Luận văn Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật tạo nguyên liệu thực phẩm giàu glucosamine và protein từ cua đồng

Lấy 1 vòng sinh khối L.casei trong ống giống thạch nghiêng cho vào bình tam giác 250 ml chứa 100 ml MT3 đã hấp vô trùng, nuôi VK trong điều kiện tĩnh, nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Sau 24 giờ nuôi cấy, hút 5% thể tích MT3 đã lên men bởi L.casei cho vào 200ml dịch môi trường nuôi cấy cần khảo sát, trong điều kiện tĩnh, ở nhiệt độ phòng. Thời gian lên men là 72 giờ. Xác định lượng acid tổng tạo ra bằng phương pháp chuẩn độ với NaOH 0,1N mục 2.2.1.2 Thay đổi thành phần môi trường theo bảng sau: Bảng 2.4. Thành phần các chất bổ sung vào môi trường Môi trường Muối khoáng 1% nước mắm 350N 40% nước chiết giá MRS làm đối chứng - - - Dịch tương đậu nành+ 2%succrose - - - Dịch tương đậu nành+ 2%succrose+ khoáng + - - Dịch tương đậu nành+ 2%succrose+ 40% nước chiết giá - - + Dịch tương đậu nành+ 2%succrose+ 1% nước mắm 350N - + - Dịch tương đậu nành+ 2%succrose+ 1% nước mắm 350N+ 40% nước chiết giá - + + Dịch tương đậu nành+ 2%succrose+ khoáng+ 40% nước chiết giá + - + Dịch tương đậu nành+ 2%succrose+ khoáng+ 1% nước mắm 350N + + - Dịch tương đậu nành+ 2%succrose+ khoáng+ 1% nước mắm 350N+ 40% nước chiết giá + + + (+): có bổ sung (-): không bổ sung • Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường Dựa vào MT phù hợp đã khảo sát, bổ sung các hàm lượng đường từ 0, 2, 4, 6, 8, 10% (w/v) vào 200ml môi trường nuôi cấy. Chọn hàm lượng đường thích hợp để L.casei tổng hợp lượng acid nhiều nhất. Xác định lượng acid tổng bằng phương 43 pháp chuẩn độ với NaOH 0,1N (mục 2.2.1.2) 2.2.3.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp acid của L.casei • Thời gian nuôi cấy Dựa vào thành phần MT và hàm lượng đường bổ sung thích hợp ở các thí nghiệm trên, thu dịch tương đậu nành lên men bởi L.casei tại các thời điểm 0, 8, 16, 24, 32, 48, 56, 64, 72, 88, 96 giờ. Chọn thời gian mà L.casei tổng hợp lượng acid cao nhất. Xác định lượng acid tổng bằng phương pháp chuẩn độ với NaOH 0,1N • Nhiệt độ môi trường nuôi cấy Thu dịch tương đậu nành lên men bởi L.casei trong thời gian tốt nhất đã xác định ở thí nghiệm trên ở các nhiệt độ MT là 200C, 250C, 300C, 350C, 400C, 450C. Xác định lượng acid tổng bằng phương pháp chuẩn độ với NaOH 0,1N • pH môi trường nuôi cấy ban đầu Dựa vào thời gian và nhiệt độ tốt nhất ở thí nghiệm trên, chỉnh pH môi trường ban đầu tại các giá trị pH= 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. Xác định giá trị pH thích hợp để L.casei tổng hợp lượng acid cao nhất. Xác định lượng acid tổng bằng phương pháp chuẩn độ với NaOH 0,1N • Tỉ lệ giống L.casei ban đầu cho vào môi trường nuôi cấy Dựa vào thời gian và nhiệt độ, pH tốt nhất đã khảo sát ở thí nghiệm trên. Cho vào môi trường các tỉ lệ giống L.casei từ 1%, 3%, 5%, 7%,10%. Chọn tỉ lệ giống thích hợp tổng hợp lượng acid cao nhất. Xác định lượng acid tổng bằng phương pháp chuẩn độ với NaOH 0,1N 2.2.4. Phân tích các chỉ tiêu của nguyên liệu và sản phẩm 2.2.4.1. Xác định độ ẩm [18]  Nguyên tắc: làm bay hơi hết hơi nước trong thực phẩm. Cân thực phẩm trước và sau khi sấykhô, từ đó tính ra % nước có trong thực phẩm.  