Luận văn Nghiên cứu sản xuất ethanol nhiên liệu từ thân và hạt của cây cao lương ngọt Sorghum bicolor

các liên kết b- 1,4 glicoside trong tinh bột, phân cắt từng gốc mantoase từ một đầu không khử của mạch. Khi tác dụng lên tinh bột b- amylase thuỷ phân hồ tinh bột một cách rất mạnh mẽ. b- amylase phân giải 100% amylose thành mantose nhưng khi gặp liên kết a - 1,4 glicoside đứng kế cận liên kết a - 1,6 glucoside thì b- amylase ngừng tác dụng. Sơ đồ biểu diễn tác dụng của b - amylase: Tinh bột mantose Glucoamylase Đây là enzyme thuỷ phân liên kết a- 1,4 và a - 1,6 glucoside. Ngoài ra nó còn thuỷ phân cả liên kết a - 1,2 và 1,3 glucoside nữa. Tỷ lệ thủy phân phụ thuộc vào các loại liên kết cũng như độ dài chuỗi, tức là, mối liên kết a- 1,4 glucoside được thủy phân dễ dàng hơn so với mối liên kết a- 1,6 glucoside và tỷ lệ maltotriose và maltose ít bị phá vỡ hơn chuỗi oligosaccharides. Enzyme này hoạt động ở pH tối ưu khoảng 4,0 và nhiệt độ tối ưu là 750. Glucoamylase có khả năng phân huỷ hoàn toàn tinh bột, glycogen, amylopectin, dextrin cuối, panose, isomantose và mantose tới glucose [35]. Chương 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu 2.1.1. Cao lương ngọt - Mẫu thân cao lương do Viện Môi trường Nông nghiệp cung cấp, được trồng 3 – 4 tháng tại Thường Tín Hà Nội, trung bình mỗi cây đạt chiều cao 3 – 4 m. Sau khi thu hoạch các cây được róc lá trước khi tiến hành các nghiên cứu. - Hạt cao lương ngọt được xay thành bột do Viện Môi trường Nông nghiệp cung cấp. 2.1.2. Chủng vi sinh vật Các chủng nấm men (31 chủng) sử dụng trong nghiên cứu được Viện Công nghiệp thực phẩm và bộ môn Vi sinh vật trường đại học Khoa học Tự nhiên cung cấp. Các enzyme dịch hóa Termamyl (liquerzyme; α amylase), đường hóa AMG (glucoamylase) của NOVO. 2.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu 2.2.1. Hóa chất Các hóa chất, dung dịch đệm tiêu chuẩn dùng cho nghiên cứu được thu mua từ các hãng SIGMA, MECRK, LKB, tinh khiết và chính xác cao. + H2SO4 0.75% + NaOH 1.5% + H2O + Dung dịch Somogyi 1 (Na2CO3; Kali tartrate; CuSO4.5H2O; NaHCO3; Nước cất) + Dung dịch Somogyi 2 ((NH4)6Mo7O244H2O; H2SO4 đặc 96%; Na2HasO4.7H2O; Nước cất) + Dung dịch đệm natri acetat 0.01 M, 0.05M, 0.1M, 0.2M, 0.5M, 1M pH 5. + FeS04.7H2O; CoCl2.6H2O; ZnSO47.H20; MnSO4.H20; CuSO4.5H20 + Các dung dịch đường glucose chuẩn. + Nước cất 2 lần có qua xử lý ion. 2.2.2. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu Các dụng cụ, thiết bị dùng trong quá trình nghiên cứu Máy ly tâm eppendorf centrifuge Máy ly tâm lạnh Sigma 3K30 Bình Elgol, bình lên men Máy đo quang phổ Pharmacia Biotech Ultrosped 1000E Máy đo pH Beckman 310 Bể ổn nhiệt, máy khuấy từ IKA Thiết bị cất cồn Salleron Dujadin Cân phân tích Precisa 250A 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Sản xuất ethanol từ dịch ép thân cao lương ngọt Quy trình sản xuất ethanol từ dịch ép thân cao lương ngọt được tiến hành theo sơ đồ trên hình 10. Thân cao lương ngọt Lên men dịch ép Cất dịch lên men Ép thân lấy dịch Lọc dịch ép Ethanol Chất dinh dưỡng bổ sung Hơi Nấm men Hình 10. Quy trình sản xuất ethanol từ dịch ép