Luận văn Nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử

2.2.3. Tạo dòng gen *) Tạo sản phẩm nối ghép Bảng 2.6. Thành phần hỗn hợp phản ứng nối ghép STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Dung dịch đệm (T4 Buffer 10X) 1 2 pBT Vector 1 3 Sản phẩm PCR 5 4 T4 DNA Ligase (5 unit) 1 5 Nước deion 2 Tổng 10 Ủ ở 22oC trong 1 giờ. *) Biến nạp và nuôi cấy tế bào có vector tái tổ hợp Sản phẩm nối ghép được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α (đã đươc xử lý bằng CaCl2 theo phương pháp chuẩn) bằng sốc nhiệt 42oC trong 90 giây. Sản phẩm biến nạp được bổ sung 200 µl LB lỏng, lắc 200 vòng/phút trong 1 giờ ở 37oC và trải trên đĩa thạch có bổ sung ampicillin 100 mg/l, IPTG 100 mg/l và X-gal 200 mg/l. Đĩa thạch được ủ qua đêm ở 37oC. Chọn một khuẩn lạc trắng trên mỗi đĩa tiếp tục được chọn nuôi qua đêm trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh ampicillin 100 mg/l. *) Tách chiết Plasmid và kiểm tra Khuẩn nuôi qua đêm sẽ được thu lại bằng ly tâm và tách plasmid theo protocol của bộ kit AccuPrep Plasmid mini Extraction (Bioneer – Hàn Quốc). Plasmid tái tổ hợp được kiểm tra có đoạn gen nghiên cứu qua phản ứng cắt bằng enzyme hạn chế BamHI. Kết quả sau khi thực hiện phản ứng cắt sẽ thu được hai phần: tạo 1 band trên ảnh điện di có kích thước 684 bp (đối với gen katG) hoặc kích thước 528 bp (đối với gen rpoB) và một band là phần còn lại của plasmid khoảng 2,7 kb. Bảng 2.7. Thành phần hỗn hợp phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzyme Thành phần Thể tích (µl) Plasmid 5 Ủ ở 37oC trong 1 giờ. Buffer BamHI 10X 1 BamHI enzyme (5 unit) 0,5 H2O deion 3,5 Tổng 10 Sau phản ứng cắt, sản phẩm được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Những mẫu nào có vạch tương ứng với kích thước của đoạn gen cần nghiên cứu thì có thể sử dụng để xác định trình tự. *) Phân tích kết quả Kết quả xác định trình tự trên máy ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer. Khai thác dữ liệu từ genbank, thiết lập chủng wild type để so sánh: Chủng H37Rv trên genbank (ID: 83332, ACCESSION NC_000962) với gen katG và rpoB đã được công bố ký hiệu lần lượt là Rv1908c và Rv0667. Xử lý, phân tích các trình tự đoạn gen katG 684bp và rpoB 528bp của các chủng vi khuẩn lao nhạy và kháng bằng chương trình phân tích chuỗi BioEdit. So sánh đối chiếu với các dữ liệu ngân hàng gen để có kết quả các vị trí đột biến của từng chủng nghiên cứu. 2.2.4. Multiplex real-time PCR Sau khi tách dòng và giải trình tự đoạn gen katG và rpoB của các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu được phân lập tại các vùng miền khác nhau tại Việt Nam, qua phân tích các đột biến, các probe sẽ được thiết kế nhằm phát hiện các đột biến có liên quan kháng INH và RIF ở vi khuẩn lao bằng phản ứng multiplex real-time PCR. Do trong phản ứng multiplex real-time PCR sử dụng 2 probe khác nhau trong cùng một phản ứng nên việc lựa chọn 2 probe này phải gắn 2 reporter (chất phát huỳnh quang) khác nhau để có thể phân biệt ở các bước sóng khác nhau. Probe dùng cho phản ứng real-time PCR sử dụng cho nghiên cứu này