Tiến hành Cân đĩa đã được sấy khô, cân 10g mẫu đã chuẩn bị sẵn, nghiền nhỏ cho vào đĩa Petri. 44 Cho tất cả vào tủ sấy 100–105oC, sấy khô đến trọng lượng không đổi, thường khoảng 6 giờ. Sấy xong, làm nguội ở bình hút ẩm (25 – 30 phút), đem cân ở cân phân tích.  Tính kết quả Độ ẩm % X được xác định theo công thức X=(𝐺1−𝐺2)×100(𝐺1−𝐺2) Trong đó: G-trọng lượng đĩa Petri (g) G1: trọng lượng đĩa Petri và trọng lượng mẫu thử trước khi sấy (g) G2: trọng lượng đĩa Petri và trọng lượng mẫu thử sau khi sấy (g) 2.2.4.2. Xác định hàm lượng Nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl [8], [18]  Nguyên tắc: chất đạm khi đem vô cơ hóa sẽ chuyển thành dạng (NH4)2SO4. Dùng kiềm đặc NaOH đẩy amoniac ra khỏi (NH4)2SO4 (NH4)2SO4+ 2NaOH → 2NH4OH + Na2SO4 Lượng amoniac phóng thích ra được hơi nước lôi cuốn bằng 1 dụng cụ là máy Parnas- Wargner và được dẫn đến 1 bình tam giác có chứa 1 lượng thừa H2SO4 Chuẩn độ lượng H2SO4 còn thừa trong bình hứng bằng NaOH. Từ đây cho phép xác định được lượng amoniac phóng thích ra, có nghĩa là xác định được hàm lượng đạm trong mẫu nguyên liệu.  Cách tiến hành: vô cơ hóa: cân 0,1g mẫu nghiền nhỏ, 1g chất xúc tác vào ống phá mẫu và thêm 5ml dung dịch H2SO4 đậm đặc. Nối bộ thu khí, bắt đầu phá mẫu cho đến khi dung dịch trong bình trong suốt hoặc trong xanh (khoảng 2-3giờ), ngừng đun để nguội. Bổ sung 50ml nước cất, lắc đều. Chưng cất Lắp ống phá mẫu vào máy chưng cất, bổ sung 10ml NaOH đậm đặc. Khởi động quá trình chưng cất, dịch chưng cất sẽ được chuyển sang bình tam giác 250ml có chứa sẵn 10ml dung dịch H2SO4 0,01N, thêm 5 giọt metyl đỏ. Ngưng chưng cất khi dịch chưng cất không còn NH3 (thử bằng giấy đo pH). Chuẩn độ lượng thừa H2SO4 bằng NaOH 0,01N. Ngưng chuẩn độ khi dung dịch chuyển từ đỏ sang vàng nhạt 45  Tính kết quả Gọi V0 là trị số trung bình của 2 lần thử không (thay mẫu bằng nước cất) Vt là trị số trung bình của 3 lần thử thật ΔV= V0-Vt là lượng NaOH tương ứng với NH3 phóng thích bởi 10ml dung dịch đạm đã được vô cơ hóa và pha loãng Nếu nguyên liệu là chất rắn: %N (hay của N/100g mẫu) = (14 x ΔV x X x10-4 x100)/m Nếu nguyên liệu là chất lỏng: gN/l = (14 x ΔV x X x 10-4 x 1000)/Vmẫu Trong đó: m- trọng lượng mẫu đem vô cơ hóa (g) Vmẫu- thể tích mẫu đem vô cơ hóa 2.2.4.3. Xác định hàm lượng Nitơ formol (Nformol) theo phương pháp Sorensen [8]  Nguyên tắc: khi cho các phân tử phi protein tác dụng với formol, sẽ tác dụng lên nhóm –NH2 để tạo thành phức chất metylen (-N=NH2). Do vậy, sản phẩm là hợp chất metylen và 1 nhóm chức –COOH tự do hoặc HCl có tính acid, có thể định lượng bằng NaOH với phenolphtalein làm chỉ thị màu, từ lượng NaOH chuẩn độ cho phép xác định 1 cách gián tiếp được lượng Nformol  Cách tiến hành Trung hòa formol ½ : lấy 50ml formol ½ thêm vào vài giọt phenolphatalein 3%, cho NaOH 0.1N từng giọt tới khi dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt, ta được formol trung hòa ½ Hút 10ml dung dịch nguyên liệu đã pha loãng 