Luận văn Nghiên cứu phân lập một số hợp chất hóa học từ thân rễ loài thực vật tri mẫu

esgalactotigonin (42) và timosaponin BII-a (43) đãđược Yuan và cộng sự[13] phân lập từ rễ của loài Tri mẫu v o năm 2014. O R1O CH3 H CH3 CH3 OCH3 CH3 R2O O R1O CH3 CH3 CH3 OH O OH CH3 CH3 (38) (39) CH3 OH R1O CH3O CH3 H O R1O H OR2 OH (40) (41) O R1O H OR2 OH O R1O H OR2 OH (42) (43) R1=S1, R2=S3 R1=S1 R1=S2 R1=S2, R2=S3 R1=S5, R2=S3 R1=S4, R2=S3 16 O H OH H O O H OH H H OH OH OH H H OH S1= O H OH H O O H OH H H OH OH OH H H OH OH S2= O H OH H H OH OH H OH S3= O H OH H OH H OH H OH S4= O H O H OH O O O H OH H OH H OH O OH H H OH OH OH O H OH H H OH OH OH S5= Timosaponin A-III (1) được Kawasaki và cộng sự [16] phân lập từ loài Tri mẫu v o năm 1963. Khi thủy phân saponin này với axit HCl 2N trong etanol 50% thu được sarsasapogenin, D-galactose và D-glucose. C u trúc hóa học của (1) là: 17 O O OH OH O OH OH O OH OH OH O CH3 CH3 CH3 O CH3 (1) Một saponin mới là Anemarsaponin B (2) cùng với h i s ponin đã iết là nem rs ponin 1 3 v nem rs ponin 2 4 được Dong và các cộng sự[8] tìm ra từ d ch chiết etanol của loài Tri mẫu v o năm 1991. O O OH OH O OH H OH O OH OH OH O CH3 CH3 CH3 O OOH OH OH CH3 OH (2) O O OH OH O OH OH O OH OH OH O O 18 (3) O O OH OH O OH OH O OH OH OH O O OH (4) Pseudoprototimos ponin III 5 được Nakashima và cộng sự[25]đã phân lập từ loài Tri mẫu v được so sánh với ch t đã iết prototimos ponin III 6 v o năm 1993. O H CH3 CH3 CH3 OGal Glc CH3 O Glc (5) O H CH3 CH3 CH3 OGal Glc CH3 O Glc OH (6) Hai saponin spirostanol mới có tên là anemarsaponin F (14) và G (15) được Ma B và các cộng sự[5] t m r năm 1997. Tr n cơ sở phân tích quang phổ, c u trúc 19 của (14) và 15 được xác đ nh tương ứng là neogitogenin3-O-β-glucopyranosyl- 1→2 [β-xylopyranosyl- 1→3 ]-β-glucopyranosyl 1→4 -β-galactopyranoside) (14) và lilagenin 3-O-β-glucopyranosyl- 1→2 - [β-xylopyranosyl- 1→3 ]-β- glucopyranosyl- 1→4 -β-galactopyranoside (15). O OH OH OH O OH OH O O OH O OH OH OH O OH O OH CH3 O CH3 CH3 OH O CH3 O OH (14) O OH OH OH O OH OH O O OH O OH OH OH O OH O OH CH3 O CH3 CH3 OH O CH3 O OH (15) Hai saponin steroid mới có tên anemarnoside A (34) và anemarnoside B (35), cùng với ba hợp ch t đã iết là timosaponin J (36), timosaponin B II (12), và timosaponin B (37) được Liu và các cộng sự[31] phân lập từ loài Tri Mẫu v o năm 2013. H O H O H H O O Glc Gal Glc 20 (34) O O H Gal CH3 O OH OH OHOH Glc glc (35) H O H O H H O OO Gal Glc glc (36) CH3 Oglc O CH3 H H H CH3 H CH3 OH gal glc (12) 21 H O H H H O O Gal Glc Glc (37) Timosaponin E1 (16) và timosaponin E2 (17) được Meng Z và các cộng sự[44] phân lậptừ loài Tri mẫu bằng phương pháp sắc ký silicagel và phương pháp sắc kí HPLC v o năm 1998. OGal Glc O O Glc OH OH H CH3 (16) OGal Glc O O Glc OCH3 OH H CH3 (17) 22 Năm 1998, nhóm nghiên cứu này tìm ra bốn hợp ch t saponin mới là timosaponin B-IV (18), timosaponin B-V(19), timosaponin B-VI(20), timosaponin D (21) ( t o s= 186-190 o C). Cả bốn ch t n y đ u ở dạng bột, màu