Luận văn Nghiên cứu định lượng một số hoạt chất thuốc kháng sinh thuộc nhóm sulfamid bằng phương pháp phổ kế hồng ngoại gần và trung bình

tiên là có nghĩa (có tổng phương sai tích lũy đủ lớn để coi rằng chúng đã chứa toàn bộ thông tin hữu ích đặc trưng của tập số liệu). Như vậy, sử dụng mô hình PCR có thể giảm được kích thước tập số liệu mà không làm mất thông tin đồng thời có thể loại được tín hiệu nhiễu của dữ liệu gốc [4, 8]. Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học Vũ Thị Huệ - K23 Hóa Học Chuyên ngành hóa phân tích 24 Trường ĐHKHTN * Các bước chính của PCR bao gồm: 1. Xử lý ban đầu (không bắt buộc) Nội dung chính của bước này là chuẩn hóa tập số liệu. 2. Các xử lý cần thiết: Với một tập số liệu đã chuẩn hóa hoặc chưa chuẩn hóa, trước khi sử dụng đều cần bước bình phương toàn tập dữ liệu - đây là yêu cầu bắt buộc đối với hầu hết các hàm tính vectơ riêng. D = A T . A Trong đó A là ma trận số liệu biểu diễn độ hấp thụ quang theo các thời điểm đo của các dung dịch chuẩn và AT là ma trận chuyển vị của ma trận A. 3. Xác định các vectơ riêng hay các PC: Có thể tính toán các vectơ riêng của tập số liệu bằng nhiều hàm toán học khác nhau. Có 3 hàm chính, thường sử dụng là hàm NIPALS (hàm phi tuyến lặp sử dụng kĩ thuật bình phương tối thiểu riêng phần), hàm SVD (hàm phân tách các giá trị riêng) và hàm Princomp (hàm tính các cấu tử chính). Cần lưu ý rằng, tất cả các hàm này đều tính toán và đưa ra tất cả các cấu tử nhưng thường không sử dụng tất cả mà chỉ sử dụng N cấu tử đầu đủ để xác định không gian mới : NIPALS là hàm lặp thường sử dụng cho các tập số liệu kích thước lớn hoặc có độ đa cộng tuyến cao. Với tập số liệu có kích thước nhỏ, quá trình tính lặp trong hàm NIPALS sẽ làm khuếch đại sai số của tập số liệu nên thông thường người ta không sử dụng hàm này để tính các PC. SVD là hàm tính PC sử dụng phương pháp tách tập số liệu ban đầu thành các nhân tố. Các vectơ riêng và trị riêng của ma trận dữ liệu đều là những tập con riêng của các nhân tố trong SVD. Hàm SVD sử dụng hình thức chéo hóa cho phép khống chế thang đo một cách hợp lí nên giảm thiểu được sai số do làm tròn. Vì vậy hàm này sử dụng được với các kiểu tập số liệu rộng rãi hơn hàm NIPALS. Princomp là hàm tính toán trực tiếp các cấu tử chính (PC) có vai trò tương đương các vectơ riêng. Tuy nhiên, so với hàm SVD thì việc sử dụng hàm Princomp với tập số liệu lớn có ưu điểm là phương sai tập trung không cao nên vị trí các PC Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học Vũ Thị Huệ - K23 Hóa Học Chuyên ngành hóa phân tích 25 Trường ĐHKHTN sẽ chênh lệch không quá lớn, do đó sai số trong quá trình làm tròn số và chuyển hóa tập số liệu sẽ nhỏ hơn. Các hàm toán học trên đều đưa ra một ma trận cột chứa các vectơ riêng - Vc - là ma trận trong đó mỗi cột là một vectơ hay nhân tố mới - PC - của ma trận dữ liệu và số hàng ma trận là số thời điểm đo. Mỗi nhân tố hay vectơ này lại là tổ hợp bậc nhất của các điểm phổ ban đầu, phần đóng góp của các điểm này vào mỗi vectơ là khác nhau tùy thuộc vào giá trị hàm phụ thuộc tại điểm đó. Những điểm có giá trị đóng góp lớn vào các PC chứa phương sai lớn sẽ là những điểm đo có ảnh hưởng quyết định tới kết quả tính ma trận hệ số hồi qui và kết quả hồi qui sau đó. Ma trận kết quả thứ hai cũng rất quan trọng là ma trận phương sai của các PC: đó là dạng ma trận chéo đối với hàm SVD, là một vectơ cột đối với hàm NIPALS và hàm Princomp. 