thân cao lương ngọt 2.3.1.1. Xác định lượng dịch ép trong thân cao lương Máy ép mía được sử dụng để ép thân cao lương, và để phù hợp với quy mô của máy, thì sáu thân cây cao lương ngọt (gồm cả ngọn và gốc) được lấy để chặt thành từng đoạn nhỏ khoảng 70 cm sấy khô đến khối lượng không đổi ở 1050C. Sự chênh lệch khối lượng trước và sau khi ép chính là lượng nước có trong thân. Thể tích dịch tối đa trong cây được tính theo lượng nước trong cây. Khối lượng giảm 1g tương ứng với 1 ml dịch có trong thân (do khối lượng riêng của nước bằng 1g/ ml). 2.3.1.2. Phương pháp ép dịch Thân cao lương có nhiều đặc điểm giống thân cây mía, do đó trong nghiên cứu sử dụng máy ép mía để thu dịch ép. Thân cao lương khi thu hoạch trên đồng ruộng, được róc lá sơ bộ, sau đó được chặt thành từng đoạn nhỏ có kích thước khoảng 1m. Tiếp đó, thân cây được cho vào máy ép mía có công suất 1,5 kW và được ép 6 lần. Lần thứ nhất và thứ 2: số lượng các đoạn thân trong 1 lần đi qua máy là 3 đoạn; lần thứ 3 – 4: số lượng các đoạn thân trong 1 lần đi qua máy ép là 6; lần thứ 5 – 6: một lần 8 đoạn đi qua máy ép. 2.3.1.3. Xác định số lượng tế bào nấm men Số lượng tế bào nấm men trong quá trình tiếp giống được xác định nhờ phương pháp đếm tế bào bằng buồng đếm Thoma. Buồng đếm là một phiến kính dày (75x32x4) có rãnh chia phiến kính thành 3 khoảng ngang, khoảng giữa được chia thành 2 khoảng nhỏ, trên mỗi khoảng nhỏ có kẻ một lưới đếm gồm 16 ô vuông lớn (4x4). Mỗi ô vuông lớn lại chia thành 16 ô vuông con. Mỗi ô vuông con diện tích là 1/400 mm2 và chiều cao là /10 mm. Buồng đếm được đậy một lá kính dày. Tiến hành đếm: - Lắc đều ống nghiệm pha loãng mẫu. - Đậy lá kính trên lưới đếm. - Dùng pipet vô trùng lấy mẫu cho một giọt vào mép lá kính. Do sức mao dẫn dịch tự tràn vào bề mặt lưới đếm. Chú ý không để tạo thành bọt khí trong lưới đếm hoặc tràn xuống rãnh. - Đặt phòng đếm lên thị trường hiển vi và để yên trong 3 – 5 phút sau đó tiến hành đếm trong 5 ô lớn chéo nhau. Chỉ đếm những tế bào nằm trong lòng ô con và những tế bào nằm trên 2 cạnh liên tiếp cùng chiều. đếm lần lượt 16 ô con. Số lượng tế bào được tính theo công thức: SLNM = (a x 4000 x 103 x 10n)/b a: Tổng số tế bào nấm men trong 5 ô lớn b: Số ô con trong 5 ô lớn (16 x 5 = 80 ô con) 1/4000 mm3: Thể tích 1 ô nhỏ (1/400 mm2 x 1/10 mm) 103: Hệ số chuyển mm3 thành ml ( 1000mm3 = 1 ml) 10n: Độ pha loãng mẫu 2.3.1.4. Tuyển chọn các chủng nấm men bằng bình Engol Bình Engol là một dụng cụ phổ biến thường được dùng để tuyển chọn các chủng nấm men lên men ethanol. Khi có hiện tượng lên men xảy ra trong bình, khí CO2 được sinh ra trong quá trình lên men sẽ đẩy cột nước đi xuống. Hình 11. Bình Engol Nếu chủng nào có khả năng tạo CO2 đẩy hết 5ml dịch trong thời gian ngắn nhất thì chủng đó có khả năng lên men mạnh nhất. Dựa vào số ml nước bị đẩy xuống có thể tính được lượng CO2 sinh ra. Lượng CO2 sinh ra tỷ lệ thuận với lượng ethanol được tạo thành theo phương trình Neuberg 1. Vì vậy dựa vào lượng CO2 được tạo thành có thể tính được lượng ethanol hình thành trong quá trình lên men. 2.3.1.5. Tuyển chọn các chủng nấm men bằng bình lên men Bình