Luận văn Nghiên cứu đột biến một số exon của gen dj - 1 trên người bệnh parkinson

n phân và chúng được đặc trưng bởi mức tiêu thụ oxy cao, hàm lượng lipid và hoạt động trao đổi chất khiến chúng nhạy cảm hơn với tổn thương oxy hóa so với các tế bào khác [42]. Stress oxy hóa đã được chứng minh là đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của bệnh Parkinson [43]. DJ-1 mã hóa protein PARK7 có nhiệm vụ bảo vệ tế bào thần kinh chống lại stress oxy hóa, nó hoạt động như một cảm biến của stress oxy hóa bằng cách tương tác với các enzyme khác của hệ thống chống oxy hóa và bằng cách nâng cao biểu hiện của các gen qua đó bảo vệ chống oxy hóa tương ứng [44]. Mạng lưới enzyme bảo vệ chống oxy hóa bao gồm từ superoxide effutase, glutathione peroxidase, catalase và paraoxonase [45]. Sự biểu hiện quá mức của protein PARK7 thúc đẩy sự gia tăng nồng độ glutathione giúp bảo vệ tế bào thần kinh khỏi stress oxy hóa gây ra bởi H2O2 và 6-OHDA. Hơn nữa, các tế bào có mức độ PARK7 cao có khả năng chống lại stress oxy hóa và độc tố thần kinh, như 6-OHDA, trong khi mức độ thấp hơn của PARK7 khiến các tế bào dễ bị stress oxy hóa [43]. 30 Trong điều kiện stress oxy hóa, dư lượng cysteine được bảo tồn trong gen DJ- 1 (Cys106) bị oxy hóa và sự điều chỉnh oxy hóa này cho phép protein PARK7 hoạt động như một công cụ phản ứng oxy hóa ROS (reactive oxidative species) và như một cảm biến để cân bằng oxy hóa tế bào. Protein PARK7 chủ yếu được định vị trong tế bào chất, nhưng dưới tác động oxy hóa, nó có thể được chuyển vào trong ty thể và nhân lần lượt sau 3 và 12 giờ sẽ hoạt động như một tế bào chất (Hình 1.5) [47]. Quá trình oxy hóa Cys106 thành dạng sulfin (HSO2-) là cần thiết cho quá trình định vị ty thể và bảo vệ các tế bào chống lại stress oxy hóa và để ức chế sự hình thành fibrils của α- Synuclein. DJ-1 được chuyển vào nhân hoạt động như một hệ số cấu thành yếu tố phiên mã của các yếu tố phiên mã NF-kB vì nó không có vị trí gắn DNA riêng biệt [48]. Hình 1.5. Gen DJ-1 được kích hoạt như một chất chống oxy hóa (Nguồn:https://www.researchgate.net/publication/332848410_Role_of_DJ 1_in_the_mechanism_of_pathogenesis_of_Parkinson%27s_disease) 1.3.4. Tương tác của DJ-1 và ty thể Rối loạn chức năng ty thể đóng vai trò trung tâm của cơ chế thoái hóa thần kinh trong bệnh Parkinson. 31 Ty thể được coi là một trong những cơ quan sản xuất chính của các chất oxy hóa (ROS) trong tế bào. Sự sản xuất quá mức của ROS gây ra sự di chuyển nhanh chóng của DJ-1 sang ty thể, cho thấy rằng ty thể là một địa điểm cho hoạt động bảo vệ thần kinh của DJ-1 [49]. Trên hình ảnh kính hiển vi điện tử, DJ-1 đã được xác định có mặt trong cả trong ma trận ty thể và trong khoảng gian bào. Điều đó đã chỉ ra rằng DJ-1 được tập trung cùng với tiểu đơn vị phức hợp ty thể NDUFA4 ngay cả khi không có stress oxy hóa. Liên kết của DJ-1 với các tiểu đơn vị Phức hợp I của ty thể được tăng cường do stress oxy hóa [50]. Việc loại bỏ gen DJ-1 trong các