4. Lựa chọn các vectơ có nghĩa Đây là bước có ảnh hưởng đặc biệt quan trọng đến bước xử lý tiếp theo. Nếu giữ lại nhiều vectơ hơn số cần dùng thì những vectơ đó sẽ chứa cả tín hiệu nhiễu và như vậy, kết quả hồi qui sẽ mắc phải sai số. Nếu giữ lại không đủ số vecto cần thiết sẽ làm mất đi thông tin có ích từ tập dữ liệu, điều này cũng sẽ gây nên sai lệch giữa mô hình hồi qui thu được và mô hình thực. Vì vậy, việc đánh giá và lựa chọn các vectơ có nghĩa là rất quan trọng. Dưới đây là một số phương pháp phổ biến để xác định số PC có nghĩa :  Dùng các hàm chỉ thị: Có rất nhiều hàm chỉ thị khác nhau như CPV (tính phần trăm phương sai tích lũy), hàm IEF, ...  Tính toán PRESS (tổng bình phương sai số dự đoán) để đánh giá thông tin từ dữ liệu.  Phương pháp đánh giá chéo  Phương pháp đánh giá Xu – Kailath  Đánh giá theo tiêu chuẩn Akaike  Tính phương sai của sai số tái lập VRE Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học Vũ Thị Huệ - K23 Hóa Học Chuyên ngành hóa phân tích 26 Trường ĐHKHTN Các phương pháp này đều có những ưu điểm riêng khi sử dụng và kết quả đánh giá tương đối thống nhất với nhau. Phương pháp được sử dụng rộng rãi để lựa chọn các PC có nghĩa khi các PC này được tính bằng hàm SVD hay Princomp là phương pháp tính và đánh giá qua phần trăm phương sai tích lũy của các PC đó. Cách tính này đơn giản hơn và các hàm tính PC trên đã cho sẵn dữ liệu để có thể đánh giá nhanh. 5. Tính toán lại Sau khi loại bỏ các vectơ riêng không có nghĩa, chúng ta cũng loại được tín hiệu nhiễu của dữ liệu gốc và cần tính lại dữ liệu sau khi loại bỏ sai số. Như vậy, khi tính toán ở hệ tọa độ mới ta đã loại bỏ được tín hiệu nhiễu trong tập dữ liệu ban đầu. 6. Xây dựng đường chuẩn Khi xây dựng đường chuẩn PCR theo phương pháp ILS, điểm khác biệt duy nhất là tập số liệu sử dụng. Các bước tiến hành bao gồm: - Xác định phép chiếu trong hệ tọa độ mới: Aj = A . Vc Trong đó: Aj: ma trận số liệu ở hệ tọa độ mới A: ma trận gốc Vc: ma trận các vectơ riêng có nghĩa - Thay thế A bằng Aj trong phương trình hồi quy C = Aj . F , trong đó F được tính theo công thức: F = (Aj T . Aj) -1 . Aj T . C Nồng độ chất phân tích trong mẫu chưa biết được tính theo công thức: Cx = Ax . Vc . F = Ax . Fcal với Fcal = Vc . F đóng vai trò tương tự ma trận P trong phương trình của ILS Ưu điểm của phương pháp PCR: Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học Vũ Thị Huệ - K23 Hóa Học Chuyên ngành hóa phân tích 27 Trường ĐHKHTN - Hội tụ đầy đủ các ưu điểm của phương pháp ILS đồng thời khắc phục được các nhược điểm của phương pháp ILS do tiến hành tính toán trên toàn phổ. - Phương pháp này cho phép loại bỏ sai số nhiễu phổ và sai số ngẫu nhiên trong quá trình đo khi lựa chọn được số PC phù hợp. - Đối với trường hợp sử dụng phổ toàn phần, khi dùng các phương pháp khác như CLS, kết quả tính cuối cùng là kết quả tính trung