1429R (5’-GGTGTGACGGGCGGTGTGTA-3’). DNA tổng số của nấm men tuyển chọn được dùng làm khuôn để nhân đoạn gen mã hóa cho vùng ITS bằng cặp mồi ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) và ITS4 (5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’). Phản ứng PCR được thực hiện trong tổng thể tích 50 µL có chứa 1 µL mẫu DNA của bộ gen (10 ng/µL), 5 µL của 10 x Taq buffer, 1 µL dNTP (200 µM), 1 µL mồi xuôi và mồi ngược (0,5 µM) và Taq DNA polymerase (0,05 U/µL) (MBI, Fermentas, Lithuania). 22 Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra trên gel agarose 1%. Kích thước của các đoạn DNA thu được sau phản ứng PCR được so sánh với thang DNA chuẩn (Fermentas). Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit PureLinkTM – DNA Purification (Invitrogen) và giải trình tự trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM®3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam. Trình tự gen 16S rDNA và vùng ITS và 28S rDNA được so sánh với các trình tự gen tương ứng của các chủng vi khuẩn và nấm men trên ngân hàng gen NCBI bằng công cụ BLAST ( 2.2.3. Lên men vi sinh vật tạo chế phẩm và phối trộn thức ăn thô xanh lên men 1) Lên men, thu hồi sinh khối a) Nhân giống vi sinh vật Từ ống giống các chủng B. subtilis VTX16, B. licheniformis VTX18, L. plantarum LTX28 và S. cerevisiae MTX14 được giữ trong glycerin -80ºC, giống được lấy ra cho vào hộp đá (30 phút) để cho ống giống rã đông từ từ. Dùng que cấy chuyển một vài mẫu giống sang ống nghiệm môi trường MPA lỏng (B. subtilis VTX16, B. licheniformis VTX18), MRS lỏng (L. plantarum LTX28) và môi trường Hansen lỏng (S. cerevisiae MTX14). Các ống môi trường được cấy giống được nuôi ở lắc 200 vòng/phút ở 30°C (vi khuẩn, nấm men) và 37oC (VK lactic) trong 18-20 giờ (vi khuẩn, VK lactic) và 48 giờ (nấm men). Các ống giống cho thấy sự phát triển mạnh, thuần khiết (kiểm tra bằng phương pháp soi kính hiển vi) được lựa chọn để cấy chuyển giống. Giống được chuyển với tỷ lệ là 5% sang bình tam giác 500 ml chứa 150 ml môi trường lỏng đã chuẩn bị trước đó. Các bình đã cấy chuyển giống được nuôi trên máy lắc: 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 30oC/37oC trong 18-20 giờ/48 giờ. Theo dõi, quan sát quá trình nhân giống. Kiểm tra khả năng sinh trưởng và độ thuần khiết (soi kính hiển vi). Loại bỏ những bình bị nhiễm, chết và thoái hóa, những bình giống thể hiện sự phát triển chậm hay dịch môi trường đục bất thường. Giống sinh trưởng tốt và không nhiễm được sử dụng để tiếp giống cho bình lên men. b) Lên men các chủng tuyển chọn Các chủng B. subtilis VTX16 và B. licheniformis VTX18 lên men trên môi trường MTB3. Chủng L. plantarum LTX28 lên men trên