Luận văn Nghiên cứu khả năng sinh enzym cellulase của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ

1 g (vết) - CMC : 10 g - Agar : 20 g - Nước biển : 1000ml - pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/ 30 phút  MT 6: MT thử hoạt tính protease [10] - NaNO3 : 3,5 g - K2HPO4 : 1,5 g - MgSO4.7H2O : 0,5 g - KCl : 0,5 g - FeSO4.7H2O : 0,01 g (vết) - Cazêin : 15 g - Agar : 20 g - Nước biển : 1000ml - pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/ 30 phút  MT 7: MT thử hoạt tính amylase [47] - NaNO3 : 3,5 g - K2HPO4 : 1,5 g - MgSO4.7H2O : 0,5 g - KCl : 0,5 g - FeSO4.7H2O : 0,01 g (vết) - Tinh bột tan : 15 g - Agar : 20 g - Nước biển : 1000ml - pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/ 30 phút  MT 8: MT thử hoạt tính kitinase [22] - NaNO3 : 3,5 g - K2HPO4 : 1,5 g - MgSO4.7H2O : 0,5 g - KCl : 0,5 g - FeSO4.7H2O : 0,01 g (vết) - Bột kitin : 10 g - Agar : 20 g - Nước biển : 1000ml - pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/ 30 phút * Cách chiết kitin từ vỏ, đầu tôm - Vỏ, đầu tôm rửa sạch, sấy khô. - Xử lý tách protein bằng dung dịch NaOH 4% ở 70-750C/ 4 giờ, sau đó rửa sạch bằng nước cất. - Tách khoáng bằng dung dịch HCl 8% ở 26- 300C/ 16 giờ, rửa sạch. - Sấy khô, xay nhuyễn thành dạng bột, bảo quản trong lọ thủy tinh.  MT 9: MT phát hiện khả năng phân giải dầu [29] - KH2PO4 : 0,3 g - MgSO4 : 0,4g - KNO3 : 3 g - Na2HPO4 : 0,7 g - Nước biển : 1000ml - Dầu DO : 5ml - pH = 5,5- 6,0. Khử trùng ở 1atm/ 30 phút  MT nuôi cấy nấm sợi tạo enzym  MT 10: MT xốp cơ sở [18], [30] - Cám : 60% - Bột đậu nành : 30% - Bột ngô : 10% - Trấu : bổ sung thêm 25% - Độ ẩm : 60% - pH = 5,0 – 5,5. Khử trùng 1atm/ 60 phút  MT nuôi cấy giữ giống vi khuẩn kiểm định  MT 11 : MT Meat pepton agar (MPA) [27] - Pepton : 5g - NaCl : 5g - Cao thịt : 5g - Agar : 20g - Nước cất : 1000 ml - pH= 7,5. Khử trùng 1atm/ 30 phút 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp lấy mẫu từ RNM Cần Giờ [58] Tiến hành lấy mẫu ở các xã thuộc huyện Cần Giờ: xã Bình Khánh, xã Tam Thôn Hiệp, xã An Thới Đông, xã Long Hòa, xã Bình Khánh, Lâm Viên….Đi sâu vào các rừng già, cách biển khoảng 2 km, các điểm lấy mẫu cách nhau khoảng 200m. Vị trí lấy mẫu theo những vị trí chấm đỏ trên bản đồ (hình 2.1). Lấy mẫu phân lập trong 3 tháng (tháng 7, 8, 9), mỗi tháng lấy mẫu một lần. Khu vực lấy mẫu là vùng nước lợ có độ mặn 30 ‰ , nhiệt độ khoảng 290C, pH 7,6. Hình 2.1. Vị trí lấy mẫu ở RNM Cần Giờ Lấy các mẫu đất mặt, đất cách bề mặt 5- 10 cm, lá vàng sắp rụng, lá rụng bị mục, thân cành chết khô còn trên cây, thân cành chết đang bị phân hủy trên mặt đất. Cách lấy: Dùng dao, kéo vô trùng cắt khoảng 20g mẫu cho vào túi nilon vô trùng buộc kín, đánh số, ghi địa điểm lấy mẫu, ngày tháng, bảo quản trong thùng nước đá vận chuyển về PTN và giữ ở tủ giống 40C. Các mẫu được phân lập ngay không giữ quá 24 giờ. 2.2.2. Phương pháp vi sinh 2.2.2.1. Phương pháp phân lập mẫu trực tiếp và pha loãng mẫu theo Uyenco, 1988 [58], [78] a- Lấy mẫu và pha loãng mẫu Lấy 10g mẫu lá, đất, thân, cho vào