Luận văn Nghiên cứu nhân giống các dòng bạch đàn lai UE35 và UE56 giữa eucalyptus urophylla và e. exserta bằng phương pháp nuôi cấy mô

chiều cao 5,1 - 11,4 m, thì Bạch đàn đỏ có đường kính là 4,3 - 9,7 cm, chiều cao 3,4 - 6,9 m; còn Bạch đàn caman có các chỉ tiêu này tương ứng là 1,8 - 6,3 cm và 3,1 - 7,4 m (Lê Đình Khả, 1970), nghĩa là giống Bạch đàn lai tự nhiên này có thể tích thân cây gấp 4 - 5 lần các loài cây bố mẹ. Điều thú vị là ngay từ khi phát hiện ra đời F2 của Bạch đàn lai tự nhiên có hiện tượng phân ly theo kiểu nhị hạng thức bậc n dạng (a + b) n, theo 5 dạng khác nhau với tỷ lệ phân ly theo phần trăm là 1,7: 14,0: 58,4: 8,3: 1,0 mà cây lai F2 thiên về hệ mẹ là Bạch đàn caman (Lê Đình Khả, 1970). Đáng tiếc trong thời kỳ này do chưa có kỹ thuật giâm hom thích hợp nên Bạch đàn lai đã không được phát triển vào sản xuất ở Việt Nam. Một số nơi đã thử xây dựng vườn giống bằng cây ghép song cũng không thành công. Lai nhân tạo cho các loài Bạch đàn E. urophylla, E. exserta và E. camaldulensis ở Việt Nam đã được trung tâm nghiên cứu giống cây rừng thực hiện từ năm 1997. Đến năm 2000 hơn 60 tổ hợp lai giữa 3 loài nói trên đã được tạo ra, trong đó một số dòng hoặc tổ hợp lai sinh trưởng gấp 1,5 - 2 lần bố mẹ. Một bộ giống gồm nhiều tổ hợp lai khác loài UC, UE, EU, UC, và UU đã được khảo nghiệm so sánh với các xuất xứ tốt nhất của các loài bố mẹ như UEgon, U27, U28, U29, E1, E2, E4. Khảo nghiệm được tiến hành tại Thụy Phương (Hà Nội), Cẩm Quỳ (Hà Tây) và một số vùng khác trong nước. Khảo nghiệm đã cho thấy lai thuận nghịch ở những điều kiện lập địa khác nhau, sinh trưởng của các tổ hợp lai cũng thay đổi theo từng điều kiện lập địa. Ví dụ, ở Thụy Phương tổ hợp lai có sinh trưởng nhanh nhất là giống Bạch đàn urô với Bạch đàn caman. Trong khi ở Ba Vì các tổ hợp lai có sinh trưởng nhanh nhất lại là giữa Bạch đàn urô và Bạch đàn liễu (Lê Đình Khả, Nguyễn Việt Cường, 2002). Sau khi đã tạo được tổ hợp lai và khảo nghiệm giống lai đã chọn lọc được một số cây trội trong các tổ hợp lai có sinh trưởng nhanh nhất, vượt xuất xứ Egon 19 Flores của E. urophylla (xuất xứ tốt nhất) về thể tích lá 51,3 - 247,4% (có thể tích thân cây gấp 1,5 - 3,5 lần giống sản xuất tốt nhất). Năm 2001 Bộ NN&PTNT đã có quyết định số 4356 (ngày 19/9) công nhận 31 cây trội thuộc 8 tổ hợp lai U29E1, U29E2, U29C3, U29C4, U29U4, U29U26, U15C4, U30E5 (Lê Đình Khả, Nguyễn Việt Cường, 2001). Các giống lai này đã được Nguyễn Việt Cường và cs (2007, 2008) tiếp tục khảo nghiệm ở một số nơi từ đó đã chọn được các dòng vô tính sinh trưởng nhanh đã được Bộ NN&PTNT công nhận là giống quốc gia hoặc giống tiến bộ kỹ thuật. Khảo nghiệm tại lâm trường Vạn Xuân cho thấy các dòng Bạch đàn lai được chọn có một số dòng sinh trưởng vượt trội rõ rệt so với các dòng đối chứng như: U6, GU8, PN2, PN14 cả về đường kính, chiều cao và chỉ số thể tích thân cây, đặc biệt là các dòng U29E1.24, U29E2.5, U15E4.83. Những dòng này có chỉ số thể tích (Iv = D 2H) bằng 70,4 - 73,9, trong khi dòng Bạch đàn GU8 có chỉ số thể tích 50,3, còn các dòng khác