lên men là loại dụng cụ chuyên dụng nhằm xác định khá chính xác lượng ethanol được tạo thành dựa vào lượng CO2 được sinh ra trong lên men. Lượng CO2 sinh ra trong lên men sẽ tỷ lệ thuận với độ giảm trọng lượng của bình. Nguyên nhân là do trong quá trình nuôi cấy nấm men, lượng CO2 sinh ra sẽ thất thoát ra ngoài môi trường theo đường ống còn các khí khác và nước sẽ không thoát ra do sự ngăn chặn của H2SO4 đặc.Vì vậy dựa vào độ giảm khối lượng của bình theo thời gian nuôi cấy sẽ xác định được lượng CO2 sinh ra, qua đó sẽ tính được lượng ethanol hình thành. Hình 12. Bình lên men 2.3.1.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ tế bào đến khả năng sinh ethanol Nấm men được nuôi khởi động trên môi trường thạch nghiêng Malt dịch trong 18 giờ ở 30oC. Tiếp giống với tỷ lệ lần lượt là 2x106; 2x107; 2x108 tb/ml vào các bình lên men chứa 150ml dịch chiết cây cao lương nồng độ đường 15% Bx, pH 6, nhiệt độ 30oC lên men trong vòng 72 giờ rồi chưng cất. Đánh giá các thông số: Khối lượng bình giảm (lượng CO2 sinh ra), lượng đường sót, nồng độ cồn để xác định mật độ tế bào nấm men thích hợp cho lên men. 2.3.1.7. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ đường đến khả năng sinh ethanol Nấm men được nuôi khởi động trên môi trường thạch nghiêng Malt dịch thể trong 18 giờ ở 300C, tiếp giống với tỷ lệ là 2x107tb/ml vào các bình Smith chứa 150ml dịch chiết cây cao lương với nồng độ đường lần lượt là: 11,13,15,17,19 % Bx, pH6, nhiệt độ 300C lên men trong vòng 72 giờ rồi chưng cất. Đánh giá theo các thông số: Khối lượng bình giảm (lượng CO2 sinh ra), lượng đường sót, nồng độ cồn để xác định nồng độ đường của dịch cao lương nấm men thích hợp cho lên men. 2.3.1.8. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng lên men Nấm men được nuôi khởi động trên môi trường thạch nghiêng Malt dịch trong 18 giờ ở300C, tiếp giống với tỷ lệ là 2x107tb/ml vào các bình Smith chứa 150ml dịch chiết cây cao lương độ Bx là 15 %, pH6, tại các nhiệt độ lần lượt là 250C, 300C, 350C lên men trong vòng 72 giờ rồi chưng cất. Đánh giá theo các thông số: Khối lượng bình giảm (lượng C02 sinh ra), lượng đường sót, nồng độ cồn để tìm ra nhiệt độ thích hợp cho lên men 2.3.2. Sản xuất ethanol từ bã cao lương ngọt 2.3.2.1. Phương pháp tiền xử lí bã cao lương ngọt - Xử lý cơ học: Bã cao lương được phơi khô và nghiền nhỏ với kích thước ≤ 3mm - Xử lý hóa lý: Để loại hết đường còn sót lại trên bã sau ép, bã cao lương được rửa với nước nóng (3lần). Sau đó bã được xử lý với H2SO4 0,75% ở nhiệt độ 1150C trong 1 giờ và tiếp theo được hấp với NaOH 1N. Sau đó bã được rửa sạch và chỉnh về pH 5. Bã sau xử lý được sấy khô và được bảo quản trong điều kiện lạnh 4oC. 2.3.2.2. Phương pháp thủy phân Bã ép thân cao lương đã xử lí Bổ sung vào cơ chất dung dịch đệm natri acetat,0.05M, pH = 5. Bổ sung enzyme cellulase và β-glucosidase Thủy phân ở nhiệt độ 50oC trong thời gian 24h, lắc trong tủ ổn nhiệt. Phương pháp thủy phân bã ép thân cao lương sau tiền xử lý bằng enzyme Hình 13. Sơ đồ thủy phân bã ép thân cây cao lương ngọt Dịch sau thủy phân được chia vào các ống eppendorf để li tâm lạnh với 