túi lọc mẫu, thêm 90ml nước biển Cần Giờ vô trùng. Dập mẫu bằng máy nghiền mẫu trong vòng 2 phút, tốc độ 230 vòng/ phút. Túi lọc mẫu giữ lại chất hữu cơ, phần dịch hơi đục chảy ra bên ngoài. Lấy dịch lọc ta được dung dịch pha loãng 10-1. Lắc đều, rồi hút 1 ml dung dịch 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước biển vô trùng ta được dung dịch pha loãng nồng độ 10-2. Tiếp tục pha loãng như thế ta được dung dịch nồng độ 10-3, 10-4, 10-5. b- Cấy mẫu Nhỏ 2 giọt dung dịch ở mỗi nồng độ lên đĩa petri chứa MT1, MT2, MT3. Dùng que trang trải đều khắp mặt thạch. Sau đó sử dụng que trang đó trải tiếp hai đĩa tiếp theo. c- Ủ mẫu Lật ngược đĩa petri, gói vào giấy báo cũ, ủ ở nhiệt độ phòng từ 3 – 7 ngày. Chọn KL riêng rẽ cấy truyền sang ống nghiệm thạch nghiêng. d- Làm thuần Lấy một KL riêng rẽ trong ống thạch nghiêng, hòa vào nước biển vô trùng, trải lên đĩa lần hai. Nếu các dạng KL đồng đều, có màu sắc giống nhau, soi dưới KHV đều có một dạng tế bào chứng tỏ giống phân lập thuần khiết. Sau đó chọn KL riêng rẽ cấy truyền sang 3 ống thạch nghiêng để bảo quản và nghiên cứu các đặc điểm hình thái sinh lí, sinh hóa. 2.2.2.2 Phương pháp bảo quản giống nấm sợi trên MT thạch có lớp dầu khoáng [6] Dầu khoáng là parafin hay vaselin, hấp vô trùng ở 1210C trong 2 giờ rồi sấy khô ở 1700C trong 1- 2 giờ, để nguội. Chuẩn bị 3 ống giống đã nuôi ở nhiệt độ phòng và thời gian thích hợp. Đổ lớp dầu khoáng đã vô trùng lên bề mặt. Hàn kín ống nghiệm bằng parafin bảo quản ở nhiệt độ 40C. Phương pháp này có thể bảo quản trong 1- 3 năm. 2.2.2.3. Phương pháp quan sát đại thể nấm sợi [5], [6], [11] Nấm sợi sau khi cấy truyền sang thạch nghiêng, ta tiến hành tạo khuẩn lạc (KL) khổng lồ theo các bước sau: - Cho vào ống nghiệm 5 ml nước biển vô trùng. - Dùng que cấy lấy một ít bào tử từ ống giống thạch nghiêng cho vào ống nghiệm. Lắc đều tạo dung dịch huyền phù. - Dùng que cấy chấm vào dung dịch huyền phù rồi nhanh chóng chấm điểm vào mặt thạch ở giữa hộp petri. Làm 2,3 hộp. - Ủ ấm trong một tuần để tạo KL. Hàng ngày lấy ra quan sát. Dùng kính lúp ba chiều soi mô tả các đặc điểm: + Kích thước KL để biết tốc độ phát triển của nó. + Hình dạng KL. + Màu sắc KL mặt phải, mặt trái và sự thay đổi màu sắc. + Màu sắc của MT do sắc tố nấm sợi tạo ra. + Dạng sợi nấm mọc ở mặt trên MT. + Đặc điểm của mép KL. + Giọt nước đọng, chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt KL……. 2.2.2.4. Phương pháp quan sát vi thể nấm sợi [6] Phương pháp cấy khối thạch của J.T.Dunean - Chuẩn bị MT thích hợp, đổ một lớp thật mỏng (khoảng 1mm) trong các đĩa petri. - Dùng khoan nút chai vô trùng có d = 8 mm, khoan các khối thạch. - Chuẩn bị các đĩa petri sạch, phiến kính, lá kính, bông thấm nước, nước cất vô trùng. - Đặt 1 hoặc 2 khối thạch trên mỗi phiến kính. Cấy một ít bào tử lên bề xung quanh khối thạch. Đặt lá kính vô trùng lên trên bề mặt các khối thạch. - Các phiến kính có khối thạch cấy nấm sợi nghiên cứu được đặt trong các hộp petri có sẳn một ít bông thấm nước được làm ẩm bằng nước cất vô trùng. Giữ các