được thiết kế theo công nghệ TaqMan MGB (Minor Groove Binding) probe (TaqManR Chemistry) của hãng Applied Biosystems dạng TaqMan này có ưu điểm đó là có thể thực hiện phản ứng real-time PCR ở nhiệt độ cao, từ đó làm tăng độ đặc hiệu của các probe. Hơn nữa các loại probe thuộc dạng này được dễ dàng phân biệt dựa trên nhiệt độ nóng chảy. Chính vì vậy các loại probe này thường được dùng để thực hiện các phản ứng multiplex real-time PCR với độ đặc hiệu và độ nhạy cao. TaqMan hay phương pháp nuclease đầu 5’ là một trong những thí dụ về các loại probe thủy phân, tín hiệu huỳnh quang phát ra do sự thủy phân các đoạn probe được dùng để phát hiện các đoạn sản phẩm PCR. Các đoạn probe được gắn với một reporter ở đầu 5’ và một quencher (chất dập tắt tín hiệu huỳnh quang) ở đầu 3’. Trong nghiên cứu chúng tôi sử dụng 2 probe có gắn 2 reporter khác nhau, reporter gắn FAM cho phép phát tín hiệu huỳnh quang khi đo ở bước sóng 530 nm và reporter còn lại được gắn VIC phát huỳnh quang ở bước sóng 560 nm. Các quencher được gắn ở đầu 3’ của mỗi probe là các BHQ phát nhiệt, các BHQ phát nhiệt hiện nay được ưa chuộng sử dụng vì khả năng hấp thụ huỳnh quang rất mạnh, các BHQ được xem như các lỗ đen (black hole quencher – BHQ) hút lấy tất cả các huỳnh quang từ reporter không cho bất cứ huỳnh quang nào phát ra được từ reporter, đồng thời rất dễ dàng để thiết kế các Taqman probe dùng cho multiplex real-time PCR mà không lo đến phổ huỳnh quang của các reporter có bị trùng với phổ huỳnh quang của quencher vì quencher không hề phát huỳnh quang. Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ TÁCH DÒNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ 3.1.1. Kết quả nhân gen katG và rpoB từ DNA tách từ vi khuẩn lao Hai gen katG và rpoB được khuếch đại từ tổng số 93 chủng vi khuẩn lao, trong đó gồm có một chủng chuẩn quốc tế H37Rv, miền Bắc có 9 chủng đơn kháng và 13 chủng đa kháng; miền Nam có 10 chủng nhạy, 11 chủng kháng đơn, 14 chủng kháng đa và 12 chủng siêu kháng; miền Trung có 11 chủng kháng đơn và 12 chủng đa kháng. Đặc tính kháng thuốc của từng chủng thuộc các miền khác nhau được trình bày trên bảng 3.1 và phần phụ lục 2. Bảng 3.1: Đặc tính kháng thuốc của chủng vi khuẩn lao nghiên cứu Loại kháng thuốc Số lượng chủng Tổng số Miền Bắc Miền Trung Miền Nam Nhạy thuốc 0 10 0 10 H 3 5 5 13 S 6 5 6 17 R 0 1 0 1 H + S 0  0 6 6 H + S + R 12 2 3 17 H + S + R + E 1 12 3 16 H + S + R + E + Ofx + Th + Eto + Cs + Km + PAS 0 12 0 12 Chủng chuẩn H37Rv 1 Tổng số 22 47 23 93 Chú thích: S: Streptomycin, H: Isoniazid, E: Ethambutol, R: Rifampicin, Ofx: Ofloxacin, Th: Thioacetazone, Eto: Ethionamide, Cs: Cycloserine, Km: Kanamycin, PAS: P-aminosalicylic acid. Kết quả nhân hai gen katG và rpoB bằng kỹ thuật PCR được trình bày trong hình 3.1A và 3.1B. Kết quả ở hình 3.1A là kết quả đại diện sản phẩm PCR nhân gen katG, còn hình 3.1B là kết quả đại diện của sản phẩm PCR nhân gen rpoB. Hình 3.1A. Điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen katG Hình 3.1B. Điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen rpoB 500 250 bp M: Marker 