như PN2, PN14 và U6 có chỉ số thể tích thân cây là 23,5 - 31,7 (Lê Đình Khả et al, 2003). Một số tổ hợp lai khác loài mới giữa các loài E. tereticornis (T), E. pellita (P), E. camandulensis (C) và E. urophylla (U) được tạo ra sau này và khảo nghiệm tại Minh Đức (tỉnh Bình Dương) cũng thấy rằng sau 2 năm các tổ hợp lai T1P17, C1P17, P18U29C3, v.v… có thể đạt thể tích thân cây 21,8 - 26,1 dm3/cây, trong lúc giống U29 có thể tích thân cây 9,7 dm3/cây, một số giống sinh trưởng kém nhất trong khảo nghiệm chỉ đạt 6,8 - 8,5 dm3/cây (Nguyễn Việt Cường, 2006). Theo quy trình trồng Bạch đàn urophylla của ta (04-TCN-26-2001) quy định mật độ trồng rừng là 1100 - 1660 cây/ha. Song kết quả nghiên cứu của Stape C.R., C.R. Silva (2007) cho nhiều công thức mật độ trồng Bạch đàn khác nhau tại Brazin đã thấy là mật độ 500-900 cây/ha chưa cho năng suất cao, mật độ 1500 cây/ha bắt đầu có năng suất cao, những mật độ khác năng suất tăng lên không đáng kể. Vì thế với Bạch đàn chúng tôi chỉ dùng một mật độ trồng 1660 cây/ha với các công thức bón phân khác nhau. 24 P. radiate ở viện nghiên cứu lâm nghiệp New Dilan; Thông P. taera và Pseudotsuga menziesii ở Mỹ. Darus H. Ahmas thuộc viện nghiên cứu lâm nghiệp Malaysia đã nuôi cấy mô tế bào cây keo tai tượng (Accasia mangium) bằng môi trường MS có bổ sung 3% Sucrose, 0,6% agar và 0,5 mg/l BAP cho giai đoạn nhân chồi. Những chồi có chiều cao >0,5cm được cấy vào môi trường tạo rễ và chất điều hoà sinh trưởng tốt nhất cho tạo rễ là IBA 1000 ppm với tỷ lệ ra rễ là 40% (O. L. Gamborg, G. C. Phillips, 1997). Người ta cũng đã nhân giống thành công Phi lao bằng biện pháp nuôi cây mô và đã trồng so sánh với cây hạt trong nhà kính. Kỹ thuật này đang được áp dụng để tạo cây mô Phi lao sinh trưởng nhanh, kháng bệnh và cố định đạm cao cho trồng rừng (Nguyên Quang Thạch, 2000). Các biện pháp nuôi cấy mô cũng đã được áp dụng cho cây Tếch (Tectona grandis). Gupta và các cộng sự (1979) đã mô tả sự hình thành cụm chồi từ phần cắt của cây non và từ mầm cây 100 tuổi, từ đó họ có thể tạo được 500 cây nuôi cấy mô từ một chồi ở cây trưởng thành và 3000 cây từ 1 cây non trong một năm. Kaosaard (1990) cho biết Thái Lan cũng phát triển thành công kỹ thuật nuôi cấy mô vào năm 1986 cho cây Tếch và cho phép tạo ra 500.000 chồi từ một chồi trong một năm (Ikemori, Y.K., 1987). Perhutani (Indonesia, 1991) đã thử nghiệm và nuôi cấy mô thành công đối với loài Tếch và một vài cây mô đã được đem trồng thử. Nhân giống nuôi cấy mô tế bào đối với cây rừng đã thu được những thành công đáng kể, đây là một khâu quan trọng góp phần tăng năng suất rừng trồng trên thế giới trong những năm gần đây. Trong đó phải kể đến công nghệ nhân giống nuôi cấy mô cây Tếch, các dòng Bạch đàn chọn lọc ở Thái Lan, Trung Quốc, các loài Bạch đàn lai ở Brazin, Công Gô, Australia, cây Vân sam (Picea), Thông Radiata (Pinus radiata) ở New Zealand, Thông Caribê (Pinus caribaea) và Thông lai (P. caribaea x P. elliottii) ở Austraylia… (Dr. Phundan sigh, 2001). W.Nitiwattanachai (Trindate, H. Ferreina, J. G. Pais, M. S. Aloni, R., 