bình trên toàn phổ nên kém chính xác hơn trường hợp dùng phổ chọn lọc. Khi sử dụng mô hình PCR, tuy kết quả vẫn tính trên tất cả các điểm nhưng đóng góp của các điểm đo sẽ khác nhau tùy theo lượng đóng góp của từng điểm này vào các PC được chọn mà lượng đóng góp này lại được phân tích dựa trên tín hiệu đo tại từng điểm của các mẫu chuẩn. Do có sự phân biệt và chọn lọc trong đánh giá mỗi điểm đo nên kết quả thu được sẽ chính xác hơn phương pháp tính trung bình trên toàn phổ ở các phương pháp phổ toàn phần khác [4, 8]. 1.4.2.2. Xác định đồng thời các chất bằng phương pháp quang phổ hồng ngoại gần và trung bình kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến Trong vòng hai thập kỷ trở lại đây NIR đã trở thành một trong những công cụ hữu ích ứng dụng trong phân tích công nghiệp. Đây là một kỹ thuật phân tích rất nhanh: chỉ với cần một máy quang phổ hồng ngoại ta có thể đo phổ hồng ngoại chỉ trong vòng một vài giây [22]. So với phương pháp phân tích truyền thống để định lượng hoạt chất thuốc là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) thì định lượng chất hữu cơ trong phổ hồng ngoại gần và trung bình có ưu điểm nổi trội về đơn giản trong quá trình tiền xử lý mẫu, lượng mẫu phân tích ít, quá trình chuẩn bị mẫu đơn giản, chi phí thấp do đó có thể hạn chế được các sai số trong quá trình chuẩn bị mẫu [25]. Tuy nhiên, NIR có một số nhược điểm như: giới hạn phát hiện cao do đó không phù hợp với các phép phân tích lượng vết, không đưa ra được các thông tin đặc trưng nếu chỉ đo tại một bước sóng. Kết quả đo phổ hồng ngoại chịu ảnh hưởng mạnh mẽ của các thông số như điều kiện vật lý của mẫu, môi trường đo mẫu, độ dày của viên mẫu, tỷ lệ ép viên. Vì thế NIR thường không được sử dụng như một kỹ thuật phân tích trực tiếp. Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học Vũ Thị Huệ - K23 Hóa Học Chuyên ngành hóa phân tích 28 Trường ĐHKHTN Việc sử dụng phổ hồng ngoại kết hợp với các thuật toán hồi quy đa biến đã góp phần đưa phương pháp phổ hồng ngoại tham gia vào các quá trình định lượng mẫu. Năm 2011, Mafalda Cruz Sarraguca và các cộng sự [27] đã nghiên cứu thành công phương pháp định lượng nhanh aminoglycosides bằng phép đo hồng ngoại gần. Không giống như các phương pháp định lượng truyền thống là dựa trên cơ sở các phản ứng dẫn xuất hay phương pháp xét nghiệm vi sinh để định lượng aminoglycosides [34, 37], trong nghiên cứu này các tác giả đã đưa ra một phương pháp hoàn toàn mới để xác định các hoạt chất này. Theo đó, phương pháp này đã được phát triển dựa trên nền mẫu thuốc thương mại có chứa neomycin sulphate và ba tá dược là lactose, bột talc và magnesi stearat. Các mẫu tổng hợp và mẫu thêm đã được chế tạo cho mục đích này, đồng thời họ cũng đã sử dụng ba lô mẫu thuốc rắn thương mại để thực hiện việc nghiên cứu xác định neomycin sulphate. Mẫu được tiến hành đo phổ hồng ngoại gần với chế độ đo phản xạ sử dụng biến đổi Fourier. Phương pháp hồi quy đa biến đã được sử dụng để hiệu chỉnh phổ hồng ngoại gần phù hợp với hàm lượng neomycin sulphate. Nhóm nghiên cứu đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để kiểm tra hàm lượng neomycin sulphate