trắng[23]. O O CH3 CH3 O Glc galglc glc glc CH3 H CH3 (18) H O RO CH3 CH3 O Glc Ogalglc glc glc CH3 CH3 4 3 2 (19) R=H (20) R=CH3 O OH Ogal glc H CH3 CH3 CH3 O Glc (21) 1.3.2. Các hợp chất aglycon 1.3.2.1. Nghiên cứu th nh phần aglycon Năm 1999 Liu v các cộng sự đã đư r một nghiên cứu v việc xác đ nh thành phần sarsasapogenin (44) từ loài Tri mẫu bằng phương pháp hệ thống sắc ký khí (GC)[36]. Ngo i r cũng c một số tài liệu đ cập đến việc phân lập aglycon này 23 từ loài Tri mẫu và thử nghiệm hoạt tính sinh học như hoạt tính bảo vệ tế bào, cải thiện trí nhớ, ức chế tế o ung thư v hạ đường huyết[14],[22],[43]. O CH3 CH3 CH3 O CH3 OH (44) Năm 2017 nh m nghi n cứu củ chúng tôi đã th nh công trong việc phân ập h i hợp ch t g ycon 44 v 44 các dẫn xu t củ s rs s pogenin[17] 1.3.2.2 Tổng hợp dẫn xuất của sarasasapogenin Năm 2012 Peng v cộng sự [30] đã tổng hợp 8 hợp ch t dạng este ở v trí cacbon số 3 bằng các phản ứng este h . Đồng thời nhóm nghiên cứu n y cũng thử khả năng chống lão hóa thông qua sự ức chế của nó với enzym β-gal. Nhận th y ch t (56), (57), (61), (63) có khả năng chống lão hóa tốt. O O OH CH3 CH3 CH3 CH3 O O R CH3 CH3 CH3 CH3 (56) R=HSO4 - (60) R=C6H5COO - (57) R=HCOO - (61) R=C15H31COO - (58) R=CH3COO - (62) R= Cl - (59) R=C2H5COO - (63) R=Br - 2 2 24 Gần đây một số nghiên cứu đã đ cập đến việc tối ưu h c u trúc của sarsasapogenin nhằm nâng cao hoạt tính của aglycon này. Trong báo cáo gần đây nh t v o năm 2016 heng và các cộng sự[20] đã phân lập được sarsasapogenin từ loài Tri mẫu và tiến hành bán tổng hợp được 9 dẫn xu t trong đ dẫn xu t (48), (49), (53), (54) và (55) có khả năng ức chế Aβ42 trên tế bào N2A-APPswe tốt hơn so với sarsasapogenin. Năm 2017 nh m nghi n cứu đã tiến h nh án tổng hợp được một số hợp ch t c hoạt tính ảo vệ tế o v tăng cường hả năng trí nhớ củ chuột thực nghiệm [27]. Như vậy từ thành phần aglycon trong loài Tri mẫu có thể bán tổng hợp ra nhi u dẫn xu t mới có hoạt tính sinh học tốt hơn v c giá tr thức tiễn. Đến nay chỉ có một số công trình phân lập aglycon s rs s pogenin để nghiên cứu hoạt tính sinh học và bán tổng hợp khung cacbon này. Còn các khung aglycon khác hiện n y chư c áo cáo n o v việc phân lập chúng dưới dạng tinh khiết v xác đ nh c u trúc hóa học, bán tổng hợp và thử hoạt tính sinh học. 25 1.3.3. Các hợp chất phenolic Trong loài Tri mẫu, ngoài thành phần chính là các saponin và sapogenin thì còn có các hợp ch t pheno ic cũng c há nhi u công trình nghiên cứu v hợp ch t này. 1.3.3.1 Phân lập từ rễ loài tri mẫu Các hợp ch tphenolic: 7,4'-dihydroxy homoisoflavonoid (70); (2S)-7,4'- dihydroxy-5-methoxyflavaone (71); 4,4'-dihydroxychalcon (72), 2'-O- methylphlorethin (73); 1,3-bis-di-phydroxyphenyl-4-penten-1-one (74) và 2,4'- dihydroxy-4-metoxy enzophenon 75 đãđượcYoun và các cộng sự[15] phân lập từ rễ Tri mẫu v o năm 2009.Trong đ hợp ch t (70)- 73 được phân lập lần đầu tiên từ loài thực vật này. OOH O OH OH O O OH (70) (71) OH O OH OH O OH OCH3 (72) (73) OH CH2 O OH OH OH O O (74) (75) 1.3.3.2 Phân