1990) đã nuôi cấy thành công cây Keo lá tràm (Acacia auriculiformis). Môi trường nhân 25 nhanh chồi là MS (1962) + 10 μM BAP + 0,5 μM IBA, môi trường sử dụng cho tạo rễ là White (1963) + 2 μM IBA + 1 μM NAA. Cũng với cây Keo tai tượng, V.J. Hartney và cs thuộc (Division of Forest Research) đã sản xuất cây con thành công bằng nuôi cấy chồi in vitro. Môi trường nuôi cấy được sử dụng là WPM + 3% Sucrose + 0,8 % agar + 1 μM BAP + 1 μM NAA. Nhiệt độ trong quá trình nuôi cấy duy trì ở 250C (± 40C), giai đoạn khử trùng mẫu để tạo vật liệu ban đầu tác giả đã sử dụng muối hypoclorite 4% và khử trùng trong thời gian 20 phút (sharma, J.K., 1994). 1.7.2. N cây gỗ Bạch đàn là một trong các loài cây trồng rừng chính của Việt Nam, không chỉ đối với trồng rừng tập trung mà còn cả đối với trồng cây phân tán, trồng cây trong các hộ gia đình. Cho tới trước những năm 1970 đã có trên 50 loài Bạch đàn được khảo nghiệm ở Việt Nam và từ đó đến nay đã có hàng chục loài được khảo nghiệm trên diện rộng với khá nhiều xuất xứ làm cơ sở cho chọn loài và xuất xứ sinh trưởng nhanh phục vụ trồng rừng đại trà (Lê Đình Khả, Nguyễn Hoàng Nghĩa, Hoàng Trương, 1993). Những cơ sở hiện nay đang nhân giống bằng nuôi cấy mô ở quy mô lớn trong lâm nghiệp nước ta là Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng thuộc viện khoa học lâm nghiệp, Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy Phù Ninh Phú Thọ, Công ty giống lâm nghiệp trung ương, trung tâm khoa học sản xuất và ứng dụng Quảng Ninh, xí nghiệp giống Thành Phố Hồ Chí Minh, Trường đại học Lâm nghiệp… Hiện nay một số tỉnh và địa phương đã thành lập phòng nuôi cấy mô để phục vụ cho công tác giống cây trồng và đã đạt được những thành công bước đầu. Nuôi cấy mô ở nước ta đã áp dụng rộng rãi trong công tác nhân giống một số giống Bạch đàn nhập nội, các dòng vô tính Bạch đàn lai và keo lai có năng suất cao. Cùng với những kết quả về cải thiện giống Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng đã nghiên cứu thành công kỹ thuật nuôi cây mô tế bào cho Keo lai, Bạch đàn và một số cây rừng khác (Lê Đình khả và cs, 2003). 28 CHƢƠNG 2 MỤC TIÊU, ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mục tiêu nghiên cứu Xác định môi trường (hoá học và vật lý) phù hợp để nhân giống 2 dòng UE35 và UE56 của bạch đàn lai giữa (E. urophylla x E. exserta) bằng phương pháp nuôi cấy mô. Tạo ra cây con hoàn chỉnh bằng phương pháp nuôi cấy mô cho các dòng UE35 và dòng UE56. Huấn luyện và cấy cây con ra vườn ươm. 2.2. Đối tƣợng nghiên cứu Tiến hành nghiên cứu nhân giống cho 2 dòng UE35 và dòng UE56. Hai dòng này đã được tuyển chọn và trồng khảo nghiệm dòng vô tính tại trung tâm nghiên cứu giống cây rừng thuộc Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam. Dòng Bạch đàn lai UE35 và UE56 đã được tuyển chọn thông qua khảo nghiệm dòng vô tính và được cho là nhóm có sinh trưởng tương đối nhanh. Hai dòng Bạch đàn UE35 và UE56 là cây trội được chọn từ các tổ hợp lai U29E2 và U29E4, đây là những tổ hợp lai thuộc nhóm có sinh trưởng nhanh thích hợp cho trồng rừng trên đất nghèo dinh dưỡng đồi núi miền Bắc. Dòng UE35 được tạo ra từ đề tài lai giống Bạch đàn (Lê Đình Khả, 2001), đã qua khảo nghiệm giống. Cây lấy mẫu là cây 1,5 tuổi trồng tại Trung tâm giống cây rừng thuộc viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam và chồi gốc của cây 3 năm trồng thí nghiệm tại Cẩm Quỳ (Hà Nội) (Lê Đình Khả, Nguyễn Việt Cường, 2001) và (Lê Đình Khả, Nguyễn Việt Cường, Ngô Minh Chí, 2007). 