3000 vòng/phút trong thời gian là 10 phút. Dịch trong thu được dùng để phân tích theo phương pháp Nelson Somogyi để xác định được hàm lượng đường khử. 2.3.2.3. Phương pháp lên men cồn Lên men cồn là quá trình chuyển hoá đường thu được sau thuỷ phân thành cồn. Đây là một trong những quá trình quan trọng trong sản xuất cồn nhiên liệu. Chuẩn bị giống + Môi trường nhân giống Nước Malt 11 độ Bx, hấp thanh trùng môi trường ở 1210C trong 20 phút. Cấy giống nấm men H12A.4 vào các ống nghiệm chứa môi trường nhân giống đã thanh trùng. Nuôi cấy đi lắc 120 vòng /phút ở 280C trong 24h. + Lên men Cho bã ép thân cao lương đã xử lý vào các bình Schott, bổ sung thêm dung dịch đệm natri acetat và enzyme với nồng độ khảo sát tối ưu. Tiếp 5% giống 24 h tuổi so với cơ chất. Tiến hành thuỷ phân và lên men đồng thời ở nhiệt độ 340C. 2.3.3. Sản xuất ethanol từ hạt cao lương ngọt 2.3.3.1. Lựa chọn tỷ lệ bột dịch Nồng độ bột cao lương được thay đổi từ: 15%; 20%; 25%; 30% và 35%. Bổ sung enzyme termamyl 0,12%, pH 6,5, nâng nhiệt độ lên 950C, giữ 30 phút,sau hạ nhiệt về 650C, bổ sung AMG tỷ lệ 0,5%, giữ 650C/60 phút. Tiến hành xác định nồng độ chất khô, DE dịch hóa và DE đường hóa. 2.3.3.2. Xác định ảnh hưởng của pH đến quá trình dịch hóa Thí nghiệm được tiến hành với nồng độ bột dịch 30%, tỷ lệ enzyme termamyl bổ sung là 0,12%, nhiệt độ lên 950C, thời gian 30 phút, pH thay đổi từ 3,5 -7,0. Xác định DE dịch hóa và độ nhớt của dịch. 2.3.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình dịch hóa Thí nghiệm được tiến hành với nồng độ bột dịch 30%, tỷ lệ enzyme termamyl bổ sung là 0,12%, pH bột dịch là 5,5, nhiệt độ thay đổi từ 85 – 1000C, thời gian dịch hóa 30 phút. Xác định DE dịch hóa và độ nhớt của dịch. 2.3.3.4. Ảnh hưởng của nồng độ enzym termamyl đến quá trình dịch hóa Thí nghiệm được tiến hành với nồng độ bột dịch 30%, pH 5,5, nhiệt độ dịch hóa 950C, thời gian dịch hóa là 30 phút. Bổ sung termamyl tỷ lệ 0,04; 0.06; 0,08; 0,10; 0,12 và 0,14% (tính theo bột cao lương). Sau dịch hóa xác định hàm lượng chất khô (Bx), DE dịch hóa và độ nhớt của dịch. 2.3.3.5. Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình dịch hóa Thí nghiệm được tiến hành với nồng độ bột dịch là 30%, pH 5,5, tỷ lệ termamyl bổ sung là 0,06%, nhiệt độ dịch hóa 950C, thời gian dịch hóa thay đổi từ 5 -50 phút. Xác định hàm lượng chất khô (Bx), DE dịch hóa và độ nhớt của dịch. 2.3.3.6. Xác định nồng độ enzyme đường hóa thích hợp Thí nghiệm được tiến hành với nồng độ bột dịch là 30%, pH 5,5, tỷ lệ termamyl bổ sung là 0,06%, nhiệt độ dịch hóa 950C, thời gian dịch hóa 30 phút. Hạ nhiệt xuống 650C, bổ sung AMG với nồng độ 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 và 0,6% đường hóa trong 60 phút. Li tâm, xác định hàm lượng chất khô (Bx) và DE đường hóa. 2.3.3.7. Xác định thời gian đường hóa thích hợp Thí nghiệm được tiến hành với nồng độ bột dịch là 30%, pH 5,5, tỷ lệ Termamyl bổ sung là 0,06%, nhiệt độ dịch hóa 950C, thời gian dịch hóa 30 phút. Hạ nhiệt xuống 650C, bổ sung AMG 0,5%, thời gian đường hóa thay đổi từ 30 -90 phút. Li tâm, xác định hàm lượng chất khô (Bx) và DE đường hóa. 2.3.3.8. Xác định tỷ lệ giống sử dụng trong lên men Môi trường lên men có nồng độ bột dịch 30%, được bổ sung sinh khối 24 giờ tuổi của chủng H12A.4, theo tỷ lệ 0,25g; 0,5g; 0,75g và 1g/200ml. Lên men ở 300C. Đếm số lượng lệ tế bào nấm men trong dịch, xác định hàm lượng CO2 tạo thành, hàm lượng đường sót, hàm lượng cồn và axit tổng sau lên men. 2.3.3.9. Xác định nguồn dinh dưỡng bổ sung đến quá trình lên men cồn Thí nghiêm được tiến hành với dịch đường hóa hạt cao lương (nồng độ bột dịch 30%), tỷ lệ sinh khối nấm men 0,25%, bổ sung dinh dưỡng MgSO4, (NH4)2SO4, KH2PO4, ure, lên men ở 300C trong 5 ngày. Xác định hàm lượng cồn, đường dư và axit tổng sau lên men. 2.3.3.10. Xác định quá trình lên men cồn từ dịch thủy phân hạt cao lương Thí nghiêm được tiến hành với dịch đường hóa hạt cao lương (nồng độ bột dịch 30%), tỷ lệ giống tiếp là 0,25%, bổ sung dinh dưỡng MgSO4 0,05%, KH2PO4 0,5% và ure 0,136%. Lên men ở 300C trong 7 ngày. Theo dõi lượng CO2 tạo thành và xác định hàm lượng cồn, đường dư sau lên men. 2.3.3.11. Quy trình sản xuất ethanol từ hạt cao lương ngọt Dịch hóa (dịch bột 30%, pH 6,5 Nhiệt độ dịch hóa 950C.30 phút) Đường hóa (650C;60 phút) Lên men ở 300C/ 5 ngày Chưng cất, tinh chế cồn Sinh khối nấm men 0,25%; MgSO4 0,05%; KH2PO4 0,5% ure 0,136% AMG 0,5% Termamyl 0,06% Hạt cao lương xay thành bột Quy trình công nghệ sản xuất ethanol nhiên liệu từ hạt cao lương ngọt được xây dựng theo mô hình sau: Hình 14. Quy trình sản xuất ethanol từ hạt cao lương ngọt 2.3.4. Các phương pháp phân tích 2.3.4.1. Phương pháp xác định nồng độ chất khô Sử dụng chiết quang kế để xác định nồng độ chất khô. Phương pháp này gồm hai bước: Bước 1: Kiểm tra sự chính xác của dụng cụ. Lau sạch phiến kính ở chiết quang kế, rồi nhỏ một giọt nước cất ở nhiệt độ 200C, sau đó đậy phiến kính lại và quan sát. Quan sát chỉ số bằng vạch phân cách giữa hai vùng sáng tối. Chỉ số thu được cần nằm ở vạch số 0 tức nồng độ chất khô bằng 0%. Trong trường hợp khác số 0 thì cần hiệu chỉnh khi xác định nồng độ chất khô của dung dịch cần đo. Hình 15. Chiết quang kế Bước 2: Xác định nồng độ chất khô của dung dịch Nhỏ một giọt dung dịch cần đo lên mặt phiến kính, đậy lại và quan sát. Cần xác định ở 20 0C , nếu đo ở nhiệt độ khác cần đo bảng hiệu chỉnh. 2.3.4.2. Phương pháp xác định độ nhớt: Sử dụng nhớt kế Otvan Nhớt kế Otvan có hình chữ U, một bên có mao quản. Phần trên của mao quả nối liền với một hay hai bầu bình cầu. Nhớt kế Otvan dùng để xác định độ nhớt với từng nồng độ xác định. Thể tích dung dịch dùng cho mỗi một lần đo phải hoàn toàn bằng nhau Hình 16. Nhớt kế Otvan Cách đo: Dùng ống đong lấy 25ml dung dịch nghiên cứu cho vào nhánh phải (nhánh không có mao quản) của nhớt kế, dùng quả bóp cao su đẩy dung dịch qua nhánh có mao quản lên quá mức A một ít, rồi tháo quả bóp cao su cho dung dịch chảy tự nhiên và dùng đồng hồ bấm giây đo thời gian dung dịch chảy từ ngấn A đến ngấn B. Đo lại 3 ÷ 4 lần, lấy giá trị trung bình (chú ý thời gian mỗi lần đo không được khác nhau quá 0,2 giây). Giá trị đo được là thời gian t. Khi đó: K được tính theo thời gian mà chất lỏng chuẩn chảy qua nhớt