môi trường MRS. 23 Chủng S. cerevisiae MTX14 lên men trên môi trường Hansen. Điều kiện lên men trên hệ thống Bioflo 110 dung tích 10 lít (New Brunswick Scientific-Mỹ) của các chủng B. subtilis VTX16, B. licheniformis VTX18, độ pH ban đầu 6,5 – 7,0; nhiệt độ 37ºC; Tốc độ khuấy 200 vòng/phút; tốc độ thổi khí 0,5 lít khí/ 1 lít môi trường/ 1phút; Dầu phá bọt: bổ sung nếu cần thiết; Thời gian lên men: 48 giờ. Điều kiện lên men trên hệ thống Bioflo 110 dung tích 10 lít (New Brunswick Scientific-Mỹ) của chủng L. plantarum LTX28, độ pH ban đầu 6,0 – 6,5; nhiệt độ 37ºC; Tốc độ khuấy 200 vòng/phút; tốc độ thổi khí 0,5 lít khí/ 1 lít môi trường/ 1phút; Dầu phá bọt: bổ sung nếu cần thiết; Thời gian lên men: 48 giờ. Điều kiện lên men trên hệ thống Bioflo 110 dung tích 10 lít (New Brunswick Scientific-Mỹ) của chủng S. Cerevisiae MTX14, độ pH ban đầu 6,0 – 6,5; nhiệt độ 25ºC; Tốc độ khuấy 200 vòng/phút; tốc độ thổi khí 0,5 lít khí/ 1 lít môi trường/ 1phút; Dầu phá bọt: bổ sung nếu cần thiết; Thời gian lên men: 48 giờ. c) Thu hồi sinh khối vi sinh vật Từ 4 bình lên men của 4 chủng sẽ thu được sinh khối riêng rẽ của 4 chủng: B. subtilis VTX16, B. licheniformis VTX18, L. plantarum LTX28, và S. cerevisiae MTX14. Sau quá trình lên men, thu toàn bộ dịch lên men và ly tâm với tốc độ 7000 vòng/phút trong 15 phút. Loại bỏ dịch trong, thu sinh khối, sinh khối được rửa loại bỏ các thành phần môi trường với dung dịch NaCl 0,85%, sau đó ly tâm với tốc độ 7000 vòng/phút, loại bỏ dịch trong, thu sinh khối. Sinh khối của 4 chủng được trộn với glycerol 15% để bảo quản các mô sinh học bị đông. Sinh khối của từng chủng dược cho vào từng khay được cho vào máy sấy đông khô. Phương pháp giữu giống lạnh đông dựa trên nguyên tắc ức chế sự phát triển của vi sinh bằng cách đưa chúng vào nhiệt độ lạnh sâu ở -25°C đến - 70°C. 2) Phối trộn, lên men thức ăn thô xanh và đánh giá thành phần dinh dưỡng a) Phối trộn khẩu phần + Phương pháp phối hợp khẩu phần: Đề tài lựa chọn tiêu chuẩn ăn của Việt Nam (Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 1547:1994 về thức ăn hỗn hợp cho lợn) 24 cho đối tượng lợn lai để phối hợp khẩu phần ăn. Chúng tôi sử dụng phần mềm Pig diet Formulation để tiến hành phối hợp khẩu phần ăn cho lợn. Thành phần dinh dưỡng của các nguyên liệu thức ăn được sử dụng để phối hợp khẩu phần được trình bày tại (Bảng 2.1, Bảng 2.2). Bảng 2.1. Thành phần hóa hóa học của các nguyên liệu thức ăn Nguyên liệu thức ăn DM ME Thành phần hóa học (%DM) (%) kcal/kg DM CP EE CF NDF ADF Ash Bột ngô 89,15 3213 8,41 2,72 4,93 35,99 10,88 1,54 Bã bia 23,21 3116 28,06 8,03 14,45 51,36 18,40 4,35 Khô đỗ tương 89,23 3229 33,12 7,54 0,59 2,13 0,82 8,64 Bột cá 