29 Mẫu nuôi cấy (explant) lấy từ chồi bên của cây cấp dòng. Mẫu được lấy ở chồi 15 ngày tuổi, sinh trưởng tốt, không sâu bệnh. Chồi được cắt bỏ phần ngọn non, một phần cuống lá mà toàn bộ phiến lá. Mẫu cấy có chiều dài từ 1,5 - 3cm, đường kính từ 2 - 3mm mang từ 2-3 nách lá, trong đoạn từ lá thứ 3 - 6. Đề tài tiến hành nghiên cứu ở phòng thí nghiệm và vườn ươm tại Trung tâm nghiên cứu giống cây lâm nghiệp thuộc Viện khoa học Việt Nam và khu nuôi cấy mô tế bào - Viện khoa học sự sống thuộc Trường đại học Nông Lâm Thái Nguyên. 2.3. Nội dung nghiên cứu Để đạt được mục đích nghiên cứu, đề tài thực hiện các nội dung sau đây: 1. Khử trùng mẫu vật nuôi ở các nồng độ khác nhau của HgCl2 và Ca (0Cl)2 trong các khoảng thời gian khác nhau để tìm ra chất khử trùng mẫu thích hợp. 2. Nuôi cấy mẫu trong 5 loại môi trường và xác định môi trường thích hợp cho giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu và nhân nhanh chồi. 3. Thử nghiệm ảnh hưởng của vitamin B2 tới hệ số nhân chồi (HSNC) và tỷ lệ chồi hữu hiệu (TLCHH) của quá trình nuôi cấy. 4. Thử nghiệm ảnh hưởng của một số chất điều hoà sinh trưởng và ảnh hưởng phối hợp của chúng đến HSNC và tỷ lệ chồi hữu hiệu (TLCHH). 5. Thử nghiệm ảnh hưởng của một số chất điều hoà sinh trưởng và ảnh hưởng của chúng đến hiệu quả của giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh (giai đoạn tạo rễ). 6. Thử nghiệm ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và sinh trưởng chiều cao của cây con ở giai đoạn vườn ươm. 30 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu UE35 và UE56 Dòng tuyển chọn Tạo cây hom Khử trùng mẫu (Bằng dung dịch HgCl2 hoặc Ca (ClO)2 hay các hoá chất có tính diệt khuẩn khác ở các nồng độ khác nhau) Tạo chồi ban đầu (Xác định môi trường tái sinh chồi thích hợp) Nhân chồi (Xác định môi trường nhân chồi thích hợp được bổ sung các chất kích thích sinh trưởng như BAP và Kinetin ở các nồng độ khác nhau) Tạo rễ (Tạo rễ in-vitro: Xác định môi trường và phương pháp ra rễ hiệu quả) Vƣờn ƣơm * Cấy khởi động Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và tái sinh tốt. Khử trùng mẫu bằng chất hoá học có hoạt tính diệt nấm khuẩn được tiến hành qua các bước: Rửa xà phòng loãng Rửa dưới vòi nước chảy Tráng nước cất Ngâm trong dung dịch khử trùng khoảng 5 - 15 phút Đổ bỏ dung dịch khử trùng, rửa lại bằng nước cất từ 3-5 lần Cấy mẫu vào môi trường tái sinh chồi ban đầu, các thao tác được thực hiện trong buồng cấy vô trùng 35 Từ các thí nghiệm trên, chúng tôi đã thu được môi trường MS* + 30mg/l đường + 5,5 mg/l agar + mg/l B2 + mg/l BAP + mg/l NAA là tốt nhất cho HSNC và TLCHH của 2 dòng. Tuy nhiên, để tìm ra môi trường thích hợp hơn cho nhân nhanh chồi. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp của Kinetin với tổ hợp BAP và NAA. Kinetin được bổ sung vào môi trường MS* + 30mg/l đường + 5,5 mg/l agar + mg/l B2 + mg/l BAP + mg/l NAA với hàm lượng thay đổi là: Bảng 2.6: Công thức thí nghiệm nhân chồi Công thức Nồng độ và chất điều hoà sinh trưởng Kinetin ĐC ĐC 0 CT 39 MS* + mg/l BAP + mg/l NAA + 0,5 mg/l CT 40 1,0 mg/l CT 41 1,5 mg/l CT 42 2,0 mg/l 2.4.4.6. Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây và chiều dài trung bình của rễ IBA được bổ sung vào môi trường 1/2 MS* + 15 mg/l đường + 5 g/l agar, pH = 6,5. IBA ở nồng độ thay đổi là: Bảng 2.7: Công thức thí nghiệm ra rễ Công thức Nồng độ và chất điều hoà sinh trưởng IBA ĐC ĐC 0 CT 44 1/2 MS* + 1,0 mg/l CT 45 2,0 mg/l CT 46 3,0 mg/l CT 47 4,0 mg/l 36 2.4.4.7. Ảnh hưởng của nồng độ IBA+ ABT1 đến tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây và chiều dài trung bình của rễ Để xác định ảnh hưởng của nồng độ IBA và ABT1 đến quá trình hình thành rễ của hai dòng UE35 và UE56, đề tài bổ sung ABT1 vào môi trường 1/2MS*+ 30g/l đường + 5,0g/l agar + mg/l IBA + nồng độ ABT thay đổi như sau: Bảng 2. 8: Công thức thí nghiệm ra rễ Công thức Nồng độ và chất điều hoà sinh trưởng ABT1 ĐC ĐC 0 CT 44 1/2 MS* + mg/l IBA + 1,0 mg/l CT 45 2,0 mg/l CT 46 3,0 mg/l CT 47 4,0 mg/l 2.4.4.8. Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều cao cây con ở vườn ươm Trước khi đưa cây con trong ống nghiệm ra trồng ở vườn ươm, đề tài chuyển các bình cây (cây hoàn chỉnh ở trong bình) ra môi trường bên ngoài, mục đích để cây con làm quen dần với điều kiện ngoài vườn ươm (gọi là giai đoạn huấn luyện). Đặt bình cây ra điều kiện ánh sáng và nhiệt độ tự nhiên với cường độ ánh sáng từ 5.000 - 10.000 lux, không cho ánh nắng chiếu trực tiếp vào bình nuôi cây. Nhằm xác định thời gian huấn luyện cây con để có thể rút ngắn hoặc kéo dài so với sản xuất. Chúng tôi thử nghiệm 5 khoảng thời gian huấn luyện cây con. Huấn luyện cây để ở ánh sáng và nhiệt độ trong điều kiện tự nhiên: - Không huấn luyện (0 ngày) - 4 ngày - 12 ngày - 16 ngày 37 Sau khi huấn luyện, cây con được trồng ra bầu khoảng 4 tuần thì tiến hành đo đếm tỷ lệ sống, chiều cao và sinh trưởng của cây để đánh giá ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và sinh trưởng chiều cao của cây trong giai đoạn vườn ươm. Quá trình lấy cây con ra khỏi bình, trồng cây vào bầu đất và chăm sóc cây ngoài vườn ươm được tiến hành theo các bước kỹ thuật được thực hiện tại Trung tâm giống cây rừng thuộc Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam và khu công nghệ tế bào Viện khoa học sự sống thuộc Trường đại học Nông Lâm Thái Nguyên. 1. Tạo bầu cấy cây: Dùng bầu nhựa PE có đường kình 5,5 cm, cao 11 cm, có đục lỗ dưới đáy. Thành ruột bầu là đất tầng B 100% đập nhỏ, sàng bỏ rễ cây và các tạp chất khác. 2. Xử lý bầu: Trước khi cấy 1-2 ngày, bầu đất được xử lý khử trùng mầm bệnh bằng dung dịch thuốc tím 0,1% (hoà thuốc tìm vào nước và dùng ô doa tưới lên bề mặt bầu cho thấm sâu 2-3cm). 