hộp petri này trong tủ ấm 3-4 ngày. - Khẽ gỡ lá kính ra, úp lên một phiến kính sạch có một giọt thuốc nhuộm lactophenol, ta được tiêu bản thứ nhất. - Gỡ bỏ lớp thạch và để nguyên phần nấm sợi trên phiến kính, nhỏ giọt lactophenol, đậy lá kính lên trên là ta được tiêu bản thứ hai. - Dùng kính hiển vi (KHV) quan sát, vẽ và mô tả các đặc điểm: + Hình dạng cuống sinh bào tử. + Hình dạng thể bình. + Hình dạng các thể bọng. + Sợi nấm có hay không có sự phân nhánh và vách ngăn. + Đặc điểm bào tử đính. + Màu sắc, kích thước bào tử… - Chụp hình trên KHV quang học ở độ phóng đại 400-1000 lần. 2.2.2.5. Phương pháp lên men bán rắn để thu nhận enzym cellulase [3], [22], [29], [34],[36], [40], [42] a. Nguyên tắc Nấm sợi sử dụng chất dinh dưỡng có sẳn trong MT để sinh trưởng tạo thành một lượng lớn enzym ngoại bào lẫn trong MT, ta thu được sinh khối nấm sợi lẫn enzym thô. b. Cách tiến hành Nấm sợi được nuôi cấy trong ống nghiệm thạch nghiêng chứa MT PGA ủ trong tủ ấm trong thời gian 4-5 ngày. Rửa bào tử từ bề mặt thạch nghiêng với dung dịch chứa Tween 80 0,1%, thu được huyền phù bào tử của từng chủng. Cho vào bình tam giác chứa 30g MT 11 đã làm ẩm và hấp khử trùng ở 1atm trong 60 phút. Nuôi ủ ở nhiệt độ phòng trong 3- 4 ngày. Sau khi nuôi đủ thời gian, thu lấy MT đem sấy nhẹ, có quạt gió ở nhiệt độ 400C để đạt độ ẩm 8- 12%, nghiền nhỏ, bảo quản trong chai, lọ sứ thuỷ tinh. Chế phẩm này gọi là chế phẩm enzym thô [40], [29], [14]. 2.2.2.6. Phương pháp ly trích enzym cellulase [29] a. Nguyên tắc Dựa trên khả năng hòa tan trong nước của các enzym trong nước cất tạo thành dịch enzym. b. Cách tiến hành Chế phẩm enzym thô thu được đem sấy khô ở 400C, nghiền mịn, cho nước cất vào với tỉ lệ 1: 3, lắc trên máy lắc với tốc độ 200 vòng /phút/ 1 giờ. Sau đó ly tâm với tốc độ 3000 vòng/ phút/ 15 phút, thu dịch trong, làm lạnh. Để giảm ảnh hưởng của đường tự do có trong môi trường lên men, đem tủa dịch lọc bằng cồn 960 đã làm lạnh theo tỉ lệ (1:3). Thu tủa và hòa lại bằng dung dịch đệm Na-acetate 50mM, pH5, ta được dịch enzym sử dụng dần. 2.2.3. Phương pháp hóa sinh 2.2.3.1. Phương pháp xác định hoạt độ enzym carboxymethyl cellulase (CMCase) [28], [40] a. Nguyên tắc Một đơn vị hoạt tính CMCase là lượng enzym cần thiết để giải phóng ra đường khử (như glucose) khi thủy phân CMC ở tốc độ 1µmol/phút dưới các điều kiện phản ứng. Phương pháp này dựa vào sự thủy giải cơ chất carboxymethyl cellulose (CMC) bằng enzym carboxymethyl cellulase (CMCase) ở pH 5,0 và 400C. Sau phản ứng sẽ tạo ra một lượng đường khử, đường khử sẽ phản ứng với 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic acid tạo thành phức màu đỏ sậm và được xác định bằng máy đo mật độ quang ở bước sóng 540nm. b. Cách tiến hành Các hóa chất cần chuẩn bị: - Dung dịch cơ chất CMC 1%: Cân chính xác 1,0g CMC, hòa tan trong 80 ml dung dịch đệm Na-acetate 50mM, pH 5, chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm dung dịch đệm đến vạch và lắc đều. - Dung dịch enzym: Pha loãng dịch enzym với dung dịch đệm Na- acetate 50 mM, pH 5,0 