20 lần, thêm vào 10ml dung dịch formol ½ đã trung hòa và vài giọt phenolphatalein 3%, lắc đều để phản ứng xảy ra hoàn toàn, sau đó định lượng bẳng NaOH 0,1N cho đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng. Thực hiện 3 lần thử thật và 3 lần thử không  Tính kết quả Số g Nformol có trong 1 lít nguyên liệu X =(0,0014 xΔVx X x 1000x20)/10 (g/l) 46 Trong đó V0: thể tích dung dịch NaOH 0,1N trung bình của 3 lần thử không Vt : thể tích dung dịch NaOH 0,1N trung bình của 3 lần thử thật ΔV= Vt – Vo: Lượng NaOH cần để trung hòa nhóm –COOH. 20: độ pha loãng của dịch thủy phân 10: thể tích dịch thủy phân đã pha loãng để xác định (ml) 0,0014: số gam Nitơ tương ứng với 1ml dung dịch NaOH 0,1N 1000: hệ số tính ra g/l 2.2.4.4. Xác định hàm lượng nitơ amoniac (Namoniac) theo phương pháp chưng cất [8]  Nguyên tắc: trong nguyên liệu chứa đạm thường có 1 loại đạm ở dạng vô cơ (muối amonium hay những amin dễ bay hơi). Đây là dạng đạm tạo thành do sự phân hủy của protein (bị lên men thối hoặc quá trình khử carboxyl). Những loại đạm này thường có tính kiềm yếu, vì vậy khi cho tác dụng với MgO sẽ bị đuổi ra khỏi dung dịch, do đó chúng sẽ được lôi cuốn theo hơi nước qua 1 bình đựng lượng thừa acid. Sau đó đem định lượng acid dư, suy ra xác định được loại đạm này. 2(NH4)+ + Mg(OH)2 → 2NH3+2H2O+Mg2+ 2NH3+ H2SO4 → (NH4)2SO4  Cách tiến hành Lấy 50ml nguyên liệu đã pha loãng 20 lần cho vào trong bình cầu Thêm vào bình cầu 20ml nước cất, vài giọt phenolphtalein và bột MgO đến khi dung dịch trong bình có màu hồng nhạt Đậy nút ngay tránh khí amoniac bay ra, lắc đều, đun sôi và hơi nước được chưng cất sang 1 bình tam giác có chứa sẵn H2SO4 0,1N; thêm thuốc thử Tashino. Đầu nhọn của ống sinh hàn nhúng chìm trong dung dịch H2SO4 0,1N. Chưng cất trong 15- 20 phút kể từ khi dung dịch trong bình bắt đầu sôi. Sau 15- 20 phút, chất đạm amoniac sẽ được hấp thụ vào dung dịch H2SO4. 47 Định phân lượng lượng acid dư bằng NaOH 0,1N cho đến khi dung dịch chuyển từ màu đỏ sang vàng. Thực hiện 3 lần thử thật và 3 lần thử không.  Tính kết quả Số g Namoniac có trong 100g mẫu X=ΔV x 0,0014 x100 (g/100g) Trong đó V0: thể tích dung dịch NaOH 0,1N trung bình của 3 lần thử không (ml) ΔV=V0 – Vt: lượng NaOH tương đương với lượng đạm phóng thích đã được hấp thụ trong H2SO4 Vt: thể tích dung dịch NaOH trung bình của 3 lần thử thật (ml) 2.2.4.5. Xác định hàm lượng calci [8]  Nguyên tắc: dùng EDTA xác định calci trong dung dịch với chỉ thị murexid (C8H5O6N5) trong môi trường có pH 12. Kí hiệu chất chỉ thị murexid là H3I trong môi trường pH 12 H3I có màu tím khi kết hợp với calci tạo thành chất phức tạp có màu hồng. H3I (tím) + Ca2+ CaH3I ( hồng) Chất phức hợp của Ca2+với murexid không bền bằng phức chất tạo bởi Ca2+ và EDTA. Vì vậy EDTA bị đẩy ra khỏi chất phức tạp dưới dạng tự do có màu tím. CaH3I + H2Y2- (hồng) CaY2- (tím) + H3I- + 2H+ Hóa chất Dung dịch NaOH 10% Dung dịch KCN 3% Chỉ thị murexid: cân 0,1g murexid + 50g NaCl tinh khiết.Nghiền nhuyễn bằng cối, cho vào chai thủy tinh có nắp đậy kín. Dung dịch EDTA 0,02N Xử lý mẫu: cua rửa sạch, hấp