3. Lấy cây ra khỏi bình và cấy vào bầu - Tạo hỗn hợp hồ rễ: Trộn đất tầng B với dung dịch thuốc tím 0,1% với tỷ lệ thể tích đất/dung dịch thuốc tím = 1/1 trước khi ra cây 12-24 giờ. - Lấy cây ra khỏi bình: cây mầm lấy từ trong lọ đổ ra lòng bàn tay, nhặt từng cây ra khỏi môi trường nuôi cấy và rửa sạch. Nhúng rễ cây vào hỗn hợp hồ rễ - Cấy cây đã hồ rễ vào bầu đất đã được xử lý và để bay hơi sau 1 ngày. 4. Chăm sóc cây sau khi cấy: Cây sau khi cấy được che bằng lưới đen (độ tàn che 50-60%) 10-15 ngày sau khi cấy. Sau 2 tuần tưới phân NPK tỷ lệ (5:10:3) nồng độ 0,3%, sau khi tưới rửa lại bằng nước sạch. Phun phòng nấm bệnh bằng dung dịch Bellate nồng độ 5g/10 lít nước, 1 tuần một lần. Thu thập tỷ lệ sống và đo chiều cao của cây sau khi cấy 4 tuần. 2.4.4.9. Điều kiện thí nghiệm Quá trình nuôi cấy (nhân chồi và tạo rễ) được tiến hành trong điều kiện nhân tạo. Ánh sáng, nhiệt độ và độ ẩm được duy trì như sau: 38 - Ánh sáng: Mẫu được nuôi cấy dưới ánh đèn neon với cường độ ánh sáng từ 1500 - 3000 lux, thời gian chiếu sáng 10h/ngày. - Nhiệt độ: nhiệt độ trong phòng duy trì từ 23-250C (±2) - Độ ẩm thường xuyên xấp xỉ 60% 2.4.5. Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên theo khối với 3 lần lặp (Andrew. I, 1991, số 71, 39 trang). Với thí nghiệm về ảnh hưởng nồng độ hoá chất và thời gian khử trùng, thí nghiệm chọn loại môi trường, mỗi công thức theo dõi 60 mẫu (ống nghiệm, đánh giá kết quả sau 4 tuần nuôi cấy qua HSNC). Các thí nghiệm nghiên cứu môi trường nhân chồi, mỗi công thức theo dõi 10 bình, mỗi bình 6 mẫu. Môi trường chứa trong bình tam giác, đánh giá kết quả HSNC và TLCHH sau 4 tuần nuôi cấy. Các thí nghiệm nghiên cứu môi trường tạo rễ, mỗi công thức theo dõi 10 bình, mỗi bình 30 chồi. Môi trường được chứa trong bình trụ đường kính 6cm hoặc 10cm, chiều cao 15 - 20 cm, với nắp nilong quấn nịt cao su kép. Thu thập tỷ lệ ra rễ, số rễ tạo thành và chiều dài của rễ sau 2 tuần nuôi cấy. Thí nghiệm về ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều cao của cây con ở vườn ươm, mỗi công thức theo dõi 30 bình và đo đếm 30 cây tại vườn ươm. 2.4.6 * Thu thập số liệu + Các chỉ tiêu đo đếm trong phòng thí nghiệm: 1. Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = Tổng số mẫu nhiễm x 100 Tổng số mẫu ban đầu 2. Tỷ lệ mẫu sống (%) = Tổng số mẫu sống x 100 Tổng số mẫu ban đầu 3. Tỷ lệ mẫu bật chồi (%) = Tổng số mẫu nảy chồi x 100 Tổng số mẫu thí nghiệm 43 Ảnh 3.1. Khử trùng mẫu và mẫu nuôi cấy sau 20 ngày 3.2. Ảnh hƣởng của mùa vụ đến khả năng tái sinh chồi ban đầu Bảng 3.2: Bảng ảnh hƣởng của mùa vụ đến khả năng tái sinh chồi Tháng Dòng UE35 Dòng UE56 Thời gian bật chồi Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu bật chồi (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu bật chồi (%) 1 - 3 53,84 3,24 45,22 2,15 32 ngày 4 - 6 52,56 12,53 41,35 13,10 28 ngày 7 - 9 42,91 15,76 46,22 16,05 27 ngày 10 - 12 65,24 4,25 50,05 5,63 36 ngày Kết quả thí nghiệm cho thấy, dòng UE35 tháng 4-6 kết quả khử trùng với chỉ số tỷ lệ mẫu nhiễm là 52,56%, tỷ lệ mẫu bật chồi là 12,53% trong 28 ngày và tháng 7-9 mẫu nhiễm là 42,9%, mẫu bật chồi là 15,76% ở thời gian này trong năm với thời gian là 27 ngày mẫu đạt tỷ lệ tốt nhất; dòng UE56 ở tháng 4-6 kết quả khử trùng với chỉ số tỷ lệ mẫu nhiễm là 41,35, tỷ lệ mẫu bật chồi là 13,10 trong 28 ngày và tháng 7-9 mẫu nhiễm là 46,22, mẫu bật chồi là 16,05 ở thời gian này trong năm với thời gian là 27 ngày mẫu đạt tỷ lệ tốt nhất. Cũng như một số giống cây rừng nói chung, thời gian khử trùng mẫu thích hợp nhất là từ tháng 4 đến tháng 10 hàng năm. Trong khoảng thời gian này, kết quả khử trùng đạt được là cao nhất (tỷ lệ nhiễm 44 thấp, tỷ lệ bật chồi cao và thời gian bật chồi cũng ngắn nhất) do đây là thời điểm sinh trưởng thích hợp của các đối tượng nghiên cứu. Tuy nhiên, để xác định chính xác thời gian thích hợp nhất cho các thí nghiệm khử trùng, đề tài tiếp tục các thí nghiệm lặp lại trong thời gian tới. Nhằm tối ưu hoá từng khâu trong quá trình nhân giống để xây dựng bản hướng dẫn kỹ thuật nhân giống cho các đối tượng nghiên cứu. 3.3. Nghiên cứu loại môi trƣờng thích hợp cho nhân nhanh chồi Để có sự thành công đối với nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô thì giai đoạn quan trọng đó là xác định môi trường nuôi cấy thích hợp cho đối tượng cần nhân giống. Với các công bố về môi trường nhân giống cây Bạch đàn còn hạn chế, thêm vào đó chưa có môi trường cụ thể nào và có độ tin cậy cao cho dòng Bạch đàn lai. Do vậy, đề tài thử nghiệm một số môi trường, sử dụng để nhân giống các loài cây thân gỗ. Từ đó chọn ra môi trường thích hợp cho nghiên cứu hai dòng Bạch đàn trên. Trong điều kiện nuôi cấy mô tế bào HSNC và TLCHH phụ thuộc vào thành phần môi trường, nồng độ chất dinh dưỡng có trong môi trường nuôi cấy. Các nghiên cứu giai đoạn này nhằm tìm ra được môi trường thích hợp cho giai đoạn nhân nhanh chồi, giai đoạn có vai trò quyết định đến hiệu quả của quá trình nhân giống. Kết quả được trình bày bảng dưới đây. Bảng 3.3: Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của 5 loại môi trƣờng đến HSNC và TLCHH của dòng UE35 và UE56 (tổng số 180 mẫu/môi trƣờng) Loại môi trường Dòng UE35 Dòng UE56 Số chồi thu được HSNC (lần) Số chồi thu được HSNC (lần) Litvay 200 1,11 192 1,07 WPM 184 1,02 170 0,94 MS * 213 1,18 211 1,17 MS 173 0,96 165 0,92 WV3 195 1.08 186 1,03 (MS *: là môi trường MS cải tiến có bổ sung thêm một số vitamin và khoáng chất) 48 ¶nh 3.4a. Chồi nuôi cấy trong môi trƣờng MS* có bổ sung 2.0 mg/l vitamin B2 Đồ thị 3.1b. ¶nh hƣởng của vitamin B2 đến TLCHH của UE35 và UE56 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 Nồng độ vitamin B2 (mg/l) TLCHH (%) Dòng UE35 Dòng UE56 Đồ thị 3.1a. ¶nh hƣởng của vitamin B2 đến HSNC của hai dòng UE35 và UE56 56 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 Nồng độ vitamin B2 (mg/l) HSNC (lần) Dòng 35 Dòng 56 (lần) 50 3.5. Ảnh hƣởng của chất điều hoà sinh trƣởng trong môi trƣờng MS* đến HSNC và TLCHH Các đề tài ghiên cứu nuôi cấy mô tế bào cho thấy chất điều hoà sinh trưởng là rất quan trọng, quyết định đến hiệu quả của giai đoạn trong nhân giống. Nó ảnh hưởng đến HSNC (đó là khả năng nhân nhanh chồi, TLCHH) và TLCHH (Đoàn Thị Ái Thuyên và cs, 2001). Với đề tài này, chất điều hoà sinh trưởng Cytokinin là BAP, Kinetin và nhóm Auxin đó là NAA, IBA, ABT1. 