tế bào thần kinh dopaminergic ở người đã dẫn đến khử cực của ty thể, sự phân mảnh và tích lũy các dấu hiệu tự phát xung quanh ty thể. DJ-1 ngăn chặn sự phân mảnh ty thể trong trường hợp ty thể bị độc rotenone (có trong một số thuốc trừ sâu) gây ra theo cách tương tự như PINK1 [51]. Tổn thương lan tràn của các tế bào thần kinh dopaminergic liềm đen đặc trưng cho bệnh Parkinson và nó là nguyên nhân chính gây suy yếu vận động [2]. Các sợi trục của hệ thống liềm đen - thể vân tạo thành một trong những vùng dài nhất trong não và có thể cần một ATP bổ sung để vận chuyển các thành phần đến các đầu tiếp hợp nằm ở vị trí xa hơn. Nó đã chỉ ra rằng tỷ lệ phosphoryl hóa trong phản ứng oxy hóa của ty thể và mức độ sản xuất ROS cơ bản đặc trưng cho các tế bào thần kinh dopaminergic liềm đen là cao hơn so với các tế bào thần kinh dopaminergic của VTA (vùng trần trung não) [52]. Hoạt động tạo nhịp của các tế bào thần kinh dopaminergic liềm đen được hướng đến là một trong những lý do cho nhu cầu năng lượng cao và tính dễ bị tổn thương của các tế bào này. Các tế bào thần kinh dopaminergic liềm đen là các máy tạo nhịp tự chủ, tạo ra khả năng hoạt động với tốc độ khá chậm (2-10 Hz) khi không có đầu synap vào [53]. Hoạt động của máy điều hòa nhịp là do các đặc tính của tiểu đơn vị tạo lỗ Cav1.3 của kênh Ca++ loại L điều chỉnh mức độ cơ bản của dopamine trong thể vân. Các dao động Cytosolic Ca++ trong các tế bào thần kinh dopaminergic của liềm đen khởi đầu Ca++ vào trong thành ty thể và kích thích sản xuất ATP. Kích hoạt hô hấp của ty thể trong trường hợp không có nhu cầu ATP cao dẫn đến tăng phân cực ty thể và tăng sản xuất ROS [52]. 32 1.3.5. Sự thiếu hụt gen DJ-1 DJ-1 là một gen đa chức năng và đột biến của nó có liên quan đến một số bệnh trong đó có các bệnh thoái hóa thần kinh, đột quỵ, tiểu đường type II và ung thư [44]. Việc xóa đồng hợp tử hoặc đột biến điểm trong gen DJ-1 ở người dẫn đến việc thay thế dư lượng acid amin proline bằng leucine (đột biến L166P) gây ra bệnh Parkinson khởi phát sớm. Các cấu trúc tinh thể của gen DJ-1 và đột biến L166P chứng minh rằng đột biến này ngăn chặn sự gấp khúc bình thường của vùng đầu C (C-terminal region). Sự thay đổi trong cấu trúc như vậy dẫn đến sự gián đoạn về tính chất vận chuyển và khả năng hình thành các dimer. Trái ngược với DJ-1 tạo thành các dimer, đột biến L166P tồn tại trong các tế bào dưới dạng monome [54]. Mất chức năng gen DJ-1 trong bệnh Parkinson có liên quan đến việc giảm hoạt động lysosomal và tổn thương ty thể. Chức năng và hoạt động của gen DJ-1 bị mất bởi đột biến L166P và đột biến này liên quan đến bệnh Parkinson [36]. 