chín, xay, tách lấy vỏ, rửa sạch. Sấy khô, đặt vào bình hút ẩm. Cân mẫu, hòa tan mẫu bằng HCl đậm đặc, định mức 100ml. Hút 10ml mẫu đã xử lý, cho vào bình tam giác 100ml. Thêm 2-4ml dung dịch NaOH 10% cho đến khi đạt pH 12 – 13, nhỏ 5 giọt KCN 3% và khoảng nửa hạt gạo 48 chỉ thị murexid. Chuẩn độ bằng EDTA 0,02N cho đến khi màu hồng của dung dịch chuyển sang màu tím, cần thực hiện song song thí nghiệm đối chứng (thay mẫu bằng nước cất). • Xác định hàm lượng calci trong 100g mẫu khô Lượng calci trong 100g mẫu khô tính bằng công thức m=𝑣×𝐶×20,04×100 𝑎 Trong đó: m: hàm lượng calci tính bằng mg v: thể tích EDTA dùng để chuẩn độ C: độ nguyên chuẩn của EDTA 20,04: đương lượng của calci a: trọng lượng mẫu khô tương đương với thể tích mẫu lấy đi chuẩn độ • Xác định hàm lượng calci hòa tan (Ca2+ ) trong dịch lên men Hút 1ml dịch lên men đã ly tâm, thêm 20ml nước cất, cho vào bình tam giác 100ml. Thêm 2ml dung dịch NaOH 10%, 5 giọt KCN 3% và khoảng nửa hạt gạo chỉ thị murexid. Chuẩn độ bằng EDTA 0,02N cho đến khi màu hồng của dung dịch chuyển sang màu tím, cần thực hiện song song một thử không.  Tính kết quả Hàm lượng (g/l) Ca2+ trong mẫu:CCa2+ = 𝐶×𝑣×20,04 𝑉 Trong đó: CCa2+ hàm lượng calci hòa tan g/l V: thể tích dung dịch mẫu lấy đi chuẩn độ v: thể tích EDTA dùng để chuẩn độ C: độ nguyên chuẩn của EDTA 20,04: đương lượng của calci 2.2.4.6. Xác định hàm lượng glucosamine tạo thành (phương pháp Elson- Morgan) [8]  Nguyên tắc: phương pháp này dựa trên sự hình thành các dẫn xuất pyrrol khi glucosamine được đun nóng trong thuốc thử acetyl aceton. Những pyrrol này sẽ cho phản ứng màu khi tác dụng với thuốc thử Erlich. 49  Tiến hành Dựng đường chuẩn glucosamine như mục 2.2.2.1. Từ đường chuẩn glucosamine sẽ cho biết được mối tương qua giữa nồng độ glucosamine trong đường chuẩn và giá trị OD đo được. Suy ra hàm lượng glucosamine Chọn các ống nghiệm có cùng kích cỡ và độ dày Cho vào ống nghiệm 1ml dịch thí nghiệm,1 ml thuốc thử aceton Lắc đều, đun cách thủy ở 1000C trong 1 giờ, làm lạnh dưới dòng nước. Thêm 1ml thuốc thử Erlich, lắc đều, đun cách thủy 700C, để nguội, đo OD ở λ=512nm 2.2.4.7. Phương pháp kiểm tra an toàn vệ sinh thực phẩm Gửi mẫu nguyên liệu đã xử lý bằng phức hệ vi sinh vật đến Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm TP. Hồ Chí Minh 2.2.4.8. Phương pháp xử lý số liệu Kết quả thí nghiệm được lặp 3 lần và sử dụng các công thức tính toán ± sai số có trong chương trình Excel 2007. 50 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Kết quả quan sát hình thái, đặc điểm sinh học của các vi sinh vật 3.1.1. Bacillus amyloliquefaciens 3.1.1.1. Hình thái Hình 3.1a. Hình thái đại thể Hình 3.1b. Hình thái vi thể (X100) Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái B.amyloliquefaciens Hình dạng khuẩn lạc To, bám chắc vào mặt thạch, bề mặt nhăn, khô, màu trắng đục. Hình dạng tế bào Hình que, đứng riêng rẽ Kích thước tế bào ~1- 1,5 x 0,5µm Nhuộm gram Gram (+) 3.1.1.2. Đặc điểm sinh học Khả năng phân giải casein Hình 3.2. Vòng phân giải casein của B.amyloliquefaciens Protease do B.amyloliquefaciens tiết ra, phân giải casein thành các polypeptide không bắt màu với thuốc thử. Do đó tạo vòng phân giải trong suốt quanh lỗ thạch. 