lập từ lá loài Tri mẫu Hai hợp ch t m giferin 68 v neom giferin 69 đãđượcnhóm nghiên cứu của Qin[21] phân lập từ lá loài Tri mẫu v o năm 2008. M giferin v neom giferin ở dạng bột màu vàng. 26 O OH R2 OH R1O O OH (68): R1=H, R2=Glu (69):R1=Glu, R2=Glu Bốn hợp ch t phenolic: 2,6,4-trihydroxy-4-methoxybenzophenone (64), 7- hydroxy-3-(4-hydroxybenzyl)chroman (65), broussonin B (66) và nyasol (cis- hinokiresinol) (67) đã được Tsukamoto và các cộng sự[32] phân tách từ loài Tri mẫu ở Nhật Bản v o năm 2005. Các hợp ch t đã được khảo sát khả năng ảo vệ tế bào thần kinh và khả năng ức chế proteasom. OH OH O OCH3 OH O OH OH (64) (65) OHH3CO OH CH2 OH OH (66) (67) 27 1.4. Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học loài Tri Mẫu 1.4.1. Hoạt tính sinh học của các saponin Saponin là thành phần hóa học chủ yếu trong loài thực vật Tri mẫu, có nhi u lợi ích cho sức khỏe con người. Các nghiên cứu v hoạt tính sinh học của loài Tri mẫu đã chứng minh các tác dụng có lợi trên mức cho estero trong máu ung thư sức khỏe củ xương v ích thích hệ miễn d ch.... Trong đ đáng chú hơn cả là tác dụng ức chế tế o ung thư tác dụng bảo vệ tế bào, cải thiện trí nhớ trên chuột thực nghiệmvà tác dụng hạ đường huyết. 1.4.1.1. Tác dụng ức chế tế b o ung thƣ Khả năng ức chế sự tăng trưởng và kích thích sự chết của tế bào tự hủy từ loại thảo dược Tri mẫu ở các dòng tế bào ung thư dạ dày là một nghiên cứu quan trọng đượcYoshio Takeda và các cộng sự [40] đư ra vào năm 2001. Sau khi kết thúc quá trình nghiên cứu, Yoshio Takeda và các cộng sự kết luận rằng Tri mẫu có khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư dạ dày MKN45 và Kato-III và có thể gây ra quá trình tự chết của tế bào này. Hợp ch t Timosaponin A-III (1)một saponin phân lập từ thân rễ của Tri mẫu có ti m năng được phát triển như là một tác nhân chống ung thư với dòng tế bào HeLa đượcChi-Ming Che và các cộng sự[18] chỉ ra. Bên cạnh đ ch t n y cũng thể hiện khả năng ức chế nhi u tế o ung thư như: ung thư iểu bì (SUNE-1 ung thư g n HepG2 ung thư vú M F-7) vớicác giá tr IC50 dao động từ 8.5 - 10.1 (μmol/l). 1.4.1.2. Tác dụng bảo vệ tế bào và cải thiện trí nhớ OU Yang Shi và các cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của timosaponin đến khả năng cải thiện trí nhớ trên chuột được OUYang Shi và các cộng sự nghiên cứu vào năm 2005 thực nghiệm với tác nhân gây tổn thương β-amyloid peptide (Aβ). Aβ có thể gây suy giảm trí nhớ ở chuột một cách trầm trọng, nó làm hạ th p hoạt động superoxide dismutase (SOD) và khả năng chống oxy h cũng như tăng mức độ malonaldehyde (MDA) trong tế bào. So sánh giữa những con chuột nh thường với những con chuột được tác động bởi timosaponin thì th y những con chuột sau khi được xử lí bởi các hợp ch t timosaponin(12), Timosaponin E1(16), timosaponin J(36) thì hoạt động SOD và khả năng oxy h được nâng c o đồng thời mức độ MDA 28 giảm. Từ đ cho th y các timosaponin có thể nâng c o đáng ể năng ực trí nhớ ở chuột thí nghiệm. Khả năng ức chế Aβ42 trên tế bào N2A-APPswe