đến độ pha loãng thích hợp. - Dung dịch acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic (DNS). - Dung dịch lactose. - Dung dịch DNS-lactose. * Dựng đường glucose chuẩn Hòa tan 100 mg glucose với 80 ml nước cất và chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều, ta được dung dịch glucose nồng độ 1mg/ml. Thực hiện một loạt 7 ống nghiệm theo bảng sau đây: Số thứ tự các ống/ nồng độ glucose (mg/ml) 1/0 2/0,1 3/0,2 4/0,3 5/0,4 6/0,5 7/0,6 - dd glucose 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 - dd CMC 1% 1 1 1 1 1 1 1 - dd DNS- lactose 2 2 2 2 2 2 2 C ác c hấ t b ổ s un g (m l) - Nước cất 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 Lắc đều các ống nghiệm này, đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát. So màu trên máy quang phổ UV/Visible Spectrophometer, bước sóng 540 nm. Dựa vào sự tương quan giữa nồng độ glucose chuẩn và độ hấp thụ OD dựng đường biểu diễn sự biến thiên của OD và nồng độ glucose chuẩn. Đường này là một đường thẳng đi qua gốc tọa độ. * Tiến hành phản ứng - Hút 1ml dung dịch enzym cho vào ống nghiệm thử thật (ống TN), thay 1 ml dung dịch đệm Na-acetate 50mM, pH 5 đối với ống đối chứng (ĐC) - Đặt vào bể ổn nhiệt 400C/5 phút. Đồng thời ta cũng để chai chứa lượng dung dịch CMC 1% thích hợp ở 400C/5 phút. - Sau đó, thêm 1 ml dung dịch CMC 1% vào ống nghiệm chứa enzym và lắc đều. Để phản ứng ở 400C chính xác 10 phút. - Thêm 2 ml dung dịch DNS-lactose, lắc đều để phản ứng enzym. - Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát. - So màu ở bước sóng 540nm, dựa theo đường glucose chuẩn tính được nồng độ glucose của mẫu thí nghiệm. c. Tính kết quả - Giá trị hệ số glucose trung bình (F): F = (0,1/AG0,1 + 0,2/AG0,2 +….+0,6/AG0,6)/6 - Hoạt tính enzym : CMCase (IU/g) = ( AT – AB) x F x (1.000/180) x (1/10phút) x (1/1.0 ml) x (1/C) Trong đó: F : Hệ số glucose (mg/ml) AG : Độ hấp thu OD của dung dịch glucose chuẩn. AT : Độ hấp thụ của dung dịch có phản ứng enzym (ống TN) AB : Độ hấp thu của dung dịch không có phản ứng enzym (ống ĐC). 1.000: Hệ số chuyển đổi mg thành µg. 180 : Trọng lượng phân tử của glucose, đổi từ µg sang µmol. 10 phút: Thời gian phản ứng. 1.0 : Thể tích dung dịch enzym (ml). C: Nồng độ dung dịch mẫu (g/ml). 2.2.3.2. Phương pháp xác định hoạt độ enzym ngoại bào của nấm sợi bằng cách đo đường kính vòng thủy phân [47] a. Nguyên tắc Cho enzym tác dụng lên cơ chất trong MT thạch, cơ chất bị phân hủy, độ đục MT giảm, MT trở nên trong suốt. Độ lớn của phần MT trong suốt phản ánh hoạt động của enzym. Phương pháp này chỉ định tính enzym, chỉ đánh giá sơ bộ chứ chưa nghiên cứu sâu. b. Tiến hành thí nghiệm * Phương pháp cấy chấm điểm - Chuẩn bị các chủng nấm sợi nghiên cứu và các MT thử hoạt tính enzym ngoại bào với các cơ chất tương ứng MT 6, MT7, MT8, MT9, MT10. - Cấy chấm điểm các chủng nấm sợi (3 điểm) lên bề mặt MT. - Ủ trong tủ ấm 300C trong 3-4 ngày. * Phương pháp khuếch tán trên MT thạch - Thu dịch nuôi cấy: Lấy 10g MT nuôi cấy nấm sợi trên MT11 đã ủ 3 ngày trong tủ ấm, sấy khô, nghiền với 100ml nước cất, ly tâm 10 phút, tốc độ quay 5000 vòng/ phút. Thu được dịch enzym thô. - Dùng khoan nút chai (d=8mm) vô trùng, khoan các lỗ thạch trên MT thử hoạt tính các enzym cellulase, protease, amylase, kitinase trên các đĩa petri. Dùng pipet vô trùng nhỏ 0,1ml dịch enzym vào các lỗ khoan. Giữ các hộp petri ở tủ lạnh 40C trong 1- 2 giờ, sau đó chuyển sang giữ trong tủ ấm trong 24 giờ. Sau 24 giờ dùng thuốc thử lugol, HgCl2 nhỏ lên bề mặt thạch và đo đường kính vòng phân giải bằng thước đo KL. c. Kiểm tra kết quả - Kiểm tra hoạt tính cellulase, amylase, kitinase. Cả ba loại enzym này đều dùng thuốc thử lugol nhỏ lên bề mặt thạch:  Nếu nấm sợi có hoạt tính cellulase sẽ tạo vòng trong suốt quanh KL hoặc lỗ khoan chứa dịch enzym do cellulose bị phân giải.Vùng cellulose chưa bị phân giải có màu tím hồng nhạt.  Nếu nấm sợi có hoạt tính amylase sẽ tạo vòng trong suốt xung quanh KL hoặc lỗ khoan có chứa dịch enzym.Vùng tinh bột chưa bị phân giải có màu xanh tím đậm.  Nếu nấm sợi có hoạt tính kitinase, vùng kitin chưa bị phân giải có màu nâu đỏ nhạt. - Kiểm tra hoạt tính protease: Dùng HgCl2 nhỏ lên bề mặt thạch. Nếu nấm sợi sinh ra protease, sẽ có một vòng trong suốt quanh KL hoặc quanh lỗ khoan, do các phân tử protein bị phân giải không còn phản ứng với HgCl2. Vùng chứa protein chưa bị phân giải có màu trắng đục do khi phản ứng vớI HgCl2 protein bị kết tủa. d. Đánh giá khả năng tạo enzym Đặt sấp hộp petri. Dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D) và đo đường kính KL (d), hoặc đường kính lỗ thạch (d=8mm). Dựa vào kết quả (D-d, mm) để đánh giá hoạt tính enzym của các chủng nấm sợi. Nếu giá trị (D-d) càng lớn thì khả năng sinh enzym của nấm sợi càng cao. - Quy ước:  D-d ≥ 25mm : hoạt tính enzym mạnh.  D-d ≥ 20mm : hoạt tính enzym khá mạnh  D-d ≥ 15mm : hoạt tính enzym trung bình.  D-d ≤ 10mm : hoạt tính enzym yếu. 2.2.3.3. Phương pháp kiểm tra hoạt tính kháng sinh [21] a. Nguyên tắc Chất kháng sinh do nấm sợi sinh ra sẽ ức chế sự phát triển của VSV kiểm định làm cho VSV không phát triển được xung quanh lỗ khoan chứa dịch kháng sinh hay khối thạch chứa nấm tạo thành vòng vô khuẩn trong suốt. b. Cách tiến hành - Cấy nấm sợi trên MT YEA không có thạch, rồi ủ ba ngày ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 3000 vòng/ 10 phút, thu dịch kháng sinh. - Dùng khoan nút chai khoan các khối thạch của MT có chứa VSV kiểm định (E.coli, Bacillus subtilis). - Dùng pipet vô trùng nhỏ 0,1ml dịch kháng sinh vào các lỗ khoan. - Để trong tủ lạnh 40C trong 8 giờ để dịch kháng sinh khuếch tán vào trong thạch. Sau đó chuyển sang tủ ấm 300C. Kiểm tra vòng ức chế sau 24h. c. Kiểm tra kết quả Nếu nấm nghiên cứu sinh ra chất kháng sinh sẽ có một vòng trong suốt xung quanh khối thạch do các chất kháng sinh đã ức chế sự phát triển của VSV kiểm định tạo thành vòng tròn trong suốt (vòng vô khuẩn) xung quanh lỗ khoan. Khả năng sinh kháng sinh được đáng giá bằng hiệu số (D-d, mm). Quy ước:  D-d ≥ 25mm : hoạt tính kháng sinh rất mạnh.  D-d ≤ 20mm : hoạt tính kháng sinh mạnh.  