trong các mẫu thương mại. Kết quả thu được cho thấy neomycin sulphate đã được xác định thành công bằng phương pháp đo phổ hồng ngoại gần với sai số 6,6%. Đối với roxithromycin thông thường người ta sẽ sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với các loại detector khác nhau để xác định. Tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi một lượng lớn hóa chất, dung môi để xử lý và chạy sắc ký. S.T.H. Sherazi [33] đã sử dụng phương pháp hồng ngoại biến đổi Fourier để xác định roxithromycin từ phổ của mẫu thuốc kết hợp với phương pháp hồi quy phân tích thống kê đa biến. Phương pháp này cho phép rút ngắn thời gian phân tích xuống còn khoảng 3 phút nên rất phù hợp để áp dụng kiểm tra nhanh các mẫu. Thêm một ứng dụng thành công của phương pháp đo phổ hồng ngoại gần kết hợp với kỹ thuật thống kê đa biến cho phép giám sát liên tục để phân tích đồng thời glycerol và clavulanic acid trong một hỗn hợp kháng sinh phức tạp [32]. Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học Vũ Thị Huệ - K23 Hóa Học Chuyên ngành hóa phân tích 29 Trường ĐHKHTN Phương pháp phổ hồng ngoại kết hợp với chemometric đã mở ra một kỷ nguyên mới cho phép phân tích nhanh, hiệu quả, thân thiện với môi trường- công nghệ hóa học xanh. Tuy nhiên, đây vẫn là một hướng nghiên cứu khả mới mẻ trên thế giới. Hiện nay, tại phòng thí nghiệm Hóa phân tích thuộc AgroParisTech (Pháp), nhóm nghiên cứu đã ứng dụng các thuật toán để xử lý các tín hiệu phân tích của hỗn hợp các chất trong sự tương tác phức tạp đa biến và đưa ra các kết quả của từng biến đã có rất nhiều nghiên cứu thu được kết quả tốt [20, 22, 24]. Đặc biệt, việc áp dụng các thuật toán đã mở ra những phương pháp đo nhanh có thể đưa các phép phân tích ra khỏi phòng thí nghiệm. Tại các nước như Mỹ, Anh cũng có giới thiệu các thiết bị cầm tay để xác định thuốc giả. Các máy này đều có ưu điểm là khá gọn nhẹ, nhưng có hạn chế là khi đo chất trong các nền khác nhau thường không đưa ra được các kết quả có độ chính xác cao. Phần mềm và cơ sở dữ liệu của chúng lại không cho phép can thiệp nên khó khăn trong việc bổ sung thêm cơ sở dữ liệu. Do đó việc nghiên cứu phát triển phương pháp quang phổ hồng ngoại gần và trung bình kết hợp với các thuật toán hồi quy đa biến để kiểm tra nhanh chất lượng thuốc là một vấn đề vô cùng cần thiết. Hiện tại chưa có một nghiên cứu nào về định lượng nhanh nhóm Sulfamid bằng phương pháp quang phổ hồng ngoại gần và trung bình được công bố. Đây chính là cơ sở để chúng tôi lựa chọn tiến hành nghiên cứu định lượng một số hoạt chất thuốc kháng sinh thuộc nhóm Sulfamid bằng phương pháp quang phổ kế hồng ngoại gần và trung bình. Kết quả thu được từ nghiên cứu này mở ra hướng nghiên cứu mới sử dụng các thiết bị đơn giản để xác định nhanh các chất trong mẫu đo phức tạp mà không cần phá mẫu hoặc xử lý nhanh tại chỗ, tạo điều kiện đưa phép phân tích ra khỏi phòng thí nghiệm. Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học Vũ Thị Huệ - K23 Hóa Học Chuyên ngành hóa phân tích 30 Trường ĐHKHTN CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM 2.1. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 2.1.1. Nội dung nghiên cứu Để xây dựng qui trình phân tích định lượng nhanh ba hoạt chất sulfaguanidin, sulfamethoxazol và trimethoprim bằng phương pháp phổ hồng ngoại kết hợp với chemometrics cần giải quyết các vấn đề sau: - Nghiên cứu lựa chọn các điều kiện tối ưu để đo phổ IR trong vùng hồng ngoại gần và trung bình của các hoạt chất sulfaguanidin, sulfamethoxazol và trimethoprim. - Nghiên cứu xây dựng thuật toán hồi qui đa biến tuyến tính, lựa chọn các thông số tối ưu của các mô hình trên cơ sở của mẫu chuẩn. - Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tín hiệu đo độ hấp thụ của chất phân tích trong vùng hồng ngoại gần và trung bình. - Nghiên cứu xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp hồi quy đa biến xác định đồng thời các hoạt chất trên. - Ứng dụng phương pháp nghiên cứu được để định lượng nhanh thành phần hoạt chất trong các mẫu thuốc đang lưu thông trên thị trường. So sánh kết quả tìm được với phương pháp tiêu chuẩn qui định trong dược điển 2.1.2. Phương pháp nghiên cứu Cơ sở của phương pháp nghiên cứu là dựa vào phổ hấp thụ của ba hoạt chất là sulfaguanidin, sulfamethoxazol (thuộc nhóm sulfamid) và trimethoprim (thường dùng kết hợp với sulfamethoxazol để tăng cường khả năng kháng khuẩn của thuốc) trong vùng phổ hồng ngoại từ 3600- 3000 cm-1 để định lượng nhanh các hoạt chất trên trong dược phẩm bằng phương pháp hồi quy đa biến. Tiến hành xây dựng mô hình hồi quy đa biến xác định một hoạt chất và các tá dược gồm 25 mẫu chuẩn và 10 mẫu kiểm tra, mô hình hồi quy đa biến xác định cả ba hoạt chất và các tá dược gồm 30 mẫu chuẩn và 15 mẫu kiểm tra bằng cách chuẩn bị các mẫu chuẩn, mẫu kiểm tra theo như quy trình như dưới đây: Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học Vũ Thị Huệ - K23 Hóa Học Chuyên ngành hóa phân tích 31 Trường ĐHKHTN - Bước 1: chuẩn bị các mẫu chuẩn, mẫu kiểm tra chứa đồng thời các hoạt chất là sulfaguanidin, sulfamethoxazol, và trimethoprim cùng với ba tá dược là tinh bột sắn, maltodextrin, Ca3(PO4)2 với tỷ lệ thay đổi trong khoảng nồng độ khảo sát sao cho tín hiệu độ hấp thụ thay đổi trong vùng tuyến tính. - Bước 2: Nghiền và trộn từng mẫu trong 15 phút để hỗn hợp được đồng nhất. - Bước 3: Lấy 2 mg chất vừa trộn được trộn với 98 mg KBr rồi tiến hành nghiền mịn đồng nhất mẫu trong cối mã não trong 10 phút. - Bước 4: Lấy khoảng 15 mg lượng bột vừa nghiền được cho vào bộ ép viên để thu được viên mẫu đem đo phổ hồng ngoại trong vùng phổ nghiên cứu từ 3600- 3000 cm - 1 , ghi lại độ hấp thụ quang của từng mẫu, xuất số liệu thu được dưới dạng ASCII và chuyển toàn bộ dữ liệu vào phần mềm matlab để tính toán kết quả. - Bước 5: Đường chuẩn đa biến và các bộ dữ liệu dự đoán được xây dựng trên ma trận độ hấp thụ quang của các mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra đã chuẩn bị ở phần trên. Nhập số liệu ma trận nồng độ các mẫu chuẩn, ma trận các mẫu kiểm tra và các ma trận tín hiệu đo tương ứng vào phần mềm Matlab, chạy chương trình tính toán ma trận hệ số hồi qui theo 4 phương pháp CLS, ILS, PLS và PCR trên phần mềm và sử dụng ma trận này để tìm nồng độ mỗi hoạt chất trong từng mẫu. So sánh sai số