của các hợp ch t saponin được chỉ ra trong các nghiên cứu gần đây của Cheng và các cộng sự[20] v o năm 2016. Các giá tr IC50 (μM được ghi nhận như s u: hợp ch t Timosaponin A-III (1): IC50 = 2.3±0.2, TA1: IC50 = 6.1±2.8, TA IV: IC50 = 4.2±1.2, timosaponin B1: IC50> 100, hợp ch t timosaponin (12) > 100. Kết quả trên cho th y khả năng ức chế Aβ42 trên tế bào N2A-APPswe củ các s ponin tương đối tốt, nh t là hợp ch t Timosaponin A-III (1). Hợp ch t (1) có khả năng ức chế enzym acetyl cholinesterase (một tác nhân gây bệnh zheimer để cải thiện trí nhớ được Dong và các cộng sự (2009) chỉ ra. ơ chế của quá trình bảo vệ tế bào não của ch t này có thể được giải thích bằng sự chống viêm củ n . N cũng thể hiện khả năng ức chế sự truy n dẫn tín hiệu NF-kB trong tế bào BV-2 và trong tế bào não SK-N-SH trên mô hình chuột thực nghiệm đây một trong những thành tố có ảnh hưởng lớn đến sự m t trí nhớ. Ngoài ra, d ch chiết tổng số của loài thực vật Tri mẫu được Jung và các cộng sự đư r ết quả nghiên cứu v khả năng ảo vệ tế o não v o năm 2007. Sự thiếu máu cục bộ xảy ra khi b tắc ở động mạch não phải. D ch chiết tổng số của loài thực vật Tri mẫu ức chế đáng ể sự xâm nhập bạch cầu của các mô não thiếu máu cục bộ đi u n y được xác đ nh dựa trên hoạt động của enzym MPO. MPO đã giảm đáng ể khi dùng d ch chiết từ loài Tri mẫu trong vùng thể vân và vỏ não. Những phát hiện n y đ ng một vai trò r t quan trọng trong việc đi u tr ch n thương não do thiếu máu cục bộ gây ra, và dự đoán o i Tri mẫu có thể là một loại thảo dược chính được sử dụng để bảo vệ tế bào não sau khi b tổn thương do thiếu máu cục bộ. 1.4.1.3. Tác dụng hạ đƣờng huyết Một chế phẩm cổ truy n được bào chế từ thân rễ Tri mẫu được thử nghiệm trên chuột nhắt KK-Ay (chuột mắc một típ đái tháo đường không phụ thuộc insulin). Chế phẩm này (1700 mg/kg), làm giảm đường máu ở chuột nhắt KK-Ay từ 557 ± 17 xuống 383 ± 36 (mg/1000 ml) trong vòng 7h sau khi cho uống một li u thuốc (P < 0,001). Thuốc cũng m giảm đường máu v m tăng sự dung nạp glucose trong vòng 5 tuần sau khi cho uống những li u l p lại trên chuột nhắt KK - Ay. 29 D ch chiết etanol của Tri mẫu có tác dụng kích thích sự tiết insulin củ đảo tụy ở chuột nh thường và chuột đái tháo đường ở nồng độ 2,4 và 8 (mg/ml) đã được Hoa và các cộng sự chứng minh v o năm 2004. 1.4.1.4. Một số hoạt tính sinh học khác Các hợp ch t s ponin được phân lập từ các d ch chiết etanol và d ch chiết nước từ phần rễ Tri mẫu có khả năng chống enteroviruts 71(EV71) gây bệnh tay chân miệng đi u n y được đư r trong nghi n cứu của Liu và cộng sự v o năm 2014. Trong số các saponin, hợp ch t timosaponin B-II (12) có chỉ số IC50 (4,3 ± 2,1 mM, SI = 92,9), ch t đối chứng là ribavirin(IC50 = 361,7 ± 104,6 mM, SI = 2,4). So sánh 2 hợp ch t này thì th y hợp ch t timosaponin B-II 12 c SI c o hơn g p 40 lần so với ch t đối chứng [24]. Timos ponin E1 16 v timos ponin E2 17 được phân lập từ loài Tri Mẫu có tác dụng chống oxi hóa, gây ảnh hưởng đến gốc superoxide trong bạch cầu của con