1.3.6. Đột biến gen DJ-1 trong bệnh Parkinson Bệnh Parkinson di truyền có liên quan đến locus PARK7 được xác định bởi Abou-Sleiman và cộng sự (2004) [33]. Bằng cách nhân dòng vị trí trong vùng quan trọng của PARK7, Bonifati và cộng sự (2007) [24] cũng đã xác định các đột biến trong gen DJ-1 trong hai gia đình người Hà Lan có quan hệ họ hàng, và cho thấy biểu hiện sự xóa bỏ bộ gen đồng hợp tử lớn bao gồm các exon 1–5 của gen DJ-1. Bệnh Parkinson liên quan đến gen DJ-1 phù hợp với di truyền lặn. Đột biến gen DJ-1 ít thường xuyên hơn đột biến gen Parkin ở bệnh nhân Parkinson khởi phát sớm và tần suất của chúng là khoảng 1% –2% bệnh nhân Parkinson [55]. Về mặt lâm sàng, bệnh Parkinson liên quan đến gen DJ-1 được đặc trưng bởi sự khởi phát sớm, tiến triển bệnh chậm và đáp ứng tốt với levodopa. Những đặc điểm này cũng phổ biến ở các dạng khác của bệnh Parkinson khởi phát sớm, bao gồm các liên quan đến gen Parkin và liên quan đến gen PARK6. Các rối loạn tâm thần (bao gồm cả lo âu trầm trọng và loạn thần), rối loạn hành vi sớm và các đặc điểm rối loạn vận động đều xuất hiện ở cả hai gia đình liên quan đến đột biến gen DJ-1 [55]. 33 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng và mẫu nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: + Nhóm bệnh: là các bệnh nhân bị bệnh Parkinson được thu thập theo phương pháp chọn mẫu thuận tiện, khi đến khám và điều trị tại Khoa Nội thần kinh Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 từ năm 2017 đến năm 2019. + Nhóm chứng: là những trường hợp được chẩn đoán không mắc bệnh Parkinson. - Mẫu nghiên cứu: là mẫu máu của hai nhóm bệnh và chứng. - Căn cứ vào mục đích nghiên cứu chúng tôi đưa ra các tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng nghiên cứu và mẫu như sau: * Tiêu chuẩn đối tượng nghiên cứu + Đối tượng nghiên cứu được giải thích rõ ràng mục đích lấy mẫu máu nghiên cứu và đồng ý cho lấy máu. + Đối tượng nghiên cứu đã được các bác sĩ chuyên khoa Nội Thần kinh khám và chẩn đoán là có mắc bệnh Parkinson hay không, theo đúng tiêu chuẩn Hội Ngân hàng Não và Parkinson, Vương quốc Anh [56]. Nhóm bệnh được chẩn đoán giai đoạn bệnh (5 giai đoạn) theo Hoen – Yahr [57]. * Tiêu chuẩn mẫu Mẫu máu của hai nhóm đối tượng nghiên cứu được thu thập và bảo quản đúng qui trình. 2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ - Những đối tượng không đồng ý tham gia nghiên cứu. - Bệnh nhân mắc hội chứng Parkinson. Bệnh nhân có tiền sử chấn thương sọ não và/hoặc tiền sử bị mắc các bệnh lý tâm thần kinh khác. 34 - Những mẫu máu không được lấy và bảo quản đúng qui trình. 2.1.3. Thiết kế nghiên cứu Sử dụng phương pháp nghiên cứu mô tả cắt ngang và chọn mẫu thuận tiện. 2.1.4. Sơ đồ nghiên cứu Đối chiếu một số đặc điểm lâm sàng trên bệnh nhân tương ứng 35 2.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 2.2.1. Hóa chất Các hóa chất chính được sử dụng trong nghiên cứu gồm:  Nhóm hóa chất dùng cho tách DNA tổng số: PBS, proteinase K 1U, dung dịch: phenol: chloroform: isoamyl alcohol (PCI), đệm lysis tách máu; dung dịch CH3COONa 3M pH 5,2 và pH 4; đệm TE; ethanol 100%, ethanol 70%; RNase.  Nhóm hóa chất dùng cho PCR: Taq DNA polymerase, Taq buffer, dNTP, mồi đặc hiệu.  Nhóm hóa chất dùng cho điện di gel agarose: agarose, đệm TAE, 6X DNA loading dye, ethidium bromide.  