tương đối của mỗi phương pháp, lựa chọn ra phương pháp tối ưu nhất để tiến hành định lượng các mẫu thực tế. - Bước 6: Tiến hành định lượng các mẫu thực tế bằng cách trộn một lượng bột viên với tá dược để pha loãng nồng độ hoạt chất về nồng độ nằm trong ma trận chuẩn đã xây dựng, đo phổ của các mẫu này, ghi lại phổ và chuyển dữ liệu thu được vào phần mềm Matlab để tính toán kết quả. Từ đó tiến hành tính toán hàm lượng hoạt chất trong các mẫu thuốc viên theo công thức dưới đây: ( / ê ) tb t X m HL mg vi n m   Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học Vũ Thị Huệ - K23 Hóa Học Chuyên ngành hóa phân tích 32 Trường ĐHKHTN Trong đó: X: Lượng (mg) hoạt chất tìm được từ mô hình hồi qui đa biến mt: khối lượng cân của mẫu thử (mg) mtb: khối lượng trung bình của 1 viên của thuốc (mg) 2.2. Phương pháp phân tích đối chứng xác định các sulfamid 2.2.1. Phương pháp đối chứng xác định Sulfaguanidin Tiến hành: Định lượng bằng phương pháp chuẩn độ thể tích theo DĐVN 4. Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình viên và nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với khoảng 0,2 g sulfaguanidin, thêm 15 ml dung dịch acid hydrocloric 25% và 50 ml nước. Lắc kỹ, tiến hành chuẩn độ bằng nitrit (1 ml dung dịch natri nitrit 0,1M tương đương với 21,42 mg C7H10N4O2S.). Hàm lượng (%) sulfaguanidin trong chế phẩm được tính toán theo công thức dưới đây 21,42 ( / ê ) t a TB T V k m HL mg vi n m     Trong đó: Vt: thể tích dung dịch natri nitrit 0,1M đã chuẩn độ (ml) ka: hệ số hiệu chỉnh của dung dịch natri nitrit nếu nồng độ của dung dịch này không phải là 0,1M. mt: khối lượng cân của mẫu thử (mg) mtb: khối lượng trung bình của một viên thuốc (mg) 21,42: là hệ số quy đổi 1 ml dung dịch natri nitrit 0,1M tương đương với 21,42 mg C7H10N4O2S. 2.2.2. Phương pháp đối chứng xác định Sulfamethoxazol và Trimethoprim Tiến hành theo phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao như dược điển Mỹ USP 34- NF 29 [37]. như sau: Điều kiện sắc ký: Cột C 18 (250 x 4,6 mm; 5µm), detector UV: 254 nm, tốc độ dòng: 1,8 ml/ phút, thể tích tiêm: 20 µl. Pha động: 700ml nước + 200ml Acetonitril + 1ml triethylamin, điều chỉnh pH 5,9 ± 0,1 bằng dung dịch acid acetic 1% hoặc dung dịch natri hydroxyd 0,2N, thêm nước vừa đủ 1000 ml. Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học Vũ Thị Huệ - K23 Hóa Học Chuyên ngành hóa phân tích 33 Trường ĐHKHTN - Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 320mg sulfamethoxazol chuẩn và khoảng 64mg trimethoprim chuẩn vào bình định mức 100,0 ml, thêm 50ml methanol, lắc siêu âm hoà tan để nguội, thêm methanol đến vạch, lắc đều. Hút chính xác 5,0 ml dịch trên vào bình định mức 50,0ml, thêm pha động vừa đủ đến vạch. Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45µm. - Dung dịch thử: Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình rồi nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột chế phẩm tương ứng khoảng 320mg Sulfamethoxazol vào bình định mức 100,0ml, thêm 50ml methanol, lắc siêu âm hoà tan để nguội, thêm methanol đến vạch, lắc đều, lọc bỏ dịch đầu. Hút chính xác 5,0 ml dịch lọc trên vào bình định mức 50,0ml, thêm pha động vừa đủ đến vạch. Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45µm. Tiến hành sắc ký lần lượt với dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Tính lượng hàm lượng Sulfamethoxazol (C10H11N3O3S) và Trimethoprim (C14H18N4O3) có trong chế phẩm dựa vào diện tích pic trên sắc ký đồ của dung dịch thử, dung dịch chuẩn, hàm lượng của Sulfamethoxazol chuẩn, Trimethoprim chuẩn và các thông số liên quan.  Công thức tính toán hàm lượng sulfamethoxazol (mg/ viên) S S tbT S t m HL m E HL (mg/viê )= E m n    Trong đó: ES, Et: lần lượt là diện tích pic của dung dịch chuẩn, thử mS, mt: lần lượt là khối lượng cân của chuẩn, của thử (mg) HLS: hàm lượng nguyên trạng của sulfamethoxazol chuẩn (%) mtb: khối lượng trung bình của một viên thuốc (mg)  Công thức tính toán hàm lượng trimethoprim (mg/ viên) S S tbT S t m HL m E HL (mg/viê )= E m n    Trong đó: ES, Et: lần lượt là diện tích pic của dung dịch chuẩn, thử mS, mt: lần lượt là khối lượng cân của chuẩn, của thử (mg) HLS: hàm lượng nguyên trạng của trimethoprim chuẩn (%) mtb: khối lượng trung bình của một viên thuốc (mg) Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học Vũ Thị Huệ - K23 Hóa Học Chuyên ngành hóa phân tích 34 Trường ĐHKHTN 2.3. Hóa chất và thiết bị 2.3.1. Hóa chất - Chất chuẩn Sulfaguanidin (viện kiểm nghiệm thuốc trung ương, chuẩn phòng thí nghiệm), số kiểm soát: 0100111. Hàm lượng: 100,7% C7H10N4O2S (khan). Độ ẩm: 7,89%. Hàm lượng nguyên trạng: 92,11% - Chất chuẩn Sulfamethoxazol (viện kiểm nghiệm thuốc trung ương, chuẩn dược điển Việt Nam), số kiểm soát: 0107110. Hàm lượng: 100,24% C10H11N3O3S ( khan). Độ ẩm: 0,19%. Hàm lượng nguyên trạng: 100,05% - Chất chuẩn Trimethoprim (viện kiểm nghiệm thuốc trung ương, chuẩn dược điển Việt Nam), số kiểm soát: 0201109. Hàm lượng: 99,89% C14H18N4O3 (khan). Độ ẩm 0,1%. Hàm lượng nguyên trạng: 99,79% - KBr (Merck) - Tinh bột sắn (Nhà máy sản xuất tinh bột mì Quảng Ngãi), đạt tiêu chuẩn đã kiểm tra theo DĐVN 4 - Ca3(PO4)2 (Công ty cổ phần hóa dược Việt Nam), đạt tiêu chuẩn đã kiểm tra theo BP 2009. - Maltodextrin (Yisui dadi Corn developing Co., LTD), đạt tiêu chuẩn đã kiểm tra theo BP 2009. - Magie stearat (Peter Greven Asia SDN. BHD), đạt tiêu chuẩn đã kiểm tra theo USP34. - Bột Talc (Công ty cổ phần hóa dược Việt Nam), đạt tiêu chuẩn đã kiểm tra theo DĐVN 4 - Hóa chất tinh khiết phân tích: Acid Acetic, NaOH, Acetonitrin, triethylamin, Methanol (Merck) 2.3.2. Thiết bị và phần mềm máy tính - Cân phân tích Sartorious độ chính xác ± 0,0001g. - Máy quang phổ hồng ngoại Agilent Technologies Cary 600 Series FTIR spectrometer, dải số sóng đo 7500-2800 cm-1. Detector nhiệt DTGS Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học Vũ Thị Huệ - K23 Hóa Học Chuyên ngành hóa phân tích 35 Trường ĐHKHTN - Bộ dụng cụ ép viên: Agilent Technologies standard sampling kit (part no: Pike - 162 - 1000). - Thư viện phổ chuẩn: ST- Japan spectral libraries (part no: K8159 - 1000) - Phần mềm Matlab 7.6: Chương trình hồi qui đa biến tuyến tính PLS, CLS, ILS và PCR để phân tích đồng thời các cấu tử trong cùng hỗn hợp. - Hệ thống sắc ký lỏng Shimadzu LC-20A.; Cột