người được công bố trong báo cáo của Hiroyuki và các cộng sự v o năm 2000. Hợp ch t timosaponin E1 (16) và timosaponin E2 (17) ức chế đáng ể N-formyl- methionyl-leucyl-phenylalanine (FMLP) - tác nhân gây ra gốc superoxide. Ngoài ra, protein tyrosine kinase tham gia vào gốc superoxide cũng giảm đáng ể trong bạch cầu củ con người khi dùng hợp ch t timosaponin E1 (16) và timosaponin E2 (17). Anemarsaponin B (ASB) (2) thể hiện khả năng chống viêm ti m tàng. Kết quả nghiên cứu cho th y tác dụng chống viêm của ASB trong LPS ở đại thực bào RAW 264,7 có sự liên kết với sự ức chế hoạt động của enzym NF- kB thông qu con đường kích hoạt p38 MAP.[12] Ngoài ra, các saponin của loài Tri mẫu đi u tr hiệu quả sự oãng xương ở chuột thông qua sự hình thành xương nhưng hông ức chế sự tái h p thu xương[8] và còn có tác dụng chống oxi hóa.[28] 1.4.2. Hoạt tính sinh học của các aglycon Aglyconsarsasapogenin (44) hung cơ ản nh t của loài Tri mẫu. Đến nay chỉ có một số công trình phân lập aglyconsarsasapogenin để nghiên cứu hoạt tính sinh học. Khả năng ảo vệ tế o não để nâng cao khả năng trí nhớ và ức chế tế o ung thư hoạt tính sinh học điển hình nh t của khung aglycon này. 30 1.4.2.1. Tác dụng bảo vệ tế bào Khả năng nâng c o trí nhớ của khung aglycon sarsasapogenin được Hu và các cộng sự[37] thử trên chuột thực nghiệm với tác nhân gây tổn thương my oid β- peptide, kết quả cho th y nhóm thực nghiệm với ch t này có thể cải thiện khả năng nhớ và học tập với nh m đối chứng t crin v o năm 2005. Sự ảnh hưởng củ g ycon n y đến vai trò của phần kết nối vòng AMP REB đối với độ dầy đ c của thụ thể M1 trên tế bào CHOm1 trong quá trình trình gi đi n c hả năng nâng c o độ dầy đ c của thụ thể M1 tốt cho các CREB và phosphor- REB để chống lại quá trình lão hóa[10] được Hu và các cộng sự chứng minh v o năm 2010. Năm 2011 W ng v các cộng sự [14] đã chứng minh Sự ảnh hưởng của s rs s pogenin đến sự phát triển theo hình cây của tế bào thần kinh vỏ não, kết quả cho th y ch t này có khả năng m tăng sự phát triển của các tế bào thần kinh hình cây trên vỏ não với các nồng độ hác nh u thông qu con đường kích thích PI3K/Akt/mTOR được Wang và các cộng sự[14] chứng minh v o năm 2011. Đi u này r t tốt cho việc bảo vệ tế bào và kích thích sự ghi nhớ. Yue [43] cùng cộng sự đã nghi n cứu thực nghiệm và chứng minh rằng Sarsasapogenin có thể bảo vệ tế bào thần kinh vỏ não bởi sự tác động gây tổn thương của axit glutamic, kết quả cũng cho th y ch t này có khả năng ảo vệ tế bào này thông qu con đường kích hoạt sự truy n dẫn thông tin của PI3K/Akt/mTOR v m tăng hoạt tính của protein caspase-3 và μ-c p in đượcYue [43] và cộng sự nghiên cứu thực nghiệm và chứng minh v o năm 2012. Khả năng ức chế Aβ42 trên tế bào N2A-APPswe của các hợp ch t aglycon được Cheng và các cộng sự[20] cũng chỉ r v o năm 2016. ác giá tr IC50 (μM được ghi nhận như s u: hợp ch t sarsasapogenin (44): IC50 = 53.0±9.0; các hợp ch t được bán tổng hợp từ (44) là (48), (49), (53), (54), (55) có giá tr IC50 lần ượt là: 6.5±2.1, 27.0±8.0, 7.2±2.2, 9.3±3.5, 7.3±4.0. Còn các hợp ch t g ycon hác như: tigogenin, smi genin c giá tr IC50 > 100. Kết quả trên cho th y khả năng ức chế Aβ42 trên tế bào N2A-APPswe củ các g ycon tương đối tốt, nh t là các dẫn xu t được bán tổng hợp từ ch t sarsasapogenin. 