Luận văn Nghiên cứu hiện trạng nhiễm bệnh TSWV (Tomato spotted wilt virus) trên cây ớt bằng kỹ thuật ELISA và bước đầu xây dựng phương pháp chẩn đoán bằng kỹ thuật RT - PCR
MỤC LỤC Trang tựa . ii Cảm tạ . iii Tóm tắt . iv Danh sách các chữ viết tắt . vi Mục lục . vii Danh sách các bảng . xi Danh sách các đồ thị . xi Danh sách các hình . xii Danh sách các sơ đồ . xii Phần I. Mở Đầu . 1 1.1 Đặt vấn đề . 1 1.2 Mục Đích - Yêu cầu . 1 1.2.1 Mục đích nghiên cứu . 1 1.2.2 Yêu cầu . 1 Phần II. Tổng Quan Tài Liệu . 2 2.1 Giới thiệu về cây ớt . 2 2.1.1 Sơ lƣợc về cây ớt . 2 2.1.2 Nguồn gốc cây ớt . 2 2.1.3 Đặc điểm thực vật học của cây ớt . 2 2.1.3.1 Thân . 2 2.1.3.2 Rễ . 2 2.1.3.3 Lá . 2 2.1.3.4 Hoa . 3 2.1.3.5 Quả . 3 2.1.3.6 Hạt . 3 2.1.4 Giá trị dƣợc liệu của cây ớt . 3 2.1.5 Giá trị dinh dƣỡng của ớt . 4 2.2 Một số bệnh trên cây ớt gây ra bởi các virút khác . 4 2.3 Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh của cây ớt . 9 viii 2.3.1 Nhiệt độ. 9 2.3.2 Ánh sáng . 9 2.3.3 Ẩm độ . 9 2.3.4 Đất và dinh dƣỡng . 9 2.4. Giới thiệu về Tomato spotted Wilt Virus (TSWV) . 10 2.4.1 Sơ lƣợc nguồn gốc TSWV . 10 2.4.2 Cấu trúc TSWV . 10 2.5 Hình thức tấn công và gây bệnh . 13 2.6 Triệu chứng chung trên các loại cây trồng bị nhiễm TSWV . 14 2.7 Triệu chứng cụ thể trên cây ớt . 14 2.8 Con đƣờng lây bệnh và dịch tễ học . 15 2.9 Điều kiện cho bệnh phát triển . 16 2.10 Khống chế bệnh TSWV . 16 2.11 Chẩn đoán bệnh TSWV . 18 2.11.1 Phƣơng pháp cây chỉ thị . 18 2.11.1.1 Cây nhiễm bộ phận . 18 2.11.1.2 Cây nhiễm hệ thống . 18 2.11.2 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử. 19 2.12 ELISA . 19 2.12.1 Khái niệm về ELISA . 19 2.12.2 Phân loại ELISA . 20 2.12.2.1 Direct ELISA (ELISA trực tiếp) . 20 2.12.2.2 ELISA gián tiếp . 21 2.12.2.3 Sandwich ELISA . 21 2.12.2.4 Phản ứng ức chế /cạnh tranh . 22 2.12.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến độ nhạy của phản ứng ELISA . 23 2.12.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả ELISA . 23 2.13 Giới thiệu về kỹ thuật PCR . 23 2.13.1 Nguyên tắc của kỹ thuật PCR . 23 2.13.2.Tối ƣu hóa các điều kiện cho phản ứng PCR . 25 2.13.3 Ƣu, nhƣợc điểm của kỹ thuật PCR . 30 2.13.4 Các vấn đề thƣờng gặp trong phản ứng PCR và hƣớng giải quyết . 31 ix 2.13.4.1 Có nhiều sản phẩm không chuyên biệt có kích thƣớc dài hơn . 31 2.13.4.2 Có nhiều sản phẩm không đặc hiệu với kích thƣớc ngắn hơn . 32 2.13.4.3 Không thu đƣợc bất kỳ sản phẩm nào. 32 2.13.4.4 Sản phẩm quá yếu . 33 2.13.4.5 Hai primer có nhiệt độ Tm khác nhau . 33 2.14 Phƣơng pháp RT-PCR . 33 2.14.1 Phân loại RT – PCR . 33 2.14.1.1 Phản ứng RT – PCR một bƣớc . 33 2.14.1.2 Phản ứng RT – PCR hai bƣớc . 34 2.14.2 Các phƣơng pháp đƣợc thực hiện trong phản ứng tổng hợp cDNA . 34 2.15 Những nghiên cứu trong nƣớc và trên thế giới về mức độ gây hại của TSWV . 35 2.15.1 Những nghiên cứu tại Việt Nam . 35 2.15.2 Những nghiên cứu trên thế giới . 35 Phần III. Vật Liệu và Phƣơng Pháp Nghiên Cứu . 36 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu . 36 3.2 Phƣơng pháp điều tra và lấy mẫu . 36 3.3 Phƣơng pháp lấy mẫu . 36 3.4 Các phƣơng pháp chẩn đoán TSWV . 37 3.4.1 Chẩn đoán bằng dDAS – ELISA . 37 3.4.1.1 Dụng cụ và hoá chất cần thiết cho việc chẩn đoán bằng ELISA . 37 3.4.1.2 Các bƣớc thực hiện . 37 3.4.2 Chẩn đoán TSWV bằng RT – PCR . 39 3.4.2.1 Giai đoạn ly trích RNA theo Kit ly trích của Biorad . 39 3.4.2.2 Kiểm tra sự hiện diện của RNA bằng điện di . 40 3.4.2.3 Lựa chọn cặp Primer chạy RT – PCR . 40 3.4.2.4 Khuếch đại bằng RT – PCR . 41 3.4.2.5 Phƣớng pháp đổ gel agarose điện di . 43 Phần IV. Kết quả Thảo luận . 45 4.1 Mức độ nhiễm bệnh TSWV ở 3 xã đại diện cho 3 huyện qua chẩn đoán ELISA . 45 4.1.1 Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV theo địa bàn điều tra . 45 4.1.2 Tỷ lệ nhiễm TSWV theo từng giống ớt . 46 4.1.3 Tỷ lệ nhiễm virút TSWV theo triệu chứng . 47 x 4.1.4 Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV theo độ tuổi . 50 4.2 Kết quả tiến trình RT – PCR . 51 4.2.1 Kết quả kiểm tra RNA . 51 4.2.2 Kết quả kiểm tra Primer . 52 4.2.3 Kết quả tiến trình RT – PCR. 53 4.2.4 Kết quả tiến trình thiết kế primer cho Nested PCR . 54 Phần V. Kết luận và đề nghị . 60 5.1 Kết luận. 60 5.2 Đề nghị . 60 Phần VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO . 61 PHẦN VII. PHỤ LỤC . 64
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- Nghiên cứu hiện trạng nhiễm bệnh TSWV trên cây ớt bằng kỹ thuật ELISA và bước đầu xây dựng phương pháp chẩn đoán bằng kỹ thuật RT - PCR.pdf