D-d= 15 ÷18mm : hoạt tính kháng sinh trung bình.  D-d < 15mm : hoạt tính kháng sinh yếu. 2.2.3.4. Phương pháp kiểm tra khả năng phân giải dầu [29] Cấy nấm sợi trong bình tam giác 100 ml có chứa 50 ml MT khoáng (MT 10). Sau 15 ngày nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ phòng, sau đó đo sinh khối của nấm sợi, quan sát sự phân bố các giọt dầu và mùi dầu để đánh giá khả năng phân giải dầu của nấm sợi. Cách đo sinh khối nấm sợi: Khi cho bào tử nấm sợi vào bình tam giác, đo khối lượng của bình tam giác bằng cân phân tích điện tử. Sau khi nuôi cấy 15 ngày, cân lại bình tam giác để biết được sinh khối của nấm sợi. 2.2.3.5. Phương pháp xác định ảnh hưởng yếu tố MT đến sinh trưởng và phát triển của nấm sợi  Phương pháp thử khả năng đồng hóa nguồn cacbon, nitơ [21] - Để xác định ảnh hưởng của nguồn cacbon tới sự sinh trưởng của nấm sợi nghiên cứu, chúng tôi sử dụng MT1 trong nước biển, glucose lần lượt được thay bằng các nguồn cacbon: lactose, sucrose, maltose, sorbitol, galactose. Trọng lượng các chất thay thế được lấy đúng bằng hàm lượng cacbon trong MT1. Mẫu đối chứng là MT1. - Để xác định ảnh hưởng của nguồn nitơ, dùng MT1. Nguồn NaNO3 lần lượt được thay bằng các nguồn nitơ khác: Bột đậu, cao thịt, cazêin, gelatin, urea, NH4NO3 với hàm lượng tương tự. Mẫu đối chứng là MT 1. Cấy chấm điểm các nấm sợi nghiên cứu lên bề mặt các MT tương ứng, sau đó để trong tủ ấm trong 3 ngày, đánh giá khả năng sử dụng nguồn cacbon, nitơ bằng mức độ phát triển của các KL bằng cách đo đường kính KL d (mm). Quy ước: * d = 0 mm : không mọc * d =1÷ 2mm : mọc yếu * d = 2,1 ÷ 5mm : mọc trung bình * d = 5,5 ÷ 10mm : mọc tốt * d = 11 ÷ 30mm : mọc rất tốt  Phương pháp thử khả năng chịu mặn của nấm sợi [21] - Chuẩn bị MT YEA (MT3), có bổ sung các nồng độ muối NaCl từ 3%, 5%, 7%, 10%. - Cấy 3 điểm các chủng nấm sợi nghiên cứu lên trên bề mặt các MT nghiên cứu có nồng độ muối khác nhau. - Nuôi trong tủ ấm trong 3 ngày. - Dựa vào đường kính KL d (mm) của các chủng nấm sợi nghiên cứu để đánh giá khả năng chịu mặn. - Mẫu đối chứng nuôi trên MT không có nước biển.  Phương pháp xác định ảnh hưởng của pH [21] Sử dụng MT1 trong nước biển, điều chỉnh pH bằng NaOH 10% hoặc HCl 10% để có các giá trị pH khác nhau: 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0. Thanh trùng MT rồi cấy chấm điểm các giống nấm sợi nghiên cứu, sau đó để trong tủ ấm trong 3 ngày. Đánh giá mức độ sinh trưởng của các chủng nấm sợi dựa vào đường kính KL d (mm) theo quy ước như 2.2.3.3.  Phương pháp thử khả năng chịu nhiệt của nấm sợi [21] Sử dụng MT 1, cấy chấm điểm các chủng nấm sợi nghiên cứu. sau đó ủ ở các nhiệt độ khác nhau: 250C, 300C, 400C, 500C trong 3 ngày. Đánh giá mức độ sinh trưởng của nấm sợi dựa vào đường kính KL d (mm).  Phương pháp xác định ảnh hưởng của thời gian [21] Sử dụng MT 1, cấy chấm điểm các giống nấm sợi nghiên cứu. Sau đó ủ trong tủ ấm. Mỗi ngày đo đường kính KL để biết tốc độ sinh trưởng của nó. 2.2.3.6. Phương pháp xác định các yếu tố ảnh hưởng của MT đến khả năng sinh enzym cellulase của nấm sợi [3], [22].  