Nhóm hóa chất giải trình tự: BigDye® Terminator v3.1, BigDye® Sequencing Buffer, Hi-DiTM, Các hóa chất đảm bảo độ tinh sạch sử dụng trong sinh học phân tử và được cung cấp bởi các hãng có uy tín trên thế giới: Thermo Fisher Scientific (Mỹ); Promega (Mỹ), Sigma (Mỹ)... 2.2.2. Thiết bị Các loại máy móc thiết bị, dụng cụ chính được sử dụng: ống Eppendorf, các loại đầu côn, Pipet, bể ổn nhiệt, cân phân tích, máy li tâm thường, máy li tâm lạnh, máy Vortex, máy Spin Down, bộ điện di nhỏ, máy soi gel, máy chụp ảnh GelDoc, tủ lạnh -200C, tủ hút, máy làm đá, máy PCR AmpGen 9700 (Perkin – Elmet), máy giải trình tự Applied Biosystems 3500 Genetic Analyzer (ABI 3500). 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Thu thập đối tượng nghiên cứu và lập bệnh án nghiên cứu - Nhóm bệnh: * Chẩn đoán xác định bệnh Parkinson: 36 Bệnh nhân đã được các bác sĩ chuyên khoa Nội Thần kinh chẩn đoán là mắc bệnh Parkinson theo đúng tiêu chuẩn Hội Ngân hàng Não và Parkinson, Vương quốc Anh [56] như sau: + Có 3 triệu chứng chính (run lúc nghỉ, cứng đơ, giảm vận động). + Hoặc có 2/3 triệu chứng chính và đáp ứng tốt với thuốc điều trị đặc hiệu levodopa. * Chẩn đoán giai đoạn của bệnh Parkinson: Bệnh nhân được chẩn đoán giai đoạn bệnh theo Hoen – Yahr [57]. + Giai đoạn I: có các dấu hiệu một bên cơ thể. + Giai đoạn II: có các dấu hiệu ở một bên gây suy giảm chức năng, nhưng không mất thăng bằng cơ thể. + Giai đoạn III: có triệu chứng cả hai bên cơ thể với tư thế không vững, bệnh nhân vẫn tự chủ được trong hoạt động nhưng bị hạn chế nhất định. + Giai đoạn IV: bị suy giảm chức năng nặng, nhưng vẫn có thể đi đứng được với sự hỗ trợ một phần. + Giai đoạn V: bệnh nhân phải ngồi xe lăn hoặc tại giường, không vận động tự chủ được. * Chẩn đoán các rối loạn kèm theo Các rối loạn kèm theo như: rối loạn tâm thần, rối loạn nhận thức được các bác sĩ chuyên khoa chẩn đoán bằng các test tâm lý như MMSE, Beck. - Nhóm chứng: được các bác sĩ chuyên khoa Nội Thần kinh chẩn đoán là KHÔNG mắc bệnh Parkinson theo đúng tiêu chuẩn Hội Ngân hàng Não và Parkinson, Vương quốc Anh [56]. 2.3.2. Thu thập và bảo quản mẫu Mẫu sinh phẩm là 2 ml máu ngoại vi của mỗi đối tượng nghiên cứu được lấy vô trùng và được đựng trong các ống chuyên dụng chứa sẵn EDTA có tác dụng chống đông máu, đảm bảo không bị nhiễm bẩn, không bị lẫn các mẫu với nhau, đảm bảo đủ thông tin (tên, tuổi, giới, ngày lấy mẫu, mã số ID). 37 Mẫu được bảo quản trong điều kiện -20oC cho đến khi được sử dụng để tách chiết và phân tích DNA. 2.3.3. Phương pháp tách chiết DNA tổng số DNA tổng số được tách từ các mẫu máu theo phương pháp được mô tả bởi Sambrook và cộng sự (2001) [58] với một số cải tiến cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm. Các bước tiến hành như sau: 1. Mẫu máu được lấy ra khỏi tủ -20oC, để tan trong điều kiện thường, hút bỏ dịch huyết thanh bên trên sau đó đảo trộn kỹ lượng máu còn lại. 2. Thu tế bào: Thêm vào ống Eppendorf (1,5 ml) 0,7 ml máu, bổ sung 0,7 ml PBS 1X. Đảo trộn đều. Ly tâm 6000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ phòng (24oC). Hút bỏ dịch pha trên, chỉ giữ lại phần cặn tế bào dưới đáy ống. Lặp lại bước này 3 lần. 3. Ly giải tế bào: Bổ sung 0,6 ml dung dịch lysis và 6 µl proteinase K 1U và 2 µl RNase A, đảo đều. Ủ trong ~3h ở 56oC bằng bể ổn nhiệt, cho đến khi mẫu được ly giải hết. 4. Thu DNA: Bổ sung 0,6 ml phenol, lắc mạnh. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC. Thu dịch pha trên. Lặp lại với dung dịch phenol: chloroform: isoamyl alcohol và chloroform – isoamyl alcohol. Lúc này dịch thu được chủ yếu còn lại là DNA. 5. Tủa DNA: Bổ sung CH3COONa 3M với tỷ lệ DNA: CH3COONa là 1: 10 và ethanol 100% tỷ lệ DNA: ethanol là 1: 2, đảo trộn đều. Ủ qua đêm trong tủ -20oC. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC. Loại dịch pha trên và thu DNA dưới đáy ống. 6. Rửa tủa: Bổ sung 0,5 ml ethanol 70%, đảo đều, ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC. Loại dịch, thu cặn. Để tủa khô hoàn toàn ở nhiệt độ phòng. 7. Hòa tan tủa: Bổ sung 50 µl đệm TE, đảo đều để tủa tan hoàn toàn. 8. Bảo quản DNA: ở -20oC để chuẩn bị cho các bước tiếp theo. 38 2.3.4. Xác định độ tinh sạch và hàm lượng DNA tổng số Điện di DNA trên gel agarose Điện di DNA là phương pháp phổ biến dùng để phân tách các đoạn acid nucleic có kích thước và cấu hình khác nhau. Dưới tác dụng của điện trường trong môi trường đệm trung hòa hoặc kiềm, các acid nucleic tích điện âm sẽ di chuyển về phía điện cực dương theo nguyên tắc: các phân tử nhỏ sẽ di chuyển nhanh hơn các phân tử lớn, các phân tử có cấu hình cồng kềnh sẽ di chuyển chậm hơn các phân tử nhỏ gọn. Các phân tử này được phát hiện dưới tia UV sau khi nhuộm với ethidium bromide. Chúng tôi tiến hành kiểm tra kết quả tách chiết DNA tổng số bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8% pha trong đệm TAE 1X ở hiệu điện thế 110V. Thang DNA chuẩn sử dụng là 1 Kb plus. Nếu kết quả điện di chỉ cho 1 băng sáng duy nhất, kích thước tương ứng với băng lớn nhất của marker, không lẫn protein hoặc RNA, chứng tỏ DNA tổng số đã được tách chiết thành công. * Quy trình điện di kiểm tra - Đổ gel agarose 0,8%: hòa tan 0,8 g agarose trong 100 ml TBE 1X, đun sôi cho agarose hòa tan hoàn toàn. Để nguội xuống khoảng 60oC, đổ vào khay gel điện di có cài sẵn các răng lược thích hợp. Sau khoảng 30 phút trong nhiệt độ phòng, khi gel đã đông cứng, đặt vào bể điện di, đổ đệm TBE 1X ngập cách mặt gel từ 1–2 mm. - Tra mẫu: mỗi giếng tra 3 μl sản phẩm - Chạy điện di: tiến hành điện di với dòng điện một chiều có hiệu điện thế là 110 V trong thời gian khoảng 30 phút. - Chụp gel: bản gel được lấy ra khỏi khay và ngâm trong dung dịch ethidium bromide 10 μg/mL trong khoảng 10 phút, rửa sạch bản gel bằng nước cất. Chụp gel bằng máy chụp gel GelDoc. - Đánh giá kết quả dựa trên thang DNA chuẩn. 