sử dụng: C18 (250 x 4,6 mm; 5µm) 2.4. Chương trình máy tính của các phương pháp hồi quy đa biến 2.4.1. Phương pháp bình phương tối thiểu thông thường (CLS) * Các bước tính toán CLS trong phần mềm Matlab: - Khởi động phần mềm MATLAB - Nhập các ma trận dữ liệu trong cửa sổ WORKSPACE + Nhập ma trận nồng độ X0 (mxk) của m mẫu chuẩn chứa k cấu tử + Nhập ma trận tín hiệu phân tích Y0(mxn) (n là số tín hiệu đo) + Nhập tín hiệu phân tích Y của mẫu cần định phân - Lưu các dữ liệu vừa nhập vào thành 1 file trong Matlab : CLS.mat. [4, 8] - Mở một M-file trong cửa sổ EDITOR và viết các câu lệnh tại đó: %Phuong phap CLS: %Goi cac bien su dung trong phuong phap load CLS.mat; %Tinh ma tran he so hoi quy K: K=inv(X0'*X0)*X0'*Y0 ; %KIỂM TRA ĐỘ CHÍNH XÁC CỦA PHƯƠNG PHÁP: %Nhap ma tran tin hieu do hap thu quang cua mau kiem tra: Yktra %Nhap ma tran nong do cua mau ktra: X0ktra %Tinh nong do mau kiem tra: Xktra=Yktra*K'*inv(K*K'); %Tinh sai so giua nong do chuan voi nong do xac dinh duoc tu phuong phap CLS: Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học Vũ Thị Huệ - K23 Hóa Học Chuyên ngành hóa phân tích 36 Trường ĐHKHTN Saiso=(X0ktra-Xktra)*100./X0ktra; %TÌM NỒNG ĐỘ CỦA CHẤT TRONG MẪU BẤT KÌ %Nhap ma tran tin hieu do hap thu quang cua mau: Y X=Y*K'*inv(K*K'); - Lưu lại M-file vừa thực hiện được và đặt tên file: CLS - Gọi hàm M-file vừa viết được trong cửa sổ COMMAND WINDOW >> CLS - Chương trình sẽ tự động thực hiện các lệnh theo yêu cầu và hiển thị kết quả. - Kích chuột vào giá trị Saiso, X trong WORKSPACE thu được các dữ liệu mong muốn. 2.4.2. Phương pháp bình phương tối thiểu nghịch đảo ( ILS) * Các bước tính toán ILS trong phần mềm Matlab: - Khởi động phần mềm MATLAB - Nhập các ma trận dữ liệu trong cửa sổ WORKSPACE + Nhập ma trận nồng độ X0 (mxk) của m mẫu chuẩn chứa k cấu tử (m hàng, k cột) + Nhập ma trận tín hiệu phân tích Y0(mxn) (n là số tín hiệu đo) + Nhập tín hiệu phân tích Y của mẫu cần định phân - Lưu các dữ liệu vừa nhập vào thành 1 file trong Matlab : ILS.mat [4, 8] - Mở một M-file và viết các câu lệnh tại đó: %Phuong phap ILS: %Goi cac bien su dung trong phuong phap load ILS.mat; %Tinh ma tran he so hoi quy: P=inv(Y0'*Y0)*Y0'*X0; %KIỂM TRA ĐỘ CHÍNH XÁC CỦA PHƯƠNG PHÁP: %Tinh nong do chat trong mau kiem tra: Xktra=Yktra*P; %Tinh sai so giua nong do chuan voi nong do xac dinh duoc tu ILS: Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học Vũ Thị Huệ - K23 Hóa Học Chuyên ngành hóa phân tích 37 Trường ĐHKHTN Saiso= (X0ktra-Xktra)*100./X0ktra % TÍNH NỒNG ĐỘ CỦA CHẤT TRONG MẪU BẤT KÌ %Tinh nong do cua mau: X=Y*P - Lưu lại M-file vừa thực hiện được: ILS.m - Gọi M-file vừa viết được trong cửa sổ COMMAND WINDOW >> ILS - Chương trình sẽ tự động thực hiện các yêu cầu mong muốn và trả lại kết quả dưới dạng ma trận. Kích chuột vào giá trị Saiso, X trong WORKSPACE để hiển thị các ma trận số liệu đó. 2.4.3. Phương pháp bình phương tối thiểu từng phần (PLS) * Các bước tính toán PLS trong phần mềm Matlab: - Khởi động phần mềm MATLAB - Nhập các ma trận dữ liệu trong cửa sổ WORKSPACE + Nhập ma trận nồng độ X0 (mxk) của m mẫu chuẩn chứa k cấu tử (m hàng, k cột) + N