Ảnh hưởng nguồn cacbon Để xác định ảnh hưởng các nguồn cacbon khác nhau đóng vai trò là chất cảm ứng đến khả năng sinh tổng hợp enzym cellulase, ta tiến hành nuôi các chủng nấm sợi trên MT bán rắn với tỉ lệ cacbon khác nhau như sau: - 6 cám: 4 trấu (6C:4T) - 6 cám: 4 bã mía (6C:4BM) - 6 cám : 4 giấy lọc (6C:4GL) - 6 cám : 4 mạt dừa (6C:4MD) - 6 giấy lọc : 4 cám (6GL:4C) Mẫu đối chứng là MT xốp cơ sở (MT 11).  Ảnh hưởng nguồn nitơ Để xác định ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ đến quá trình sinh tổng hợp cellulase, ta tiến hành nuôi trên MT 11 có bổ sung thêm 0,5% Urê. 0,5% (NH4)2SO4, 0,5% NaNO3, 0,5% pepton, 0,5% cao thịt, 0,5% cao nấm men, 0,5% cao malt [3].  Ảnh hưởng pH Để xác định ảnh hưởng pH đến quá trình sinh tổng hợp enzym cellulase của các chủng nấm sợi nghiên cứu, tiến hành nuôi trên MT 11. Dùng HCl 5% NaOH 5% điều chỉnh pH MT về các độ pH 3, 4, 5, 6, 7, 8.  Ảnh hưởng độ ẩm Để xác định ảnh hưởng độ ẩm đến sinh tổng hợp enzym cellulase ta cũng nuôi trên MT 11 điều chỉnh độ ẩm bằng nước biển vô trùng về các độ ẩm 50%, 55%, 60%, 65%, 70%.  Ảnh hưởng độ mặn Để xác định ảnh hưởng của độ mặn đến quá trình sinh tổng hợp enzym cellulase, ta cũng nuôi trên MT 11 với các nồng độ muối khác nhau 0%, 3%, 5%, 10%, 20%.  Ảnh hưởng nhiệt độ Để xác định ảnh hưởng của nhiệt độ ta cũng nuôi trên MT 11 và ủ ở các nhiệt độ khác nhau 250C, 300C, 400C, 500C.  Ảnh hưởng thời gian Để xác định ảnh hưởng thời gian ta cũng nuôi trên MT 11 ở các thời gian khác nhau 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ, 72 giờ. Sau khi nuôi ủ, ly trích enzym cellulase theo phương pháp 2.2.2.6 và đánh giá khả năng sinh enzym cellulase theo phương pháp 2.2.3.1. 2.2.4. Phương pháp thực nghiệm 2.2.4.1. Phương pháp xác định khả năng đường hóa giấy in, giấy báo cũ đã qua sử dụng của enzym cellulase [40] Giấy in đã qua sử dụng được xay vụn bằng máy xay sinh tố, cho khoảng 0,6g lượng giấy vào ống nghiệm có chứa dịch 6ml enzym cellulase thu được. Cho phản ứng ở 500C, pH 4,8 trong 24 giờ. Định lượng đường khử bằng thuốc thử DNS dựa vào đường chuẩn theo phương pháp 2.2.3.1. Khả năng đường hoá giấy loại của enzym được tính như sau: Hiệu suất (%) = lượng đường khử (g) x 0,9 x (100/lượng giấy (g)) 2.2.4.2. Phương pháp đánh giá độ chín của phân ủ (Subrao- indian, 1980) [48] a. Nguyên tắc Dựa trên khả năng phân giải cellulose có trong rơm rạ của dịch enzym cellulase thô tạo thành mùn. b. Cách tiến hành Mẫu thí nghiệm (TN): Tiến hành ủ đống rơm rạ bằng phương pháp ủ quy mô nhỏ: - Ủ trong hộp xốp nhỏ. - Rơm rạ lấy từ ruộng lúa mới thu hoạch. - Bổ sung thêm: 0,5% NH4NO3, 0.5% ure và 5% dịch chiết enzym cellulase thô đã nuôi từ nấm sợi trên MT xốp cơ sở (MT11) trong 4 ngày. - Điều chỉnh độ ẩm về 60- 65%, pH 6-7. - Ủ 1 tháng ở nhiệt độ 300C. Mẫu đối chứng (ĐC): Ủ rơm rạ ở điều kiện tự nhiên không bổ sung thêm dịch nuôi cấy. Sau 1 tháng tiến hành so sánh lô ĐC với lô thí nghiệm (TN) ở các chỉ tiêu: - Nhiệt độ đống ủ trong tuần đầu. - Nhiệt độ đống ủ trong tuần