51 3.1.2. Lactobacillus casei 3.1.2.1. Hình thái Hình 3.3a. Hình thái đại thể L.casei Hình 3.3b. Hình thái vi thể L.casei (X100) Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái L.casei Hình dạng khuẩn lạc Tròn, bóng, mép phẳng, màu trắng đục Hình dạng tế bào Hình que, đứng riêng rẽ Kích thước tế bào ~1 x 0,5µm Nhuộm Gram Gram (+) 3.1.2.2. Đặc điểm sinh học Khả năng làm đông tụ sữa (+): có hiện tượng đông tụ sữa khi cấy L.casei vào MT sữa đậu nành sau 24 giờ (-): sữa đậu nành hấp tiệt trùng không cấy L.casei Hình 3.4. Khả năng làm đông tụ sữa của L.casei + -- 52 Kết quả định tính acid tạo ra bởi L.casei Ống 1: 3ml MT +1 ml thuốc thử Ufermen Ống 2:3ml dịch lên men+1ml thuốc thử Ufermen Ống 3: 3ml acid lactic 98%+1ml thuốc thử Ufermen Hình 3.5. Khả năng làm đổi màu thuốc thử Ufermen của L.casei 3.1.3. Aspergillus niger 3.1.3.1. Hình thái Hình 3.6a. Hình thái đại thể Hình 3.6b. Hình thái vi thể (X60) Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái A.niger Hình dạng đại thể Khuẩn lạc tròn, màu trắng. Bào tử khi còn non có màu trắng, về già chuyển sang màu đen Hình dạng vi thể Khối bào tử trần, hình tia tỏa tròn. Cuống sinh bào tử không phân nhánh, đầu phình to thành bọng ngắn. 3.1.3.2. Đặc điểm sinh học Khả năng phân giải huyền phù chitin 1 2 3 Hình 3.7. Vòng phân giải huyền phù chitin Chitinase do A.niger sinh ra có khả năng phân giải chitin huyền phù. khi nhỏ thuốc thử Lugol vào, phần chưa bị phân giải tạo màu nâu đỏ, phần bị phân giải tạo vòng tròn vô sắc quanh lỗ 53 3.2. Kết quả định lượng hệ enzyme của các vi sinh vật 3.2.1. Kết quả khảo sát hoạt độ chitinase của A.niger theo thời gian nuôi cấy Thí nghiệm được tiến hành với mục đích xác định thời gian để thu chitinase có hoạt độ cao nhất, tại các thời điểm 24 giờ, 32 giờ, 40 giờ, 48 giờ, 56 giờ, 64 giờ, 72 giờ với điều kiện nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, thể tích canh trường nuôi cấy là 100ml MT1/bình tam giác 250ml, lắc 150 vòng/phút. Pha loãng dịch enzyme 10 lần trước khi xác định hoạt độ, hoạt độ chitinase được xác định theo mục 2.2.2.1. Kết quả được trình bày ở bảng 3.4 Bảng 3.4. Hoạt độ chitinase của A.niger theo thời gian Thời gian nuôi cấy (giờ) ΔOD Lượng glucosamine tạo thành (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/ml MT) 24 0,012 3,523 0,18±0,047 32 0,021 6,166 0,31±0,045 40 0,028 8,221 0,41±0,044 48 0,039 11,451 0,55±0,060 56 0,043 12,626 0,63±0,059 64 0,030 8,808 0,45±0,047 72 0,022 6,460 0,33±0,029 Đồ thị 3.1. Hoạt độ chitinase của A.niger theo thời gian nuôi cấy 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 24 32 40 48 56 64 72 H oạ t đ ộ ch it in as e (U I/ m l M T) Thời gian (giờ) 54 Qua bảng 3.4 và đồ thị 3.1 cho thấy hoạt độ chitinase của A.niger từ 24 giờ nuôi cấy có sự thay đổi rõ rệt, tăng cao nhất ở 56 giờ nuôi cấy đạt 0,63 (UI/mlMT) sau đó hoạt độ giảm dần theo thời gian. Hoạt tính enzyme mạnh nhất ở thời điểm bào tử mới bắt