90,22 2621 42,28 6,32 2,37 7,66 3,01 26,66 NaCl 92,00 90,10 Premix 92,00 89,00 Cỏ voi 30 ngày 17,91 2077 13,29 2,37 34,72 65,82 36,38 12,87 Rau muống 13,82 2445 26,79 1,32 20,42 30,07 19,72 11,95 Bảng 2.2. Thành phần nguyên liệu thí nghiệm lên men thức ăn thô xanh kết hợp với một số nguồn dinh dưỡng khác Nguyên liệu Tỷ lệ (%) Bột ngô 53,5 Bã bia 3,5 Khô đỗ tương 0,1 Bột cá 1,0 NaCl 0,5 Premix 0,3 Chế phẩm vi sinh 0,5-1,5 Cỏ voi 30 ngày 35,0 Rau muống 5,1 Đơn vị: kg (tính theo CK) b) Sử dụng vi sinh lên men thức ăn thô xanh Thức ăn xanh (rau muống, cỏ voi 30 ngày) được lấy về, rửa sạch và nghiền nát bằng máy nghiền thức ăn 3A. Trong quá trình nghiền đồng thời thêm bột ngô, cám gạo, khô đậu tương, bột cá, NaCl, premix, chế phẩm vi sinh bao gồm các chủng B. subtilis VTX16, B. licheniformis VTX18, L. plantarum LTX28, S. cerevisiae MTX14 và nước. Các nguyên liệu đều được nghiền nát và 25 trộn đều. Mỗi công thức thức ăn được thử ở ba mức bổ sung khác nhau (0,5%; 1,0% và 1,5%) chế phẩm tính theo vật chất khô. Thức ăn lên men được chứa trong thùng có nắp đậy kín xung quanh để đảm bảo cho quá trình lên men yếm khí. Thức ăn lên men được chứa trong bình 5 kg có nắp đậy kín xung quanh để đảm bảo cho quá trình lên men yếm khí. Mỗi công thức thức ăn sẽ được ủ với số lượng như sau: 1 công thức x 3 lần lặp x 2 mốc thời gian (0h, 120h) = 6 bình. Sau các khoảng thời gian 0h, 120h, các thức ăn ủ được lấy mẫu để phân tích thành phấn hóa học đánh giá chất lượng thức ăn và xác định tỷ lệ men bổ sung thích hợp. c) Lấy mẫu và phân tích chất khô Phương pháp lấy mẫu theo tiêu chuẩn Việt Nam năm 2007 (TCVN 4325 – 2007). Lấy mẫu tại thời điểm 0 và 72, 120 giờ sau khi lên men (6 mẫu/thời điểm: 3 mẫu để xác định thành phần dinh dưỡng, 3 mẫu để xác định tỷ lệ tiêu hóa in vitro). Thức ăn được khuấy đều trong các thùng lên men, sau đó lấy mẫu đại diện và tiến hành phân tích chất khô theo TCVN-4326-2001. Thức ăn đã sấy khô được bảo quản trong bao bóng buộc kín, sau đó mang mẫu tới phòng thí nghiệm để tiến hành xác định và thành phần và giá trị dinh dưỡng của mẫu thức ăn. Thức ăn đã sấy khô được bảo quản trong bao bóng buộc kín và gửi phân tích tại Phòng thí nghiệm VILAS 929 – VIMCERTS 171 và Phòng thí nghiệm Trung tâm Khoa Chăn nuôi, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam. d) Đánh giá các chỉ tiêu dinh dưỡng của thức ăn Mẫu thức ăn cho ăn, mẫu thức ăn thừa được phân tích chất khô (DM), chất hữu cơ (OM), protein thô (CP), xơ thô (CF), mỡ thô (EE) và tro (Ash) được phân tích theo các tiêu chuẩn tương ứng TCVN-4326-2001, TCVN-4328-2007, TCVN-4329-2007, TCVN-4331-2001 và TCVN-4327-2007. Các thành phần xơ xơ trung tính NDF và xơ axit ADF được xác định theo phương pháp của (Van Soest et al., 1991). Giá trị GE, DE và ME được ước tính theo NRC (1998)(GE = 4,143 + (56*%EE) + (15*%CP) - (44*%Ash), R2 = 0,98; DE = 949+(0,789*GE)-(43*%Ash)-(41*%NDF), R2 = 0,91; ME = DE*(1,012- (0,0019*%CP), R2 = 0,91). 