cuối. - Nước chảy ra. - Độ giảm chiều cao của đống ủ. - Màu sắc của rơm rạ. - Độ dai của rơm. Sau đó, đánh giá độ chín của phân ủ còn gọi là độ “hoai” của phân ủ bằng phương pháp thử nghiệm đối với cây trồng. Gieo hạt đậu xanh trên khay chứa lượng phân sau khi đã ủ 1 tháng. Sau 7 ngày thu hoạch kiểm tra trọng lượng tươi, tỉ lệ hạt nảy mầm của cây đậu. Mức độ chín của phân ủ được đánh giá thông qua tỷ lệ nảy mầm, trọng lượng tươi trên mỗi khay. Nếu tỉ lệ nảy mầm trên 60% / 5g hạt đậu xanh/ khay và trọng lượng từ 60-100 g/ 5g hạt đậu xanh/ khay thì phân ủ đã “chín”. Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym cellulase từ RNM Cần Giờ 3.1.1. Phân lập các chủng nấm sợi từ RNM Cần Giờ Qua 3 tháng tiến hành lấy mẫu theo phương pháp ở phần 2.2.2.1 từ đất mặt, đất sâu 5-10cm, lá vàng còn trên cây, lá mục, thân, cành khô, mục, chúng tôi đã phân lập được 312 chủng nấm sợi khác nhau như bảng 3.1. Bảng 3.1. Sự phân bố các chủng nấm sợi Cơ chất phân lập Số lượng chủng nấm sợi Tỷ lệ % Đầt: - Đất mặt - Đất sâu 5-10 cm 114 93 21 36,5% 29,8% 6,7% Lá: - Lá vàng - Lá mục 96 34 62 30,8% 10,9% 19,9% Thân: - Thân khô - Thân mục 102 39 63 32,7% 12,5% 20,2% (Ghi chú: Kết quả bảng 3.1 được tổng hợp từ phụ lục 13) Từ kết quả ở bảng 3.1 cho thấy ở RNM Cần Giờ hệ nấm sợi vô cùng phong phú. Chúng phân bố rộng rãi trên tất cả các cơ chất như trên lá, thân, cành cây, trên mặt đất và cả trong đất sâu 5-10cm. Trong đó, các chủng nấm sợi có trong MT đất là nhiều nhất (114/312 chủng) chiếm 36,5% tổng số nấm sợi phân lập được. Số chủng nấm sợi sống trên lớp đất mặt nhiều hơn lớp đất sâu. Điều này có thể giải thích do nấm sợi là VSV hiếu khí, do đó lớp đất mặt là nơi có nguồn O2 và nguồn thức ăn là xác lá, thân, cành, động vật, vỏ xác tôm cua, giáp xác…đang bị phân hủy. Đồng thời, với điều kiện thủy triều lên xuống hàng ngày nên lớp đất mặt luôn giữ được độ ẩm thích hợp cho các chủng nấm sợi sinh trưởng phát triển. Số chủng nấm sợi trên cơ chất lá (30,8%), trên thân cành (32,7%) ít hơn trong đất. Do RNM Cần Giờ là nơi có thảm thực vật rất dày đặc, thức ăn chủ yếu là hợp chất hữu cơ giàu cellulose, không đủ các nguồn dinh dưỡng như trong đất. Đồng thời, nước mưa sẽ làm rửa trôi lượng lớn bào tử nấm sợi. Đặc biệt, trên cơ chất lá mục và thân cành mục số lượng nấm sợi nhiều hơn. Vì đây là những nguồn hữu cơ đang bị phân hủy, một phần đã phân giải thành glucose là nguồn cacbon mà nấm dễ hấp thụ nhất [29]. Như vậy, MT sống ở RNM Cần Giờ mặc dù rất khắc nghiệt nhưng có đầy đủ các yếu tố cần thiết cho nấm sợi sinh trưởng và phát triển. Chúng sử dụng các chất hữu cơ sẳn có để tồn tại, đồng thời tham gia phân hủy các chất thải, giúp giảm bớt ô nhiễm MT ở RNM Cần Giờ. Từ các chủng thuần khiết phân lập được nói trên, chúng tôi tiến hành tuyển chọn các chủng nấm dựa trên khả năng sinh enzym cellulase của chúng. 3.1.2. Tuyển chọn những chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym cellulase  Tuyển chọn lần 1 Kiểm tra khả năng sinh enzym cellulase của 312 chủng nấm sợi theo phương pháp 2.2.3.2. Kết q