31 1.4.2.2. Tác dụng ức chế tế b o ung thƣ Khả năng ức chế tế o ung thư xương người 1547 của aglycon sarsasapogenin thông qua việc gây ra sự chết của tế bào này dựa vào chu trình khép kín của tế bào trong ph G2/M được Trouillas và cộng sự chứng minh v o năm 2005[29]. Vai trò cần cho sự sống trong việc gây chết tế o ung thư HepG2 v HeL đượcNi và cộng sự [42] chứng minh v o năm 2008. Kết quả cho th y rằng, sarsasapogenin thúc đẩy phản ứng oxy hóa (ROS) ti thể xảy ra sớm giúp kích hoạt quá trình tự chết của tế o v cytochrome được giải phóng nhi u hơn từ đ ước đầu kết luận sarsasapogenin có khả năng gây r quá tr nh tự chết tế bào HepG2. Bao và cộng sự[35] cũng đã chỉ ra sự phụ thuộc của nồng độ và thời gian vào khả năng sống được của tế bào HepG2. Sarsasapogenin có thể ức chế khối u trong các thực nghiệm in vitro v cũng c thể ức chế tế o ung thư HeL gây r ởi các quá tr nh oxi h stress được Shen và cộng sự [34] chứng minh v o năm 2013. 1.4.2.3. Một số hoạt tính sinh học khác Những ảnh hưởng củ s rs s pogenin được phân lập từ loài Tri mẫu đến hoạt động chống trầm cảm ở chuột trong bài kiểm tr c t n mô h nh ơi cưỡng bức the forced swimming được tìm ra từ mục đích nghi n cứu của Wu và các cộng sự[38] đư r v o năm 2006 . Bộ dụng cụ là một bình hình trụ được làm bằng po yc r on te c o 25cm đường ính 10 cm nước (24o được cho v o nh đến mức 15cm. Chuột thí nghiệm được cho uống s rs s pogenin 60 phút trước khi làm thí nghiệm. Chuột được đ t vào bình và thử nghiệm trong 6 phút. Cho chuột ơi tự do trong 2 phút đầu và từ phút thứ 3, thời gian b t động của chuột được ghi nhận. Kết quả cho th y khi dùng sarsasapogenin với li u 12.5, 25 và 50 mg/ kg thì giảm thời gian b t động tương ứng với kết quả là 26,6% (P< 0,05), 32,7% (p< 0,05) và 48,7% (p<0,01). Nghiên cứu này chỉ ra khả năng chống trầm cảm ti m năng của sarsasapogenin từ loài Tri Mẫu dựa vào các dẫn chứng v tâm í dược lý, hóa học và các tài liệu v thần kinh. Ngoài ra, sarsasapogenin còn có tác dụng hạ sốt. Phân đoạn saponin từ thân rễ tri mẫu và sản phẩm thủy phân s rs s pogenin cũng như dẫn ch t hemisuciny đ u có 32 tác dụng ức chế mạnh trên Na+/K+-ATPase và làm giảm ượng oxy thu nhận trong gan được xử lý với thyroxin. Tác dụng ức chế của dẫn ch t hemisucinyl còn mạnh hơn cả tác dụng củ ou in. S rs s pogenin cũng ức chế Na+/K+-ATPase của hồng cầu người. Tác dụng ức chế chậm và có thể tăng n do ion n tri từ n ngo i v đối kháng bởi ion rubidi từ bên ngoài. Tác dụng ức chế trên ATPase có thể có liên quan với tác dụng hạ sốt của sarsasapogenin. Kết luận: Như vậy, các ch t được phân lập từ loài tri mẫu có r t nhi u hoạt tính quan trọng và thiết thực trong đ timos ponin -III và aglycon sarsasapogenin được nghiên cứu nhi u hơn cả đ c biệt là tác dụng bảo vệ tế bào não, chống tế bào ung thư v hạ đường huyết. 