1 kb 1-6: Thứ tự tên các mẫu nghiên cứu tương ứng 7: Đối chứng âm Kết quả điện di kiểm tra sau khi PCR nhân gen katG và rpoB cho thấy cả 93 chủng vi khuẩn lao đều cho kết quả dương tính với đoạn gen rpoB 528 bp và katG 684 bp. Các băng sản phẩm đều đặc hiệu, rõ nét không có vạch phụ kèm theo và có kích thước đúng theo tính toán lý thuyết. Tuy nhiên, để khẳng định chính xác đoạn gen nghiên cứu và phân tích các đột biến có liên quan kháng thuốc trên các đoạn gen này, chúng tôi đã tiến hành tách dòng và giải trình tự gen. 3.1.2. Kết quả tách dòng gen Bước đầu tiên của quá trình tách dòng là thực hiện phản ứng ghép nối gen đích vào vector tách dòng pBT, Phản ứng nối được xúc tác bởi T4 DNA ligase. Sau khi đoạn gen đích đã được gắn vào vector pBT, để làm gia tăng số lượng bản sao của vector tái tổ hợp này một cách nhanh chóng, chúng tôi tiến hành biến nạp plasmid tái tổ hợp vào trong tế bào khả biến E.coli DH5a và nuôi cấy trên môi trường LB lỏng, lắc 200 vòng/phút ở 370C trong 1 giờ để làm phục hồi tế bào E.coli mang plasmid tái tổ hợp đó. Sản phẩm biến nạp sau đó được cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc ampicillin 50 µg/ml, X-gal 20 mg/ml và IPTG 100 mM và được nuôi tĩnh ở 370C trong 18h. Kết quả biến nạp được trình bày ở hình 3.2. Hình 3.2. Chọn dòng khuẩn mang plasmid tái tổ hợp trên môi trường LB có bổ sung ampicillin 50 µg/ml, X-gal 20 mg/ml và IPTG 100 mM. Sau 18 giờ nuôi cấy, trên môi trường LB thạch có chứa kháng sinh ampicillin, X-gal và IPTG, xuất hiện hai loại khuẩn lạc: khuẩn lạc màu xanh và khuẩn lạc màu trắng. Tất cả các khuẩn lạc này là những khuẩn lạc đã được biến nạp plasmid chứa gen kháng kháng sinh ampicillin, tuy nhiên chỉ có những khuẩn lạc màu trắng là mang plasmid tái tổ hợp. Do đó, chúng tôi lựa chọn các khuẩn lạc trắng này đem nuôi cấy qua đêm ở 370C, lắc 200 vòng/phút trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh phù hợp. Sản phẩm nuôi cấy được ly tâm để thu khuẩn phục vụ cho quá trình tách plasmid. *) Tách plasmid Quy trình tách chiết DNA plasmid được thực hiện theo đúng hướng dẫn của bộ kit AccuPrep Plasmid mini Extraction (Bioneer – Hàn Quốc). Để kiểm tra sản phẩm tách plasmid, chúng tôi điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả được trình bày trong hình 3.3A và 3.3B. 1 2 3 4 5 6 7 M 1 2 3 4 5 6 3 2,5 3 2,5 kb kb Hình 3.3A. Điện di sản phẩm tách plasmid tái tổ hợp đoạn gen katG Hình 3.3B. Điện di sản phẩm tách plasmid tái tổ hợp đoạn gen rpoB M: Marker 1 kb 1-6: Thứ tự tên các mẫu nghiên cứu tương ứng 7: Đối chứng âm Quá trình tách chiết plasmid được tiến hành song song với đối chứng âm là khuẩn lạc màu xanh mọc trên đĩa thạch. Kết quả điện di kiểm tra cho thấy, các plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen đích có kích thước lớn hơn plasmid từ mẫu đối chứng. Điều này chứng tỏ đoạn gen đích đã được gắn vào vector tách dòng pBT. Tuy nhiên để kiểm tra chính xác đoạn gen được gắn vào có phải là gen đang nghiên cứu hay không, chúng tôi tiến hành kiểm tra bằng phương pháp enzyme giới hạn. *) Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn Quy trình cắt plasmid bằng enzyme BamHI được trình bày như đã miêu tả ở phần phương pháp (Bảng 2.7). Sau đó sản phẩm được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%. Kết quả được chỉ ra trong hình 3.4A và 3.4B. M 1 2 3 4 5 6 bp 2500 750 500 bp 2500 750 500 528 684 Hình 3.4A. Điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp gen katG bằng enzyme BamHI. Hình 3.4B. Điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp gen rpoB bằng enzyme BamHI. M: Marker 1 kb 1-6: Thứ tự tên các mẫu nghiên cứu tương ứng 7: Đối chứng âm Từ hình ảnh minh họa 3.4A và 3.4B, chúng ta có thể thấy sản phẩm cắt đều cho những đoạn gen có kích thước đúng với kích thước của đoạn gen cần nghiên cứu. Từ kết quả này chúng tôi kết luận rằng plasmid đã mang đoạn gen chèn. Do đó sản phẩm tách plasmid tiếp tục được gửi đọc trình tự. 3.1.3. Kết quả phân tích trình tự gen katG Qua phân tích trình tự gen katG của 93 chủng lao, trong đó có 82 chủng lao kháng thuốc, 10 chủng nhạy kháng sinh và 1 chủng chuẩn quốc tế H37Rv. Trong 82 chủng lao kháng thuốc này có 64 chủng kháng Isoniazid (69,6%); 46 chủng kháng rifampicin (50%), 68 chủng kháng streptomycin (74%) chúng tôi thu được kết quả như sau (Bảng 3.2). Bảng 3.2: Tỷ lệ đột biến làm thay đổi amino acid tại codon 315 của gen katG trong các chủng kháng thuốc phân lập tại các miền khác nhau tại Việt Nam. Miền Kháng đơn Kháng đa Siêu kháng Đột biến Không đột biến Đột biến Không đột biến Đột biến Không đột biến Bắc 3/9 (33.33%) 6/9 (67.67%) 12/13 (92.3%) 1/13 (7.7%) 0 0 Trung 3/11 (27.3%) 8/11 (72.7%) 7/12 (58.3%) 5/12 (41.7%) 0 0 Nam 4/11 (36.4%) 7/11 (63.6%) 12/14 (85.7%) 2/14 (14.3%) 6/12 (50%) 6/12 (50%) Toàn quốc 10/31 (32.3%) 21/31 (67.7%) 31/39 (79.5%) 8/39 (20.5%) 6/12 (50%) 6/12 (50%) Kết quả giải trình tự gen katG của 82 chủng vi khuẩn lao kháng thuốc, trong đó 64 chủng kháng isoniazid cho thấy, 65/82 (79,3%) mẫu xảy ra đột biến trên đoạn gen nghiên cứu, đột biến có thể xảy ra ở một điểm hoặc nhiều điểm trên gen katG, 47/64 (73,4%) chủng kháng INH xảy ra đột biến tại codon 315. Các mẫu nhạy cảm với INH và chủng chuẩn quốc tế H37Rv đều không phát hiện đột biến nào trên đoạn gen này. Mỗi amino acid có thể được mã hóa bởi nhiều bộ ba. Vì vậy không phải tất cả các đột biến đều dẫn đến sự hình thành một amino acid mới. Các đột biến làm xuất hiện bộ ba mã hóa mới, nhưng không dẫn đến sự hình thành amino acid mới thì không làm thay đổi cấu trúc bậc một của protein, do đó cấu trúc không gian của protein vẫn được giữ vững nên các đột biến này không liên quan tới tính kháng thuốc. Hillemann và cộng sự (2005) khi nghiên cứu trên 143 chủng vi khuẩn lao phân lập từ Đức đã phát hiện ra 103 chủng kháng đa thuốc và 40 chủng nhạy cảm với thuốc chữa lao, trong đó 91/103 (88,4%) chủng kháng đa thuốc xuất hiện đột biến tại codon 315 (Ser à Thr) và tất cả 40 chủng nhạy cảm với thuốc chống lao đều không phát hiện thấy đột biến nào [30]. Một nghiên cứu khác của Ahmad cũng xác định các đặc tính phân tử ở 28 chủng lao kháng INH được phân lập từ Dubai và 17 chủng từ Beirut thấy rằng tỷ lệ đột biến tại codon 315 trên gen katG lần lượt đạt tỷ lệ 64% và 35%, đối với các chủng nhạy cảm với thuốc chống lao, tác giả cũng đã không phát hiện thấy đột biến nào trên gen katG [9], từ đó, các tác giả đã đưa ra kết luận về sự khác nhau giữa tỷ lệ đột biến trên gen katG liên quan kháng INH được phân lập từ các vùng địa lý khác nhau. Đối với các chủng phân lập tại Việt Nam trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy tỷ lệ đột biến tại codon 315 trên gen katG là khá cao (73,4%), do đó việc áp dụng phương pháp sinh học phân tử để phát hiện đột biến liên quan kháng INH sẽ mang lại hiệu quả cao đối với bệnh nhân Việt Nam. Nghiên cứu của Cavusoglu et al (2002) cũng chỉ ra rằng, ngoài đột biến S315T là đột biến phổ biến liên quan tới tính kháng thuốc isoniazid thì vẫn tồn tại các đột biến khác như tại điểm 258 có đột biến G258D. Năm 2008 khi Aslan và đồng tác giả nghiên cứu về xác định đột biến liên quan tới tính kháng thuốc isoniazid cũng cho thấy, ngoài codon 315 là đột biến chính thì vẫn tồn tại các đột biến tại các codon khác, tác giả tìm thấy 2 đột biến khác đó là G279T và A293T. Tuy nhiên, cả hai công bố trên không đưa ra được những chứng cứ về đột biến tại các điểm này có liên quan tới tính kháng thuốc [15; 22]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, chúng tôi phát hiện ra một số điểm đột biến mới, ngoài ra còn có đột biến kiểu thêm nucleotide, đột biến đảo đoạn. Các đột biến này chưa từng được công bố trước đây. Với số lượng mẫu hạn chế và chưa có khả năng xét nghiệm protein nên chúng tôi chưa khẳng định được các đột biến này có liên quan tới tính kháng thuốc isoniazid hay không. Có thể đột biến này là các đột biến mới phát sinh không ảnh hưởng tới tính kháng thuốc, hoặc cũng có thể các đột biến này có liên quan tới tính kháng thuốc isoniazid ở một mức độ nhất định. Để có thể đưa ra một kết luận chính xác về tính kháng thuốc của các chủng vi khuẩn lao này cần phải tiến hành những nghiên cứu sâu hơn. 3.1.4. Kết quả phân tích trình tự gen rpoB Quá trình giải trình tự và phân tích các đột biến trong vùng nóng 81bp của gen rpoB có liên quan kháng rifampicin cũng được tiến hành tương tự và chúng tôi đã thu được một số kết quả như sau (bảng 3.3 và bảng 3.4): Bảng 3.3. Tần số xuất hiện đột biến nucleotide tạo nên sự thay đổi amino acid trong những codon khác nhau trong vùng nóng 81 bp trên gen rpoB. Thay đổi codon và amino axit Thay đổi nucleotide Tần số Mã chủng(*) 516 Asp→Val GAC→GTC 6/51(11,8%) TB05-146;TB05-147;TB05-138 TB06-248;TB06-85;TB06-218 518 Asn→Ser AAC→AGC 2/51(3,92%) TB02-80; TB05-147 519 Asn→Lys AAC→AAA 3/51(5,88%) TB02-58; TB06-249; TB06-134 522 Ser→Leu TCG→TTG 2/51(3,92%) TB06-88; TB06-141 526 His→Leu CAC→CTC 12/51 (23,5%) TB06-128; TB02-124 526 His→Tyr CAC→TAC TB06-83; TB02-113;TB02-112 526 His→Asp CAC→GAC TB02-110;TB02-116 526 His→Arg CAC→CGC TB02-101;TB02-117;TB05-117 526 His→ Ser CAC→AGC TB06-89 526 His→ Thr CAC→ACC TB06-221 530 Leu→ Pro CTG→CCG 3/51(5,88%) TB05-79 530 Leu→Met CTG→ATG TB06-204; TB06-201 531 Ser→Leu TCG→TTG 19/51 (37,25%) TB06-208;TB06-127;TB06-205; TB06-87;TB06-116;TB06-114; TB06-201;TB02-111;TB02-115; TB02-107;TB02-118;TB02-105; TB02-122;TB05-172; TB05-97; 531 Ser→Trp TCG→TGG TB06-199 531 Ser→Phe TCG→TTC TB06-204; TB06-219 531 Ser→Gln TCG→CAG TB06-250 533 Leu→Pro CTG→CCG 4/51(7,8%) TB05-108; TB05-172; TB06-116; TB02-118 (*) Mã chủng và đặc tính kháng thuốc của từng chủng được trình bày trong phần phụ lục 2. Bảng 3.4. Tỷ lệ đột biến làm thay đổi amino acid tại vùng nóng 81 bp của gen rpoB trong các chủng phân lập tại các miền khác nhau. Miền Kháng đơn Kháng đa Siêu kháng Đột biến Không đột biến Đột biến Không đột biến Đột biến Không đột biến Bắc 1/9 (11,1%) 8/9 (88,9%) 12/13 (92,3%) 1/13 (7,7%) 0 0 Trung 1/11 (9%) 10/11 (91%) 11/12 (91,7%) 1/12 (8,3%) 0 0 Nam 3/11 (27,3%) 8/11 (72,7%) 12/14 (85.7%) 2/14 (14.3%) 11/12 (91,7%) 1/12 (8,3%) Toàn quốc 5/31 (16%) 26/31 (84%) 35/39 (89,7%) 4/39 (10,3%) 11/12 (91,7%) 1/12 8,3%) Tổng số 93 chủng vi khuẩn lao được giải trình tự đoạn 528 bp trên gen rpoB, trong đó có 82 chủng kháng thuốc, 10 chủng nhạy thuốc, 1 chủng chuẩn quốc tế H37Rv, chúng tôi phát hiện thấy 51/82 (62,2%) chủng cho thấy đột biến tại một số vị trí riêng biệt trong vùng nóng 81 bp, 31 (37,8%) chủng không đột biến trong vùng DNA được giải trình tự (bảng 3.3 và bảng 3.4), những chủng này kháng với loại kháng sinh khác không phải rifampicin, vì vậy không xác định được đột biến khi giải trình tự đoạn 528 bp trên vùng gen rpoB. Các chủng nhạy thuốc và chủng chuẩn quốc tế đều không phát hiện đột biến nào trên đoạn gen nghiên cứu. Trong tổng số 51 chủng kháng thuốc xảy ra đột biến trong vùng nóng 81 bp cho thấy đột biến xảy ra một số vị trí codon khác nhau, trong đó thường gặp nhất tại vị trí codon 531 (37,25%): Ser-Leu TCG/TTG, Ser-Trp TCG/TGG, Ser- Phe TCG/TTC, Ser-Gln TCG/CAG; sau đó lần lượt là codon 526 (23,5%): His-Leu CAC/CTC, His-Tyr CAC/TAC, His-Asp CAC/GAC, His-Arg CAC/CGC, His-Ser CAC/AGC, His-Thr CAC/ACC; và tại các vị trí codon khác xuất hiện đột biến khoảng từ 3,92% đến 11,8%. Trên codon 531 có 4 loại đột biến khác nhau TCG → TTG/TGG/TTC/CAG, codon 526 có 6 loại đột biến khác nhau CAC → CTC/TAC/GAC/CGC/AGC/ACC. Những đột biến trên gen rpoB được phát hiện trong nghiên cứu này được so sánh với các nghiên cứu khác của những chủng được phân lập từ những khu vực khác nhau trên thế giới, đặc biệt là những đột biến thường gặp, phản ánh bức tranh toàn cảnh của thế giới về vi khuẩn lao kháng thuốc [40]. Trên thế giới, đột biến trên gen rpoB thường gặp tại codons 531 và 526, mặc dù những sự thay đổi liên quan đến tần suất đột biến trên những codons này được mô tả đối với chủng vi khuẩn lao từ những vị trí địa lý khác nhau. Trong nghiên cứu này, hầu hết các chủng kháng rifampicin chứa đựng những đột biến nhầm nghĩa dẫn đến những thay thế amino acid tại phần Ser531 (37,5%), His526 (22,22%). Kết quả của nghiên cứu này được so sánh với các nghiên cứu khác trên thế giới cho thấy đột biến tại codon 531 cũng chiếm ưu thế ở Việt nam [42] (Bảng 3.5). Bảng 3.5. Kết quả những vị trí đột biến thường gặp của các nghiên cứu khác. TT Tác giả khác Những codons đột