2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu Kết quả nghiên cứu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trên phần mềm excel. Phần mềm sử dụng các hàm tính toán dựa trên những công thức cơ bản của thống kê trong đó có công thức: Giá trị trung bình(X): X = 1 𝑛 ∑ X𝑛𝑖=1 I; Độ lệch chuẩn (δ): δ = √ ∑ (𝑋𝑖−𝑋)2𝑛𝑖=1 𝑛−1 ; Sai số (m): 𝑚 = ± δ 𝑚 26 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SPP. SINH CELLLASE VÀ CÁC ENZYM NGOẠI BÀO CAO 3.1.1 Sàng lọc khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn Bacillus spp. Sàng lọc khả năng sinh cellulase, protease và xylanase cho thấy 38/47 vi khuẩn sinh ít nhất một trong ba loại enzyme nói trên (Bảng 3.1); (Hình 3.1). Bảng 3.1. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của 38 chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus STT Kí hiệu chủng Hoạt tính enzyme ngoại bào (D-d) (mm) STT Kí hiệu chủng Hoạt tính enzyme ngoại bào (D-d) (mm) Cellulase Protease Xylanase Cellulase Protease Xylanase 1 VTX2 - 2 - 20 VTX27 19 ± 0,02 - 34 ± 0,04 2 VTX4 12 ± 0,01 17 ± 0,02 22 ± 0,03 21 VTX31 3 ± 0,01 5 ± 0,01 - 3 VTX5 - 14 ± 0,01 - 22 VTX36 13 ± 0,01 4 ± 0,01 6 ± 0,01 4 VTX6 55 ± 0,04 22 ± 0,03 - 23 VTX37 - 11 ± 0,01 - 5 VTX9 25 ± 0,03 - 40 ± 0,04 24 VTX38 - 8 ± 0,01 - 6 VTX10 18 ± 0,02 7 ± 0,01 - 25 VTX39 9 ± 0,01 1 5 ± 0,01 7 VTX11 - 15 ± 0,02 - 26 VTX40 7 ± 0,01 2 7 ± 0,01 8 VTX12 22 ± 0,03 19 ± 0,02 40 ± 0,04 27 VTX42 - 8 ± 0,01 - 9 VTX14 23 ± 0,03 - 42 ± 0,04 28 VTX43 8,5 ± 0,01 1 10 ± 0,01 10 VTX15 22 ± 0,03 6 ± 0,01 25 ± 0,03 29 VTX47 9 ± 0,01 4 ± 0,01 10 ± 0,01 11 VTX16 28 ± 0,04 20 ± 0,03 45 ± 0,04 30 VTX49 9 ± 0,01 1 8 ± 0,01 12 VTX17 17 ± 0,02 11 ± 0,01 22 ± 0,03 31 VTX50 10 ± 0,01 2 9 ± 0,01 13 VTX18 14 ± 0,01 14 ± 0,01 44 ± 0,04 32 VTX62 - 8 ± 0,01 - 14 VTX20 26 ± 0,04 22 ± 0,03 38 ± 0,04 33 VTX63 - 7 ± 0,01 - 15 VTX21 22 ± 0,03 16 ± 0,02 39 ± 0,04 34 VTX64 - 10 ± 0,01 - 16 VTX22 26 ± 0,04 - - 35 VTX65 - 6 ± 0,01 - 17 VTX23 32 ± 0,04 16 ± 0,02 - 36 VTX66 - 8 ± 0,01 - 18 VTX25 8 ± 0,01 3 17 ± 0,02 37 VTX67 - 10 ± 0,01 - 19 VTX26 23 ± 0,03 - - 38 VTX68 7 ± 0,01 6 ± 0,01 5,5 ± 0,01 Ghi chú: (-) không có hoạt tính; D: Đường kính vòng phân giải; d: Kích thước khuẩn lạc 27 Hình 3.1. Hoạt tính xylanase (A) và cellulase (B) trên môi trường có cơ chất của hai chủng đại diện VTX16 và VTX18 Kết quả cho thấy có 38/47 chủng (chiếm 80,85%) sinh ít nhất một loại enzyme; có 17 chủng (chiếm 36,17%) sinh cả 3 loại enzyme là VTX4, VTX12, VTX15, VTX16, VTX17, VTX18, VTX20, VTX21, VTX25, VTX36, VTX39, VTX40, VTX43, VTX47, VTX49, VTX50, VTX68 với đường kính vòng phân giải dao động lớn từ 1 – 45 mm. Trong số đó chủng VTX12, VTX16, VTX18, VTX20, VTX21 cho hoạt tính 3 loại enzyme cao (Bảng 3.1; Hình 3.1). Số chủng sinh cellulase, protease và xylanase lần lượt là 26 chủng (chiếm 55,32%), 33 chủng (chiếm 70,21%) và 20 chủng (chiếm 42,55%). Hoạt tính enzyme thủy phân của các chủng Bacillus spp. cũng tương đồng với một số nghiên cứu đánh giá về hoạt tính enzyme thủy phân trên các nhóm vi khuẩn thuộc chi Bacillus (Saarela et al., 2000). Để tăng cường quá trình phân giải cellulose trong thành phần thức ăn thô xanh, 26 chủng vi khuẩn sinh cellulase được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.1.2. Xác định hoạt tính cellulase của các chủng vi khuẩn tuyển chọn Kết quả phân tích hoạt độ cellulase của 26 chủng vi khuẩn khi nuôi cấy trên môi trường lỏng được thể hiện trên Hình 3.2. Hoạt độ cellulase của các chủng dao động khá lớn, từ 17,21 – 630,67 U/mL. Trong một số nghiên cứu lên men phân giải các chất giàu xơ làm thức ăn chăn nuôi, phần lớn các vi khuẩn được sử dụng thuộc chi Bacillus có hoạt tính phân giải cellulose (CMCase, beta-glucanase) thành các sợi cellulose mạch ngắn hoặc giải phóng đường glucose (Missotten et al., 2015). Vì vậy, trong nghiên cứu này các chủng có hoạt độ cellulase cao: VTX22 (500,78 U/mL), VTX9 (508,61 U/mL), VTX23 (530,52 U/mL), VTX16 (577,31 U/mL), VTX18 (592,64 U/mL), VTX25 (593,11 U/mL), VTX26 (630,67 U/mL) được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. VTX16 VTX18 VTX16 VTX18 (A) (B) 28 Hình 3.2. Hoạt tính cellulase của 26 chủng vi khuẩn được tuyển chọn 3.2. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTIC SINH AXIT LACTIC CAO 3.2.1. Sàng lọc các chủng vi khuẩn sinh axit tổng số cao Khả năng sinh axit tổng số của 24 chủng LAB sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường MRS được thể hiện trong Bảng 3.2 và Hình 3.3. Trong số 24 chủng có 15 chủng tạo vòng phân giải với CaCO3 , chủng LTX31 thể hiện đường kính vòng phân giải lớn nhất (14 mm). Hình 3.3. Đặc tính phân giải CaCO3 trên môi trường MRS của một số chủng vi khuẩn lactic đại diện trong nghiên cứu 0 100 200 300 400 500 600 700 H o ạ t đ ộ c el lu la se ( U /m L ) Chủng vi khuẩn 29 Bảng 3.2. Đường kính vòng phân giải CaCO3 trên môi trường MRS (bổ sung 1% CaCO3) của 24 chủng vi khuẩn lactic 3.2.2. Sàng lọc các chủng vi khuẩn sinh axit lactic cao Các chủng có khả năng sinh axit tổng số được định tính axit lactic nhờ khả năng làm đổi màu thuốc thử Uphenmen Hình 3.4. Kết quả phân tích