đầu hình thành (Lượng, 2006). Kết quả này cho thấy với mỗiloài VSV có giới hạn thời gian thích hợp để sinh tổng hợp enzyme. Ví dụ: kết quả của Lê Thị Huệ (2010) [17] khi nghiên cứu về chủng Aspegillus sp. sinh chitinase có hoạt độ cao nhất khi nuôi cấy 72 giờ. Tuy nhiên lại khác với kết quả của Brazeinska MS (2012) [40] khi nghiên cứu về chủng A.niger LOCK 62 tổng hợp chitinase đạt hoạt độ cao nhất khi nuôi cấy ở 144 giờ. Chọn thời gian thích hợp để A.niger tổng hợp chitinase là 56 giờ để bố trí các thí nghiệm tiếp theo. 3.2.2. Kết quả khảo sát hoạt độ chitinase của A.niger theo nhiệt độ môi trường Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến khả năng tổng hợp enzyme của VSV, nhiệt độ quá cao hay quá thấp sẽ làm giảm hiệu suất tổng hợp enzyme. Do đó, tiến hành thí nghiệm xác định nhiệt độ phù hợp nhất để A.niger tổng hợp chitinase có hoạt độ cao nhất. Chuẩn bị 100ml MT1/bình tam giác 250ml, đặt ở các nhiệt độ 200C. 250C, 300C, 350C, 400C, 450C, lắc 150 vòng/phút. Thu dịch enzyme thô dựa vào thời gian tốt nhất đã khảo sát ở mục 3.2.1 là 56 giờ. Xác định hoạt độ chitinase theo phương pháp ở mục 2.2.2.1, kết quả được trình bày ở bảng 3.5 Bảng 3.5. Hoạt độ chitinase của A.niger theo nhiệt độ môi trường Nhiệt độ (0C) ΔOD Lượng glucosamine tạo thành (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/ml MT) 20 0,023 6,851 0,34±0,065 25 0,034 10,08 0,50±0,088 30 0,048 14,094 0,71±0,090 35 0,045 13,311 0,67±0,103 40 0,031 8,613 0,43±0,104 45 0,019 5,579 0,28±0,096 55 Đồ thị 3.2. Sự biến thiên hoạt độ chitinase theo nhiệt độ môi trường Kết quả ở bảng 3.5 và đồ thị 3.2 cho thấy khoảng nhiệt độ thích hợp để A.niger tổng hợp chitinase có hoạt độ cao nhất là từ 250C đến 350C và tốt nhất là ở nhiệt độ 300C với hoạt độ 0,71 UI/ml MT. Theo Ramesh và Lonsane (1987) chỉ ra rằng nhiệt độ nuôi cấy là một đặc trưng của cơ thể sinh vật và có ảnh hưởng sâu sắc đến sản lượng và thời gian của pha tổng hợp enzyme [13]. Kết quả nàycũng tương đồng với nghiên cứu của Mohamed A. và cộng sự (1992) [57] khi khảo sát nhiệt độ MT nuôi cấy tổng hợp chitinase ở chủng Aspergillus carneus thích hợp nhất ở 300C. Chọn nhiệt độ MT là 300C để nuôi cấy A.niger và bố trí các thí nghiệm tiếp theo. 3.2.3. Kết quả khảo sát hoạt độ chitinase của A.niger theo pH môi trường pH môi trường có ảnh hưởng quan trọng đến sinh trưởng, trao đổi chất của VSV. Nồng độ ion H+ hay OH- ảnh hưởng trực tiếp lên tế bào hoặc ảnh hưởng gián tiếp do làm thay đổi độ phân ly của các chất trong môi trường, thay đổi pH sẽ ảnh hưởng quan trọng đến hoạt tính enzyme. Vì vậy, tiến hành khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu ở các giá trị 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 nhằm xác định giá trị pH tốt nhất để tổng hợp chitinase với điều kiện nuôi cấy là thời gian 56 giờ và nhiệt độ là 300C, lắc 150 vòng/ phút, dịch ezyme được pha loãng 10 lần trước khi xác định hoạt độ. Hoạt độ chitinase được xác định theo phương pháp ở mục 2.2.2.1. Kết quả được trình bày ở bảng 3.6. 