biến thường gặp Vị trí 531 Vị trí 526 Tổng cộng 1 Ann S., et al. (2005) Singapore 28/51 (55%) 12/51 (23,5%) 40/51 (78,5%) 2 Andréia Rosane M. valim, et al. (2000) Brazin 46/92 (50%) 19/92 (20,6%) 65/92 (70,6%) 3 Kazue Hirano, et al. (1999) Japan 48/90 (53%) 15/90 (17%) 63/90 (70%) 4 Hairong Huang, et al. (2002) China 91/199 (45.7%) 41/199 (20,6%) 132/199 (66,3%) 5 Cheruvu Mani, et al. (2001) India 28/52 (53.8%) 10/52 (19,2%) 38/52 (63%) Người ta cũng quan sát thấy những đột biến chiếm ưu thế cao tại Ser-531 cũng thường xảy ra tại các chủng ở Đức (75.7%) [30], Peru (68.1%) [45] và Italy (63.3%) [33]. Những đột biến His-526 chủ yếu được quan sát tại Mỹ (44%) và Trung Quốc (40%) [24]. Kết quả phân tích các chủng vi khuẩn của chúng tôi cho thấy tần suất của những đột biến này thấp hơn. Phạm vi tác động lớn của những sự thay đổi phổ biến thấp hơn ở những chủng Việt Nam có thể giải thích bởi sự thay đổi vị trí địa lý, sự phân bố của chủng vi khuẩn lao cùng với những đột biến thay đổi trên gen rpoB dẫn đến kháng rifampicin [32]. Những kết quả nghiên cứu trên thế giới đều cho rằng đột biến ở gen rpoB và katG chủ yếu là đột biến thay thế một nucleotide, ít có các đột biến phức tạp [34; 39; 47]. Qian và cộng sự (2002) đã nghiên cứu đột biến ở vùng RRDR (rifampin resistance determining region - Vùng quyết định kháng rifampicin) của gen rpoB trên 66 chủng vi khuẩn lao được thu thập ở 4 nước Đông Á là Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, và Đài Loan. Trong số các chủng lao đó có 59/66 (89,4%) được xác định là có đột biến; 7/66 chủng không phát hiện thấy đột biến nào ở vùng RRDR của gen này. Ở các chủng đột biến đã giải trình tự cho thấy mỗi chủng chỉ có một đột biến điểm ở một codon. Có 58/59 trường hợp là đột biến thay thế, chỉ có 1 trường hợp duy nhất là đột biến thêm nucleotide [39]. Tại Việt Nam, Caws và các đồng tác giả (2006) đã xác định đột biến liên quan đến tính kháng đa thuốc trên 131 chủng vi khuẩn lao được phân lập tại bệnh viện Phạm Ngọc Thạch. Các tác giả đã đồng thời xác định tính kháng thuốc rifamicin và isoniazid qua xác định đột biến trên gen rpoB và katG. Kết quả đã xác định được 100 chủng có đột biến trên gen rpoB trong số 104 chủng kháng rifamicin, đồng thời cũng phát hiện có đột biến xảy ra tại codon 315 trên gen katG ở các chủng lao kháng isoniazid. Đối với các chủng vi khuẩn lao nhạy cảm với thuốc, các tác giả cũng không nhận thấy đột biến nào trên các gen có liên quan này [21]. Qua kết quả giải trình tự gen katG và rpoB của 93 chủng vi khuẩn lao, trong đó có 82 chủng kháng thuốc, chúng tôi nhận thấy việc xác định đột biến liên quan kháng thuốc isoniazid và rifampicin bằng kỹ thuật giải trình tự DNA cho biết chính xác vị trí đột biến cũ và mới trên gen nghiên cứu, qua đó mang lại hiểu biết sâu sắc về sự đa dạng trong cấu trúc quần thể vi khuẩn lao ở bệnh nhân nhiễm vi khuẩn lao kháng thuốc, nghiên cứu sự lan truyền của vi khuẩn lao trong phạm vi của một quốc gia và trên toàn cầu. Đặc biệt kết quả thu được của đề tài làm tiền đề xây dựng một số bộ kit multiplex real-time PCR, nhằm phát