kế. ηo, do, to là độ nhớt, tỉ trọng và thời gian chảy của chất lỏng chuẩn. Biết K sẽ xác định được độ nhớt tuyệt đối của chất theo hệ thức trên, trong đó t là thời gian chảy trung bình của dung dịch. 2.3.4.3. Phương pháp đo độ cồn Dịch sau lên men được ly tâm và đem cất cồn. Ở đây chúng tôi sử dụng bộ cất cồn phòng thí nghiệm Salleron Dujardin của Pháp để cất. Thiết bị này cho ta biết được độ cồn thu được trong quá trình lên men qua nhiệt độ sôi của dịch. 2.3.4.4. Xác định lượng CO2 sinh ra trong quá trình lên men Khả năng lên men được đánh giá bằng khối lượng CO2 sinh ra. Để xác định lượng CO2 sinh ra trong quá trình lên men ta đo sự giảm khối lượng của bình sau những thời gian nuôi cấy xác định cho đến khi khối lượng không đổi bằng phương pháp cân bình. Một số phương pháp khác: - Phương pháp xác định đường khử Lane – enyon. - Phương pháp xác định axit tổng: Sử dụng phương pháp chuẩn độ bằng NaOH 0,1N, chỉ thị phenolphtalein. - Lượng đường khử được xác định bằng phương pháp Nelson-somogy. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Thông thường, ethanol chỉ được sản xuất từ dịch ép thân cây cao lương ngọt, nhưng với đề tài nghiên cứu này chúng tôi sẽ tiến hành nghiên cứu triệt để cả phần thân và hạt cao lương, trong đó phần thân bao gồm cả dịch ép vã bã sau khi ép. Từ đó, cho chúng ta thấy bức tranh tổng quát về khả năng sinh ethanol của cả cây cao lương. 3.1. Nghiên cứu sản xuất ethanol nhiên liệu từ thân cây cao lương ngọt 3.1.1. Nghiên cứu khả năng chiết rút dịch đường từ thân cao lương ngọt Việc nghiên cứu sơ bộ khả năng chiết rút dịch đường từ thân cây cao lương ngọt cho thấy hàm lượng dịch (nước) tối đa trong thân cây cao lương là khá cao, chiếm 80% trọng lượng thân. Do thân cây cao lương ngọt có nhiều đặc điểm giống cây mía, nên máy ép mía công suất 1,5 kW/h đã được sử dụng để chiết rút dịch đường từ nguyên liệu này và thân cao lương được ép đi ép lại khoảng 6 lần thì cho hiệu suất thu hồi dịch ép cao nhất. Do thời gian bảo quản (trong điều kiện thường) ảnh hưởng rất lớn đến hàm lượng đường và lượng dịch thu được nên chúng tôi đã khảo sát sự thay đổi hai đại lượng này theo thời gian bảo quản. Mẫu cao lương sau khi thu hoạch được chặt thành từng đoạn khoảng 1 m, mỗi mẫu 5 kg và được ép ngay sau khi thu hoạch ( 0 ngày), ép sau khi thu hoạch 1 ngàyvà sau 6 ngày. Để đánh giá sự biến động của hàm lượng đường và lượng dịch thu được theo thời gian, hàm lượng đường và lượng dịch thu được ngày đầu được coi là 100%, các ngày tiếp theo được tính theo ngày đầu. Kết quả được thể hiện ở bảng 1 và hình 17. Bảng 1. Biến động của lượng dịch và hàm lượng đường theo thời gian Thời gian Khối lượng (kg) Thể tích dịch (L) Khả năng thu dịch ép (%) Hàm lượng đường (BX) Hiệu suất thu hồi đường(%) 0 ngày 5,00 2,40 100,00 11 100 1 ngày 4,70 2,25 93,75 11 100 2 ngày 4,50 1,95 81,25 11 100 3 ngay 4,20 1,80 75,00 9 82 4 ngày 3,80 1,50 62,50 7 64 5 ngày 3,60 1,30 54,00 7 64 6 ngày 3,40 1,10 45,00 6 55 Hình 17. Sự biến thiên hàm lượng đường và lượng dịch ép theo thời gian Kết quả thu được cho thấy: Khối lượng dịch ép thân giảm theo thời gian cụ thể là: thể tích dịch thu được lớn nhất khi ép ngay trong ngày đầu tiên và sau đó giảm theo thời gian và sau 6 ngày lượng dịch thu được chỉ đạt 45% so với ngày đầu tiên. Nguyên nhân của hiện tượng này là do sự mất nước trong thân khi bảo quản ở điều kiện bình thường. Lượng đường của dịch ép cũng giảm theo thời gian. Trong 3 ngày đầu tuy hàm lượng đường là 11 độ Brix nhưng do thể dịch giảm nên lượng đường cũng giảm, tuy nhiên sự suy giảm không đáng kể. Từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 6 lượng đường đã giảm một cách rõ rệt. Đến ngày thứ 6 hàm lượng đường chỉ còn lại 55% so với ngày đầu. Lượng đường giảm có thể do sự lên men của các vi sinh vật, sự phân hủy đường trong cây. Những kết quả này cho thấy, cao lương sau khi thu hoạch nên ép dịch ngay, nếu bảo quản trong điều kiện thường chỉ nên tối đa là 2 ngày. 3.1.2. Hàm lượng đường thành phần trong dịch ép thân cao lương ngọt Hai giống cao lương ngọt có hàm lượng đường cao được kiểm tra lượng đường thành phần, đó là giống 4a và giống 7a. Hai giống này có năng suất và chất lượng vượt trội so với các giống khác. Kết quả phân tích hàm lượng các đường thành phần cũng chứng tỏ chất lượng của 02 giống này Bảng 2: Hàm lượng đường trong thân cao lương ngọt Giống Đốt thân (kể từ gốc đến ngọn) Fructose (%) Glucose (%) Saccharose (%) Tổng 3 loại đường (%) 4a 1-2 2,42 5,07 4,32 11,81 3-4 1,93 4,25 8,12 14,30 5-6 1,05 2,24 9,68 12,97 7a 1-2 6,22 9,67 0,34 16,23 3-4 4,31 6,70 2,97 13,98 5-6 2,14 4,74 7,36 14,24 Bảng 2 cho thấy hàm lượng glucose và fructose giảm dần từ gốc đến ngọn, còn saccharose lại tăng dần. Ở giống 7a đốt 1 - 2 thì hàm lượng fructose ( đạt 6,22%) và glucose ( đạt 9,67%) cho giá trị cao nhất, mặt khác hàm lượng 2 loại đường này cũng cao hơn hẳn so với giống 4a. Tuy nhiên, giống 4a lại có hàm lượng saccharose cao hơn giống 7a và cao nhất ở đốt 5-6 (9,68%). Nhìn chung, tổng hàm lượng đường ở giống 7a cao hơn giống 4a. 3.1.3. Tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng lên men dịch ép thân cao lương Sau khi thu được dịch ép thân cao lương, chúng tôi đã tiến hành phân lập nấm men, tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng lên men tốt nhất. 3.1.3.1. Tuyển chọn các chủng nấm men bằng bình Engol Ba mươi mốt chủng nấm men đã thu thập được tiến hành nuôi cấy trong bình Engol, nhằm chọn ra những chủng nấm men cho hoạt tính lên men cao nhất. Các chủng nấm men được làm trẻ hoá trên môi trường Hansen dịch thể trong 18 giờ nuôi cấy lắc ở 300 C, sau đó tiếp giống theo tỷ lệ 2x107 tb/ml vào các bình Engol có chứa 20ml dịch trên 2 loại môi trường: Hansen dịch thể 5%Bx và dịch chiết cây cao lương 5%Bx . Quá trình lên men được theo dõi và được xác định bằng cách tính thời gian để lượng CO2 sinh ra đạt 5ml. Kết quả được trình bày tại bảng 3. Bảng 3. Khả năng lên men của các chủng nấm men trên thiết bị bình Engol Chủng nấm men Thời gian đạt 5ml CO2(h) Chủng nấm men Thời gian đạt 5ml CO2(h) Hansen (5%Bx) Cao lương (5%Bx) Hansen (5%Bx) Cao lương (5%Bx) H5.1 10 7,5 B6.1 6,5 6,3 H6.1 7,1 6,9 B6.2 6,2 5,5 H6.2 10 7,5 B8.2 7,3 7,1 H6.3 9,4 9,0 B9.2 9,1 7,5 H6.4 6,9 6,7 B9.3 