39 Đo mật độ quang phổ hấp thụ Để kiểm tra độ tinh sạch và hàm lượng DNA thu được, chúng tôi tiến hành xác định chất lượng của sản phẩm DNA bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ. Giá trị mật độ quang của các mẫu DNA cho phép xác định nồng độ của DNA trong dung dịch. Tỷ lệ A260/A280 biểu thị mức độ protein còn sót trong dịch chiết (do protein có phổ hấp thụ cao nhất ở bước sóng 280 nm, đồng thời hấp thụ ở bước sóng 260 nm). DNA được coi là sạch khi giá trị A260/A280 = 1,8 - 2,0. Với các mẫu đạt yêu cầu có chỉ số OD 1,8 – 2,0 và nồng độ DNA dao động từ 200 đến 500 µg/ml được pha loãng tới nồng độ 100 μg/ml để dùng làm khuôn cho phản ứng PCR. 2.3.5. Thiết kế mồi Mồi được kế thừa và hiệu chỉnh dựa trên trình tự các cặp mồi đã được công bố bởi Lockhart và cộng sự năm 1996 [59]. Dựa trên trình tự nucleotid của mỗi exon, chúng tôi sử dụng công cụ “Primer Blast’’/ NCBI để thiết kế các cặp mồi đặc hiệu (Bảng 2.1). Bảng 2.1. Trình tự mồi tương ứng của các exon 2, 3, 4, 5, 6, 7 gen DJ-1. Exon Trình tự mồi Kích thước 2 Mồi xuôi CTCTGCTTGAAAATGCTCC 392 bp Mồi ngược GGCAAGACATTAACAAGCG 3 Mồi xuôi TTAAAGACAGTGTTACTCTGAATT 388 bp Mồi ngược CATCCAGCCACCCACTTAC 4 Mồi xuôi GGCTATCTCCTGTACTTCCC 297 bp Mồi ngược TCACAGCCTCCTCCCGAA 5 Mồi xuôi AAATAGGTCAGAGAGCTTGTGG 258 bp Mồi ngược TCAAACCATCGAATGAAAGG 6 Mồi xuôi CTCAAGCAATTTTTCTACCT 297 bp Mồi ngược GAGGCTGAGAGAGAAGAATCG 7 Mồi xuôi ACAGTGTTGGGTTTATATGCTG 378 bp Mồi ngược GGACAGCGACTTCTGAACAC 40 2.3.6. Khuếch đại gen bằng kỹ thuật PCR Kỹ thuật PCR được Kary Mullis và các cộng sự phát minh (1985) [60], được sử dụng để khuếch đại một đoạn DNA bất kì khi biết trình tự nucleotid ở hai đầu DNA. Dựa vào trình tự đó, các cặp oligonucleotide được tổng hợp nhân tạo, mỗi oligo tạo liên kết bổ sung với từng sợi đơn. Chúng được sử dụng làm mồi để tổng hợp DNA in vitro nhờ enzym DNA polymeraza. Một phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ. Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn: (1) Giai doạn biến tính DNA thành dạng sợi đơn bằng cách nâng nhiệt độ lên 94- 95oC trong khoảng thời gian ngắn. (2) Giai đoạn bắt cặp: hai đoạn mồi chuyên biệt sẽ gắn với DNA tương đồng ở hai đầu đoạn DNA cần nhân dòng theo nguyên tắc bổ sung khi hạ nhiệt độ xuống dưới nhiệt độ Tm tương ứng của các mồi (khoảng 37-65oC); (3) Giai đoạn kéo dài chuỗi: phản ứng tổng hợp phân tử DNA kéo dài từ đoạn mồi, thực hiện ở 72oC nhằm tránh hiện tượng bắt cặp không đặc hiệu. Các bước thực hiện: - Chuẩn bị cho 25 μl hỗn hợp phản ứng theo tỷ lệ của nhà sản xuất - Các thành phần của phản ứng PCR (Bảng 2.2). Bảng 2.2. Các thành phần phản ứng PCR Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích Khuôn DNA 100 μg/ml 5 μl dNTP 2 mM 2 μl Taq buffer ( + Mg2+) 10X 1 μl Taq polymerase 1U 1,5 μl Mồi xuôi 10 pg/μl 1 μl Mồi ngược 10 pg/ μl 1 μl Nước khử ion 13,5 μl Tổng thể tích 25 μl 41 − Phản ứng được thực hiện với chu trình nhiệt: 95°C trong 7 phút, 25 chu kì (95°C, 30 giây; 50-65°C tùy theo mồi, 30 giây; 72°C, 15 giây); 72°C, 7 phút, sau đó giữ ở 4°C. − Kiểm tra sản phẩm PCR bằng cách điện di trên agarose 1%. − Tinh sạch sản phẩm PCR bằng kit QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen). 