hiện nhanh vi khuẩn lao kháng rifampicin và isoniazid tại Việt Nam. Trong phạm vi đề tài giải trình tự đoạn DNA của gen katG và gen rpoB chúng tôi dự định sử dụng các vị trí đột biến Ser315Thr trên gen katG và Ser531 và His526 trên gen rpoB thường xuất hiện trong các chủng vi khuẩn lao kháng đa và siêu kháng làm đích để thiết kế các probes cho kit multiplex real-time PCR. Ưu điểm của bộ kit multiplex real-time PCR phát hiện nhanh vi khuẩn lao kháng thuốc là một hệ thống kín, tránh được quá trình lây nhiễm chéo, thời gian chẩn đoán nhanh (từ 2 -3 giờ là cho kết quả), hơn nữa giá thành bộ kit multiplex real-time PCR xây dựng tại Việt Nam phù hợp điều kiện kinh tế của cộng đồng dân cư. Do đó bộ kit này có thể sử dụng trong hệ thống bệnh viện, trung tâm y tế nhằm chẩn đoán nhanh và định lượng vi khuẩn lao kháng thuốc trên toàn quốc. 3.2. TỐI ƯU HÓA PHẢN ỨNG MULTIPLEX REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN NHANH VI KHUẨN LAO KHÁNG THUỐC 3.2.1. Thiết kế các primer và probe cho phản ứng multiplex real-time PCR Dựa trên trình tự của các đoạn gen đích công bố trên genbank và các vị trí đột biến trên gen đó cần phát hiện, chúng tôi lựa chọn những vùng có độ bảo thủ cao nhất để thiết kế primer. Trình tự các primer và probe được thiết kế để bắt cặp bổ sung hoàn toàn với chủng M. tuberculosis hoang dại (wild type) (bảng 3.6). Các probe dùng cho phản ứng multiplex real-time PCR sử dụng cho nghiên cứu này được thiết kế theo công nghệ dò TaqMan (TaqmanR Chemistry) của hãng Applied Biosystems. Để thiết kế được các Taqman probe dùng cho multiplex real-time PCR thì yếu tố quan trọng nhất là phải lựa chọn như thế nào để bước sóng kích thích các reporter (chất phát huỳnh quang), và nhất là bước sóng huỳnh quang phát ra từ các reporter sẽ không bị ảnh hưởng lên nhau. Ngoài ra trên thực tế sự lựa chọn reporter còn tùy thuộc vào các kênh lọc màu có trên thiết bị real-time nữa. Trong trường hợp này các probe được thiết kế là loại Taqman MGB (Minor Groove Binding) probe có gắn 2 2 reporter ở đầu 5’ là FAM hoặc VIC cho phép phát ra bước sóng huỳnh quang lần lượt là 530 nm và 560 nm. Các quencher ở đầu 3’ của các probe là các BHQ (bảng 3.6). Dạng Taqman MGB probe có gắn các quencher BHQ có ưu điểm là hút lất tất cả các huỳnh quang từ reporter không cho bất cứ huỳnh quang nào phát ra được từ reporter, và reporter chỉ phát được huỳnh quang khi probe bị cắt bởi Taq polymerase. Bảng 3.6. Trình tự và các thông số cần thiết của các cặp primer và probe được thiết kế cho nghiên cứu Primer: Gen đích Tên mồi Trình tự nucleotide KT (bp) rpoB rpoB_real_F 5'-ACACCGCAGACGTTGATCA-3' 363 rpoB_real_R 5'-CTAGTGATGGCGGTCAGGTAC-3' katG katG_real_F 5'-TGGGCTGGAAGAGCTCGTAT-3' 105 katG_real_R 5'-GGAAACTGTTGTCCCATTTCG-3' Probe: Gen đích Tên probe Trình tự nucleotide rpoB Control 5'-FAM-TCTTCGGCACCAGC-MGB-BHQ1-3' katG katG315 5'-VIC-CACCAGCGGCATC-MGB-BHQ2-3' rpoB rpoB526 5'-VIC-TGACCCACAAGCGC-MGB-BHQ2-3' rpoB531 5'-FAM-CAGCGCCGACAGT-MGB-BHQ1-3' Trong nghiên cứu này, để phát hiện vị trí đột biến xảy ra với tần suất cao nhất trên vùng nóng của gen