33 Chƣơng 2 THỰC NGHIỆM 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là mẫu khô loài Tri mẫu được thu mua tại Hà Giang,Việt Nam (6/2016). Mẫu được s y hô v bảo quản cẩn thận trước khi tiến hành nghiên cứu. 2.2. Hóa chất và thiết bị 2.2.1. Hóa chất 2.2.1.1. Hóa chất ác dung môi dùng để ngâm chiết mẫu thực vật đ u dùng loại tinh khiết. Dung môi được sử dụng là: n-hexan, etylaxetat (EA), axeton, clorofom, cacbontetraclorua, ete dầu là các dung môi tinh khiết. Sắc ký cột thường: sử dụng silicagel cỡ hạt 230-400/mesh Merc v sắc ớp mỏng TL 254F Merc . 2.2.1.2. Hóa chất v tế b o dùng để thử hoạt tính sinh học - FBS của GIBCO, Invitrogen, TCA (Sigma), SRB (Sigma) - Đĩ 96 giếngnhự orning US pippette eppendorf máyđọc ELISA 96 giếng (Bio-rad) - Ch t tham khảo: Ellipticine - Các hóa ch t thông thường khác - Các dòng tế o ung thư do GS. TS. J. M. Pezzuto Trường Đại học Hawaii v GS. Je nette M ier trường Đại học Milan, Italia cung c p. 2.2.2. Thiết bị Máy c t quay chân không, các thiết b phụ trợ cho thí nghiệm phân lập ch t hữu cơ. Máy Bruker 500MHz để đo Phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Máy đo sắc ỏng hối phổ L -MS Kho H Đại học Kho học Tự nhi n . Sắc ký lớp mỏng (TLC) phân tích được tiến hành trên bản mỏng kính và bản mỏng nhôm silicagel tráng sẵn (dày 0,2 mm). Hiện màu với thuốc thử là dung d ch C2H5OH/H2SO4 v đèn UV 254 nm. ân phân tích máy đo OD ELIS P te Re der Bio-Rad). Máy đo nhiệt độ n ng chảy RY-1 Kho H Đại học Sư phạm – ĐHTN 34 2.3. Phƣơng pháp xử lý mẫu thực vật, chiết tách v xác định cấu trúc các chất phân lập đƣợc 2.3.1. Xử lý mẫu thực vật Từ mẫu khô của loài Tri mẫu được s y ở 50o ảo quản trong túi ni on để dùng cho nghiên cứu. 2.3.2. Chiết tách các chất Mẫu phần thân rễ của loài Tri mẫu được ch t nhỏ và chiết hồi ưu với etanol ở 90 o C. Quay c t thu hồi dung môi dưới áp su t giảm thu được c n chiết etanol. C n đ chiết lần ượt với các dung môi c độ phân cực tăng dần etylaxetat (EA), n-butanol. S u đ c t thu hồi dung môi dưới áp su t giảm thu được các c n tổng số. Phân lập c n tổng số và các c n ở các phân đoạn bằng phương pháp sắc ký cột trên silicagel với các hệ dung môi thích hợp. 2.3.3. Xác định cấu trúc các chất C u trúc của các hợp ch t được khảo sát nhờ sự kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H, cacbon 13C, phổ hai chi u HSQ v HMBC, phổ khối ượng ESI-MS và một số phương pháp hác. 2.4. Phƣơng pháp xác định khả năng ức chế tế b o ung thƣ 2.4.1. Mẫu thử - Tên mẫu: 3 mẫu AA1, AA2, AA3 - Mẫu thử: AA1 ở dạng bột chư ph AA2 dạng d ch đã ph với nồng độ 10mg/0,2ml, AA3 dạng d ch đã ph nồng độ 10mg/0,5ml. - Các dòng tế bào thử nghiệm: + 549: Ung thư phổi ở người (human lung carcinoma) + Hela: Ung thư tử cung ở người (human cervix adenocarcinoma) - Thời hạn thử nghiệm: tháng 4/2017 2.4.2 Vật liệu v phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.2.1. Vật liệu - FBS của GIBCO, Invitrogen, TCA (Sigma), SRB (Sigma) - Đĩ 