5,6 5,3 H9.3 8,4 8,0 B9.4 8,5 7,2 H10.1 7,8 6,5 L1.1 7,2 6,0 H10.3 7,5 7,0 L1.2 5,7 5,1 H10.4 8,3 7,6 L1.3 5,7 5,2 H12A.1 8,7 6,2 TM3.1 8,8 7,3 H12A.2 7,3 6,9 H12 7,4 6,7 H12A.4 5,8 5,3 EC118 7,6 7,0 H12A.5 7,5 6,2 TN2 8,6 8,4 B1.5 8,0 6,8 TN3 7,4 6,2 B1.7 11 10,5 TN7 7,7 7,0 Kết quả nghiên cứu ở bảng 4 cho thấy hầu hết các chủng nấm men đều có khả năng lên men dịch đường trong thân cao lương. Trong đó, có 5 chủng (H12A.2, B6.2, B9.3, L1.2, L1.3) thể hiện hoạt tính lên men cao nhất (tạo được 5ml CO2 trong thời gian ngắn nhất chỉ sau từ 5,1 – 6,2 giờ nuôi cấy). Các chủng nấm men này được tuyển chọn để tiếp tục cho các thí nghiệm tiếp theo. Sau khi sàng lọc khả năng lên men của các chủng nấm men bằng bình Elgol, 5 chủng nấm men được chọn sẽ được tiến hành nuôi cấy trong các bình lên men nhằm tìm ra chủng có khả năng lên men cao nhất. 3.1.3.2. Tuyển chọn các chủng nấm men lên men mạnh bằng bình lên men Các chủng nấm men được tiếp giống với tỷ lệ 2x107 tb/ml vào các bình lên men chứa 150ml môi trường dịch chiết cây cao lương, nồng độ đường 15% Bx, pH 5,5, nhiệt độ 300C . Khả năng lên men được đánh giá bằng khối lượng CO2 sinh ra. Khối lượng CO2 được xác định bằng phương pháp đo sự giảm khối lượng của bình sau những thời gian nuôi cấy xác định (0h – 72h) cho đến khi khối lượng không đổi. Nồng độ cồn thu được sau thời gian nuôi cấy được xác định bằng chưng cất. Kết quả thể hiện ở bảng 4. Bảng 4. Khả năng lên men của các chủng nấm men tuyển chọn Thời gian (h) Lượng CO2 sinh ra (g) H12A.4 L1.2 L1.3 B6.2 B9.3 0 0 0 0 0 0 12 3,0 2,2 4,0 3,5 3,2 16 6,6 5,2 7,2 7,0 6,3 20 8,2 7,3 8,0 7,8 7,6 24 8,3 7,5 8,1 7,8 7,7 36 8,4 7,5 8,2 7,9 7,7 40 8,4 7,5 8,2 7,9 7,8 44 8,4 7,5 8,2 7,9 7,8 48 8,4 7,6 8,2 7,9 7,9 60 8,4 7,6 8,2 8,0 7,9 64 8,4 7,6 8,2 8,0 7,9 68 8,4 7,6 8,3 8,0 7,9 72 8,5 7,6 8,3 8,0 7,9 Đường sót (%Bx) 3,0 5,3 3,7 5,0 4,0 Độ cồn (% W/v) 9,0 7,0 8,0 7,5 8,0 Như vậy, hàm lượng cồn thu được của các chủng tuyển chọn tương đối cao (tất cả đều đạt nồng độ cồn trên 7) chứng tỏ các chủng này đều có năng lực lên men tốt. Trong đó, 3 chủng (H12A.4, L1.3 và B9.3) thể hiện hoạt tính lên men mạnh nhất với hàm lượng cồn 8-9%, đường sót thấp (3-4 % Bx) và thời gian thu hồi ethanol thích hợp sau 48 giờ nuôi cấy, vì sau thời gian này trọng lượng của bình gần như không đổi hoặc có giảm thì cũng không đáng kể. Trong số này, khả năng lên men của chủng H12A.4 cao nhất,(với hàm lượng cồn 9%) nên được lựa chọn để tiến hành lên men dịch cao lương. Trên thực tế, quá trình lên men chịu rất nhiều các yếu tố ảnh hưởng như mật độ tế bào, nhiệt độ, pH, nồng độ đường, nồng độ cồn, chất dinh dưỡngCác yếu tố này sẽ quyết định đến khả năng sinh ethanol hay hiệu suất của quá trình lên men. Do vậy, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu sự ảnh hưởng của các yếu tố trên đối với quá trình lên men dịch cao lương. 3.1.4. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh ethanol của nấm men 3.1.4.1 Ảnh hưởng của mật độ tế bào Mật độ tế bào nấm men trong dịch lên men là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh ethanol và hiệu suất lên men. Nếu mật độ tế bà