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 20 25 30 35 40 45 H oạ t đ ộ ch it in as e (U I/ m l M T) Nhiệt độ (ºC) 56 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 2 3 4 5 6 7 8 H oạ t độ c hi ti na se (U I/m lM T) pH môi trường Bảng 3.6. Hoạt độ chitinase của A.niger theo pH môi trường pH môi trường Δ OD Lượng glucosamine tạo thành (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/ml MT) 2,0 0,027 7,928 0,40±0,088 3,0 0,034 9,983 0,49±0,110 4,0 0,046 13,506 0,68±0,134 5,0 0,054 15,855 0,79±0,067 6,0 0,042 12,332 0,61±0,088 7,0 0,024 7,047 0,35±0,110 8,0 0,009 2,643 0,13±0,104 Đồ thị 3.3. Biến thiên hoạt độ chitinase của A.niger theo pH môi trường Kết quả ở bảng 3.6 và đồ thị 3.3 cho thấy hoạt độ chitinase do A.niger sinh ra tăng mạnh từ pH môi trường = 4,0 đến pH môi trường = 6,0 và đạt hoạt độ cao nhất tại pH môi trường = 5,0. Khi pH môi trườngngả về kiềm tính thì hoạt độ enzyme chitinase của A.niger giảm mạnh. Điều này phù hợp với quan điểm của Ingold (1967) [68] cho rằng pH tối ưu cho nấm sợi sinh enzyme là từ 4,0- 6,5 và các nghiên cứu của Hashimoto (2005) [46] về pH môi trường thích hợp nhất cho A.niger sinh trưởng và phát triển tốt ở pH từ 4,5-4,8; nghiên cứu của Nguyễn Thị 57 Hà (2011) [13] về khả năng sinh tổng hợp chitinase của chủng Aspergillus protuberus tốt nhất ở pH môi trường = 5,5 Do đó, pH môi trường = 5,0 được chọn để nuôi cấy A.niger và bố trí các thí nghiệm tiếp theo. 3.2.4. Kết quả khảo sát hoạt độ chitinase theo nồng độ chất cảm ứng Tiến hành thí nghiệm với mục đích xác định nồng độ chất cảm ứng phù hợp để A.niger sinh tổng hợp chitinase có hoạt độ cao nhất. Quá trình nuôi cấy dựa vào điều kiện đã xác định ở mục 3.2.1, 3.2.2 và 3.2.3 là thời gian 56 giờ, nhiệt độ 300C và pH môi trường là 5,0; lắc 150 vòng/phút, thu được kết quả được trình bày trong bảng 3.7 Bảng 3.7. Hoạt độ chitinase của A.niger theo nồng độ chất cảm ứng Nồng độ chất cảm ứng (%) Δ OD Lượng glucosamine tạo thành (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/ml MT) 0,00 0,007 2,153 0,11±0,081 0,25 0,033 9,592 0,48±0,066 0,50 0,061 19,281 0,95±0,108 0,75 0,052 15,268 0,76±0,082 1,00 0,048 13,996 0,70±0,096 1,25 0,035 10,179 0,51±0,106 1,50 0,023 6,655 0,33±0,061 Đồ thị 3.4. Biến thiênhoạt độ chitinase của A.niger theo nồng độ chất cảm ứng Không có mặt chất cảm ứng trong MT nuôi cấy thì A.niger vẫn có khả năng tổng hợp được chitinase, nhưng hoạt độ rất thấp. Điều này chứng tỏ chitinase vừa là 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0 0.25 0.5 0.75 1 1.25 1.5 H oạ t đ ộ ch it in as e U I/ m l M T) Nồng độ chất cảm ứng (%) 58 enzyme cấu trúc vừa là enzyme cảm ứng. Theo kết quả thí nghiệm (bảng 3.7 và đồ thị 3.4) nhận thấy hoạt độ chitinase tăng dần khi bổ sung chất cảm ứng và đạt hoạt độ cao nhất tại nồng độ 0,5%. Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của Lê Thị Huệ (2010) [17], Nguyễn Thị Hà (2011) [13] khi bổ sung chất cảm ứng chitin vào MT nuôi cấy các chủng nấm Aspergillus awamori, Aspergillus protuberus thì hoạt độ chitinase của các chủng nấm này sinh ra đều tăng so với khi không bổ sung chất cảm ứng. 3.2.5. Kết quả khảo sát hoạt độ protease của B.amyloliquefaciens theo thời gian nuôi cấy Thí nghiệm tiến hành với mục đích xác định thời gian thích hợp để B.amyloliquefaciens tổng hợp protease với hoạt độ cao nhất vì thời gian nuôi cấy quá dài có thể làm giảm hoạt tính enzyme của VSV. Tiến hành thí nghiệm ở điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ phòng, thể tích canh trường nuôi cấy là 50ml MT6/bình tam giác 250ml, tốc độ lắc 150 vòng/phút. Hoạt độ protease được xác định theo phương pháp Anson cải tiến (mục 2.2.2.3) và được trình bày ở bảng 3.8 Bảng 3.8. Hoạt độ protease của B.amyloliquefaciens theo thời gian nuôi cấy Thời gian nuôi cấy (giờ) ΔOD Lượng tyrosin tạo thành (µg/ml) Hoạt độ protease (UI/ml MT) 0 0,004 0,003 0,01±0,006 4 0,008 0,005 0,02±0,008 8 0,020 0,014 0,05±0,006 12 0,054 0,036 0,13±0,026 16 0,077 0,052 0,19±0,024 20 0,145 0,097 0,36±0,023 24 0,180 0,120 0,44±0,028 28 0,244 0,164 0,60±0,031 32 0,336 0,225 0,82±0,030 36 0,425 0,285 1,05±0,017 40 0,539 0,361 1,32±0,031 44 0,687 0,460 1,69±0,022 48 0,645 0,433 1,59±0,025 52 0,517 0,347 1,27±0,013 59 Đồ thị 3.5. Biến thiên hoạt độ protease của B.amyloliquefaciens theo thời gian Dựa vào bảng 3.8 và đồ thị 3.5 nhận thấy hoạt độ protease tạo ra bởi B.amyloliquefaciens tăng nhanh trong khoảng thời gian từ 36 giờ đến 48 giờ và đạt cực đại tại thời điểm 44 giờ (1,69 UI/ml MT). Kết quả này gần phù hợp với nghiên cứu của Srividya (2012) [69] khi nghiên cứu về chủng Bacillus sp. sinh tổng hợp protease có hoạt độ tăng cao từ 24- 48 giờ và đạt hoạt độ cao nhất tại thời điểm 48 giờ. Đồng thời, theo quan điểm của Schaeffer (1969) và Sharipova et al. (2000) [63] cho rằng hầu hết các loài VK Bacillus sinh trưởng ổn định từ 28 giờ đến 48 giờ nên trong giai đoạn này, các hoạt tính sinh học của tế bào VK được thể hiện rõ rệt nhất. Chọn thời gian nuôi cấy B.amyloliquefaciens sinh protease có hoạt độ cao nhất là thời điểm 44 giờ để tiến hành thí nghiệm tiếp theo. 3.2.6. Kết quả khảo sát hoạt độ protease của B.amyloliquefaciens theo nhiệt độ môi trường Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzyme của VSV. Nhiều nghiên cứu cho thấy nhờ khả năng hình thành bào tử mà các VK Bacillus có thể sinh trưởng ở giới hạn nhiệt độ khá rộng, hầu hết các VK nhóm này là loài ưa ấm với nhiệt độ môi trường từ 200C- 450C. Nhằm xác định nhiệt độ thích hợp cho B.amyloliquefaciens sinh trưởng và tổng hợp protease với hoạt độ cao nhất, 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 H oạ t đ ộ pr ot ea se (U I/ m l M T) Thời gian (giờ) 60 tiến hành chuẩn bị 50ml MT6/bình tam giác 250ml, đặt ở các nhiệt độ 200C, 250C, 300C, 350C, 400C, 450C, lắc 150 vòng/phút. Thu dịch chiết enzyme dựa vào thời gian tốt nhất đã khảo sát ở mục 3.2.3 là 44 giờ. Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến ở mục 2.2.2.3, kết quả được trình bày ở bảng 3.9 Bảng 3.9. Hoạt độ protease theo nhiệt độ môi trường Nhiệt độ (0C) ΔOD Lượng tyrosin tạo thành (µg/ml) Hoạt độ protease (UI/ml MT) 20 0,443 0,297 1,09±0,025 25 0,547 0,366 1,34±0,038 30 0,664 0,445 1,63±0,031 35