96 giếngnhự orning US pippette eppendorf máyđọc ELIS 96 giếng Bio-rad) 35 h t th m hảo: Ellipticine ác h ch t thông thường hác ác dòng tế o ung thư do GS. TS. J. M. Pezzuto Trường Đại học H w ii v GS. Je nette M ier trường Đại học Mi n It i cung c p. 2.4.2.2. Phƣơng pháp xác định tính độc tế b o ung thƣ (cytotoxic assay) Phương pháp thử độ độc tế o ung thư in vitro được Viện Ung thư Quốc gi Ho Kỳ N tion ncer Institute – N I xác nhận phép thử độ độc tế o chuẩn nhằm s ng ọc phát hiện các ch t c hả năng m hãm sự phát triển ho c diệt TBUT ở đi u iện in vitro. Phép thử n y được thực hiện theo phương pháp củ Mon s 1991 . Phép thử tiến h nh xác đ nh h m ượng protein tế o tổng số dự v o mật độ qu ng học OD – Optic Density đo được hi th nh phần protein củ tế o được nhuộm ằng Su forhod mine B SRB . Giá tr OD máy đo được tỉ ệ thuận với ượng SRB gắn với phân tử protein do đ ượng tế o c ng nhi u ượng protein c ng nhi u th giá tr OD c ng ớn. Phép thử được thực hiện trong đi u iện cụ thể như s u: - h t thử được ph th nh các dải nồng độ thích hợp - Trypsin h tế o thí nghiệm để m rời tế o v đếm trong uồng đếm để đi u chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm. - h t thử đã ph ở các nồng độ v o các giếng củ đĩ 96 giếng đư tế o ở nồng độ phù hợp v o các giếng n y s o cho nồng độ ch t thử trong giếng 100 g/ml; 20 g/ml; 4 g/ml và 0,8 g/ml. Ủ trong tủ m 48 giờ. Giếng hông c ch t thử nhưng c TBUT 180 sẽ được sử dụng m đối chứng ng y 0. S u 1 giờ tế o sẽ được cố đ nh ằng Trich or cetic cid – T ở các giếng đối chứng ng y 0. - S u 48 giờ tế o được cố đ nh ằng T trong 1 giờ được nhuộm ằng SRB trong 30 phút ở 37 o rử 3 ần ằng cetic cid rồi để hô ở nhiệt độ phòng. - 10 mM unbuffered Tris se để hò t n ượng SRB ắcnhẹtrong 10 phút. - Đọc ết quả OD ở ước s ng 515-540 nm trên máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad). - Phần trăm ức chế sự phát triển củ tế o hi c m t ch t thử sẽ được xác đ nh thông qu công thức s u: 36 [OD ch tthử - OD(ngày 0)] x 100 % ức chế = 100% - OD đốichứngâm - OD(ngày 0) - Phép thử được p ại 3 ần để đảm ảo tính chính xác. E ipticine ở cácnồngđộ 10 g/ml; 2 g/ml; 0,4 g/ml; 0,08 g/m được sử dụng như ch t đối chứng dương; - DMSO10% uôn được sử dụng như đối chứng âm. Giá tr I 50 nồng độ ức chế 50% sự phát triển sẽ được xác đ nh nhờ v o phần m m máy tính T e urve 2Dv4. - Theo tiêu chuẩn của Viện ung thư quốc gia Hoa Kỳ (NCI), c n chiết được coi có hoạt tính tốt với IC50  20 μg/ml, trong khi ch t tinh khiết được coi có hoạt tính tốt khi IC50  5 μM [3], [4], [6],[ 9],[26]. 2.5. Thực nghiệm 2.5.1. Quá trình phân lập các chất từ phần rễ của loài Tri mẫu 2.5.1.1. Chiết xuất cao etanol từ thân rễ của loài Tri mẫu 10 kg mẫu khô từ thân rễ của loài tri mẫu sau khi l y v được đem ch t nhỏ sáy hô và chiết hồi ưu với etanol 90% ở nhiệt độ 70˚ trong thời gian 3 giờ và l p lại 3 lần. C t thu hồi dung môi được c n chiết etanol và phân bố đ u trong ượng nước vừ đủ. D ch chiết cồn được chiết với etylaxetat v n-butanol. 2.5.1.2. Phân l