2.3.7. Giải trình tự DNA Phương pháp giải trình tự DNA được phát triển bởi Fred Sanger vào khoảng giữa những năm 1970 [61]. Thay vì sử dụng phản ứng hóa học, Sanger lựa chọn phương pháp sử dụng tới một dạng cấu trúc thứ ba của gốc đường ribose (Hình 1.6). Ribose có một nhóm hydroxyl ở cả hai vị trí carbon 2’ và 3’ trong khi deoxyribose chỉ có duy nhất một nhóm hydroxyl ở vị trí carbon 3’. Dạng thứ ba của ribose loại bỏ hydroxyl ở cả hai vị trí carbon 2’ và 3’. Dạng này được gọi là dideoxyribose, bất cứ khi nào một dideoxyribose được gắn vào một chuỗi polynucleotide thì quá trình kéo dài chuỗi đó sẽ bị dừng lại. Như vậy, sự kết hợp của các dideoxynucleotide riêng biệt sẽ tạo ra các chuỗi có kết thúc chọn lọc. Hình 1.6. Cấu trúc của ba loại đường 5 carbon. (các nhóm hydroxyl được biểu diễn bằng màu đỏ). (Nguồn: https://senthilarivan.wordpress.com/) Sanger đã thiết lập một quy trình với bốn phản ứng được thực hiện riêng biệt, kết hợp mỗi loại dideoxynucleotide khác nhau cùng với bốn deoxynucleotide. Quy trình này sẽ tạo ra các đoạn có kết thúc tại tất cả các vị 42 trí gắn của nhóm dideoxynucleotide, nếu tỷ lệ dideoxynucleotide và deoxynucleotide tương ứng được thiết lập đúng. Phương pháp giải trình tự Sanger đã làm tiền đề cho các nghiên cứu giải trình tự DNA, quỹ data các dữ liệu trình tự từ các nghiên cứu khoa học cũng dần dẫn đến việc thành lập các kho lưu trữ trình tự DNA đầu tiên bởi Walter Goad tại Phòng thí nghiệm Quốc gia Los Alamos năm 1979. Kho dữ liệu này sau đó trở thành GenBank [62]. Năm 1986, Leroy Hood và cộng sự [65] đã đưa ra một phương pháp giải trình tự DNA trong đó các tín hiệu phóng xạ được thay thế bằng tín hiệu huỳnh quang. Nhóm nghiên cứu đã sử dụng laser cảm ứng huỳnh quang liên kết với một hệ thống máy tính phân tích. Theo phương pháp này, mồi sẽ được gắn một trong bốn loại tín hiệu huỳnh quang khác nhau và được đưa vào các phản ứng giải trình tự riêng biệt cùng với một trong bốn loại dideoxynucleotide. Khi các phản ứng đã hoàn thành, bốn sản phẩm của phản ứng được gộp lại và chạy cùng nhau trong một làn của gel giải trình tự polyacrylamide. Một cảm biến laser bốn màu sẽ quét qua các đoạn di chuyển trong gel. Tín hiệu huỳnh quang của từng đoạn sau đó được gửi tới một máy tính với phần mềm được thiết kế để nhận diện các base. James M. Prober và cộng sự tại DuPont đã phát triển tiếp phương pháp giải trình tự gắn huỳnh quang [60]. Thay vì gắn huỳnh quang vào mồi, nhóm nghiên cứu này đã gắn tín hiệu vào các kết thúc dideoxy. Một bộ nhuộm bao gồm các succinylfluorescein, thay đổi bước sóng phản xạ thông qua các nhóm phụ khác nhau. Các loại thuốc nhuộm là: SF505, SF512, SF519, và SF526 được gắn lần lượt vào ddG, ddA, ddC, và ddT. Tất cả bốn loại nhuộm đều được kích thích bằng laser bước sóng 480 nm và mỗi loại sẽ phát ra một