3.5 TLCHH BAP là chất kích thích tạo chồi tốt cho quá trình nhân nhanh, nó được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Với kết quả theo dõi ảnh hưởng của BAP đến HSNC và TLCHH của dòng UE35 và dòng UE56 và được trình bày tại bảng 3.4 và đồ thị 4a, 4b. Kết quả thấy rằng BAP có ảnh hưởng tích cực đến quá trình nhân chồi, sinh trưởng và chiều cao chồi nuôi cấy. Khi tăng nồng độ từ 0 - 2mg/l thì thấy khả năng nhân chồi là rất rõ. Còn ở công thức không có BAP (đối chứng) thì HSNC và TLCHH của dòng UE35 là 1,43 lần và 19%, dòng 56 là 1,37 lần và 17,5%. Ở môi trường nồng độ BAP là 2,0 mg/l có HSNC và TLCHH của UE35 là 2,16 lần và 24,2%, dòng UE56 là 2,02 lần và 22,3%. Nhưng khi tăng nồng độ từ 2,0 - 3,0 mg/l thì HSNC và TLCHH của cả 2 dòng đều giảm (dòng UE35 là 1,96 lần, TLCHH là 18,7%; dòng UE56 là 1,78 lần và 15,9%). Còn nồng độ 4,0 mg/l thì cả 2 dòng HSNC và TLCHH đều giảm mạnh (dòng UE35 là 1,91 lần và 12,5%; dòng UE56 là 1,63 lần và 12,9%). Ở môi trường có nồng độ BAP là 4,0mg/l xuất hiện những chồi nhỏ, mảnh, chồi hình thành không rõ rệt thân, lá, ngọn những chồi này không có tác dụng cho những lần nhân chồi tiếp theo cũng như cấy chuyển sang môi trường tạo rễ do vậy không được đo đếm. Nhiều chồi cấy hình thành khối callus to ở gốc. Như vậy thấy rằng nồng độ BAP cao đã ức chế sinh trưởng và phát triển của chồi. Theo G. J de Klerk, 1999 nồng độ BAP cao sẽ kìm hãm sự phát triển của quần thể chồi, chồi sinh trưởng và phát triển không bình thường, mất sắc tố diệp lục. 51 Bảng 3.5: Ảnh hƣởng của nồng độ BAP đến HSNC và TLCHH của Bạch đàn lai dòng UE35 và UE56 (180 mẫu/công thức) Nồng độ BAP (mg/l) Dòng UE35 Dòng UE56 Chất lượng chồi Số chồi thu được Chồi hữu hiệu HSNC (lần) TLCHH (%) Số chồi thu được Chồi hữu hiệu HSNC (lần) TLCHH (%) 0,0 258 49 1,43 19,0 246 43 1,37 17,5 + 1,0 327 72 1,82 22,0 332 64 1,84 19,3 + + 2,0 388 94 2,16 24,2 363 81 2,02 22,3 + + + 3,0 353 66 1,96 18,7 320 51 1,78 15,9 + + 4,0 344 43 1,91 12,5 294 38 1,63 12,9 + Ghi chú: + : Chồi sinh trưởng kém ++ : Chồi sinh trưởng ở mức độ trung bình +++: Chồi sinh trưởng tốt, mập Biểu đồ 3.2a. ¶nh hƣởng của BAP đến HSNC của 2 dòng UE35 và UE56 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 Nồng độ BAP (mg/l) Hệ số nhân chồi (lần) Dòng UE35 Dòng UE56 55 - HSNC và TLCHH ở các công thức nồng độ IAA có sự khác nhau với α = 0,05 vì bảng Anova cho thấy giá trị Sig của F < 0,05 ở cả 2 chỉ tiêu HSNC và TLCHH của 2 dòng. - Phân nhóm bằng tiêu chuẩn Duncan thấy: HSNC của dòng UE35 và UE56 ở nồng độ 0,5 mg/l là tốt nhất. TLCHH của dòng UE35, UE56 ở nồng độ 0 và 0,5; 1,0 mg/l là những nồng độ tốt nhất trong nhóm. 3.5 * TLCHH Do các nồng độ của IAA ảnh hưởng không nhiều đến HSNC và TLCHH của 2 dòng nghiên cứu, bên cạnh đó NAA cũng là chất điều hoà sinh trưởng nhân tạo thường có tác dụng m