cho thấy cả 15 chủng đều làm đổi màu thuốc thử Uphenmen. Hình 3.4. Phản ứng với thuốc thử Uphenmen của một số chủng vi khuẩn lactic đại diện Xác định hàm lượng axit lactic của các chủng VK cho thấy toàn bộ 15 chủng vi khuẩn sinh axit lactic với hàm lượng từ 0,48 – 24,74 mg/ml; 12/15 chủng (tương ứng 80%) sinh axit lactic với hàm lượng trên 10 mg/ml và 3/15 chủng (tương ứng 20%) sinh axit lactic với hàm lượng dưới 10 mg/ml. Trong STT Kí hiệu chủng Đường kính vòng phân giải CaCO3 (mm) STT Kí hiệu chủng Đường kính vòng phân giải CaCO3 (mm) 1 LTX2 0 13 LTX 21 0 2 LTX3 0 14 LTX 22 11 ± 0,17 3 LTX6 13 ± 0,2 15 LTX 23 9 ± 0,2 4 LTX7 0 16 LTX 24 2 ± 0,1 5 LTX9 10 ± 0,25 17 LTX 25 11 ± 0,15 6 LTX10 0 18 LTX 26 8 ± 0,28 7 LTX11 0 19 LTX 27 12 ± 0,3 8 LTX12 0 20 LTX 28 8 ± 0,22 9 LTX13 9 ± 0,18 21 LTX 29 0 10 LTX16 0 22 LTX 30 10 ± 0,27 11 LTX18 9 ± 0,3 23 LTX 31 14 ± 0,16 12 LTX19 8 ± 0,2 24 LTX 32 10 ± 0,27 30 đó, chủng LTX31 sinh axit lactic với hàm lượng cao nhất (24,74 mg/ml) và chủng LTX19 sinh axit lactic với hàm lượng thấp nhất (0,48 mg/ml) (Hình 3.5). Hình 3.5. Hàm lượng axit lactic của các chủng vi khuẩn lactic So sánh khả năng sinh axit lactic của các chủng LAB trong nghiên cứu với các nghiên cứu cho thấy hàm lượng axit lactic đạt được cao hơn so với số liệu từ một số công bố trước đây tại Việt Nam. Trên thế giới nhiều nghiên cứu công bố về khả năng sinh axit của các chủng LAB. (Kostov et al., 2011) báo cáo hàm lượng axit lactic đạt được 45 g/l khi nuôi cấy chủng L. casei subsp. rhamnosus trên môi trường MRS lỏng (Kostov et al., 2011). Các kết quả nghiên cứu trên cho thấy các chủng LAB trong nghiên cứu sinh axit lactic với hàm lượng cao, có thể giúp làm giảm pH môi trường, ức chế sự sinh trưởng của VSV gây bệnh khi lên men. 3.2.3. Khả năng kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn lactic Đánh giá khả năng kháng kháng sinh của 15 chủng vi khuẩn lactic đã tuyển chọn, cho thấy phần lớn các chủng có độ nhạy cảm cao với chloramphenicol (66,67%), tiếp theo là gentamycin (60%), colistin (40%), kanamycin (6,6%). Tất cả 15 chủng đều kháng nalidixic acid (100%), trong khi mức độ kháng với kanamycin (66,6%), chloramphenicol (53,33%), gentamycin và colistin (33,3%). Có 7/15 (46,67%) chủng kháng được 3/5 loại kháng sinh. Kết quả được trình bày trong Bảng 3.3 0 5 10 15 20 25 30 N ồ n g đ ộ a ci d l a ct ic ( g /l ) Chủng vi khuẩn lactic 31 Bảng 3.3. Khả năng kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn STT Kí hiệu chủng Khả năng kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn lactic 1 2 3 4 5 1 LTX6 R S R R R 2 LTX9 R S S S R 3 LTX13 I S R S R 4 LTX18 R R S R R 5 LTX19 S S S S R 6 LTX22 R R R R R 7