tín hiệu khác nhau được phát hiện bởi hệ thống cảm biến. Hệ thống phát hiện này cho phép phản ứng giải trình tự có thể được thực hiện trong một ống duy nhất với cả bốn loại ddNTP và quá trình đọc trình tự được thực hiện chỉ trong một lần duy nhất. Harold Swerdlow và cộng sự (1990) đã sử dụng phương pháp điện di mao quản trong giải trình DNA [63]. Mao quản điện di có kích thước nhỏ, đường kính bên trong là 50 μm, có khả năng tản nhiệt rất hiệu quả do diện tích bề mặt lớn. Do đó, hệ thống mao quản có thể chạy với điện áp cao hơn từ 43 đó giảm thời gian thực hiện. Hơn nữa, hệ thống mao quản có thể chạy tự động, đây là một ưu điểm lớn so với hệ thống sử dụng gel. Vào năm 1993, B.L. Karger và cộng sự [60] đã sử dụng một loại chất nền phân tách độ nhớt thấp, là tiền đề để phát triển một nền tảng giải trình tự thông lượng cao ngày nay (Hình 1.7). Hình 1.7. Sơ đồ biểu diễn của một hệ thống giải trình tự DNA mao quản. A. Các thiết lập cơ bản của một hệ thống mao quản. Phản ứng giải trình tự được chứa trong ngăn chứa mẫu, đệm điện di được chứa trong ngăn thứ hai, mao quản được bơm đầy polymer, một điện thế được đưa vào hai đầu mao quản. B. Tín hiệu phát ra từ các đoạn giải trình tự khi đi qua laser quét, được thu nhận thông qua các cảm biến sáng, thông tin sẽ được chuyền về máy tính. C. Biểu đồ tín hiệu đầu ra. (Nguồn: https://senthilarivan.wordpress.com/) Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành giải trình tự DNA trên máy điện di mao quản Applied Biosystems 3500 Genetic Analyzer (ABI 3500). Quy trình được tiến hành theo hướng dẫn đi kèm máy. 44 − Chuẩn bị thành phần phản ứng. Bảng 2.3. Thành phần phản ứng giải trình tự Thành phần Lượng BigDye® Terminator v3.1 4 µl BigDye® Sequencing Buffer 2 µl Mồi 3,2 pmol Khuôn 5-20 ng Nước Thêm tới 20 µl − Chạy phản ứng với chu trình nhiệt: 96°C trong 1 phút, 25 chu kì (96°C, 10 giây; 50°C, 5 giây; 60°C, 4 phút); sau đó giữ ở 4°C. − Tinh sạch sản phẩm Bổ sung 5 µl EDTA 125 mM và 60 µl ethanol 100%. Trộn đều, ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút tại 4°C. Loại bỏ phần dịch sau đó bổ sung 60 µl ethanol 70%. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút tại 4°C rồi loại bỏ phần dịch. Làm khô và bảo quản ở 4°C. − Biến tính Bổ sung 20 µl Hi-DiTM rồi trộn đều dung dịch. Biến tính ở 95°C trong 5 phút. − Điện di mao quản Chuyển mẫu sang plate. Đặt chương trình cho máy đọc trình tự. − Xử lí thô kết quả 45 2.3.8. Phân tích số liệu Trình tự đọc được từ hệ thống giải trình tự ABI 3500 được trả về dưới dạng file AB1 bao gồm hai loại dữ liệu: trình tự nucleic acid và cường độ của tín hiệu mà hệ thống ghi nhận được. Tiến hành đọc và chỉnh sửa trên phần mềm BioEdit v7.2.5. Thông qua độ mạnh yếu của tín hiệu thu được, chúng tôi có thể xác định một cách tương đối chất lượng của đoạn trình tự đã đọc được. Từ đó, tiến hành cắt bỏ đoạn trình tự có chất lượng thấp, nhằm làm tăng độ tin cậy cho đoạn trình tự thu được (contig). Đồng thời tr