Luận văn Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của loài hải miên petrosia nigrican

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục các chữ viết tắt

Danh mục các bảng và hình vẽ

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3

1.1. TỔNG QUAN CHUNG VỀ HẢI MIÊN 3

1.1.1. Vài nét về Hải miên (Petrosia) 3

1.1.2. Giới thiệu về loài Hải miên Petrosia nigricans 4

1.1.3. Mô tả về loài Hải miên Petrosia nigricans 5

1.1.4. Vài nét về sự phân bố Hải miên trong tự nhiên 6

1.1.5. Sơ lược về thành phần hóa học của Hải miên 7

1.1.6. Tác dụng dược lý của loài Hải miên Petrosia nigricans 14

1.1.7 Tổng quan về lớp chất Sterol 14

1.1.7.1. Giới thiệu về lớp chất Sterol 17

1.1.7.2. Một số Sterol quan trọng 21

1.2. HOẠT TÍNH CỦA MỘT SỐ LOÀI HẢI MIÊN 24

CHƯƠNG 2. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1. Tổng quan chung về phương pháp chiết 26

2.1.1. Đặc điểm chung của chiết 26

pdf84 trang | Chia sẻ: honganh20 | Ngày: 25/02/2022 | Lượt xem: 466 | Lượt tải: 0download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận văn Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của loài hải miên petrosia nigrican, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
xit béo tạo ceton; ở cơ dị hóa 21 protein sinh amino axit, tăng đào thải nitơ theo nước tiểu; ở gan , tăng đồng hóa và thu nhận amino axit. • Aldosteron O OHO HO O Aldosteron là hocmon tuyến thượng thận, nó có tác dụng làm tăng tái hấp thu Na+ ở ống lượn xa, đoạn lên quai Henlé và ống góp, đồng thời còn trao đổi K+ ở ống lượn xa do đó làm tăng thể tích và áp suất máu trong cơ thể. Aldosteron đóng vai trò như là một enzym kích thích quá trình sản sinh andosteron từ vỏ thượng thận. 1.1.7.2. Một số Sterol quan trọng Các sterol có cấu trúc từ 27 - 29 nguyên tử C, thuộc nguồn gốc động vật (cholesterol) hoặc thực vật (phytosterol, β - sitosterol, ergosterol, stigmasterol). a. Cholesterol A B C D 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 HO 21 26 27 20 22 23 24 25 Cholesterol là sterol được biết đến đầu tiên. Nó là thành phần chính của sỏi mật và đã được phân lập từ nguồn này bởi Conradi vào năm 1775. Tên gọi 22 cũng có nguồn gốc từ nguồn này (Tên Hy lạp cholesterin = mật rắn) (Sơvron, 1815). Cholesterol là thành phần quan trọng của màng tế bào, nó giúp tính lỏng của màng ổn định trong khoảng dao động nhiệt độ rộng hơn. Nhóm hydroxyl trên phân tử tương tác với đầu phosphate của màng còn gốc steroid và chuỗi hydrocarbon gắn sâu vào màng. Nó là tiền chất chính để tổng hợp vitamin D, nhiều loại hormone steroid, bao gồm cortisol, cortisone, và aldosterone ở tuyến thượng thận, và các hormone sinh dục progesterone, estrogen, và testosterone. Các nghiên cứu gần đây cho thấy cholesterol có vai trò quan trọng đối với các synapse ở não cũng như hệ miễn dịch, bao gồm việc chống ung thư. b. β – Sitosterol HO CH2 H3C β-Sitosterol còn gọi là: 3β-stigmast-5-en-3-ol, α-dihydrofucosterol, cinchol, cupreol, rhamnol, quebrachol và sitosterin. β-Sitosterol là dẫn xuất dihidro của stigmasterol, có một mạch nhánh no. Nó được thu nhận, cùng với các phytosterol khác, với lượng lớn dưới dạng sản phẩm phụ từ sự xà phòng hóa dầu đậu nành, một phần được sử dụng làm nguyên liệu đầu để điều chế các steroit hocmon như oestron. Sitosterol được dùng để điều trị chứng phì đại (phình to) tuyến tiền liệt. Ngày nay người ta dùng β-stitosterol của ngũ cốc là chất phòng xơ cứng động mạch, làm chất mềm thành mạch, một mặt nó phòng sự hấp thụ 23 cholesterol ở ruột bằng cách tạo ra một phức chất không tan, mặt khác nó còn có tác dụng trị xơ mỡ động mạch nhờ có đặc tính chống ôxy hóa. c. Ergosterol HO H3C CH3 CH3 CH3 Ergosterol còn gọi là (22E)-(24R)-24-metylcholesta-5,7,22-trien-3β-ol, được Tanret tìm ra vào năm 1889 trong cựu lõa mạch, lại được tìm thấy ở men bia và nhiều mốc - nó tạo thành các tinh thể hình kim bóng, điểm nóng chảy 1680C (4410K) và là quang hoạt. Nó có ba nối đôi, hai trong số đó ở trong vòng B là liên hợp, và nối đôi thứ ba ở mạch nhánh giữa các nguyên tử cacbon 22 và 23. Có một nhóm metyl gắn với C-24. Cấu tạo của mạch nhánh đã được xác định bởi sự thủy phân ozonit, mà isopropyl-metylaxetandehit (2,3-dimetylbutanal) đã được phân lập như là một sản phẩm phân cắt. Bằng cách chiếu tia tử ngoại, nó biến thành canxiferol hoặc vitamin D2 có tác dụng trị còi xương. d. Sigmasterol HO Sigmasterol còn gọi là (22)-24(S)-24-etylcholesta-5,22-dien-3β-ol, C29H47OH, xuất hiện trong đậu nành và chỉ phân biệt với cholesterol bởi mạch 24 nhánh của nó. Giống như ergosterol nó có một nối đôi giữa các nguyên tử cacbon 22 và 23. Trong khi ergosterol có một nhóm thế metyl ở C-24, ở stigmasterol có một nhóm etyl. Điều đó dẫn đến sản phẩm phân cắt ozonit từ stigmasterol có một nhóm etyl. Điều đó dẫn đến sản phẩm phân cắt ozonit từ stigmasterol là etyl-isopropyl-axetandehit (2-etyl-3-metylbutanal). Stigmasterol là nguồn nguyên liệu để tổng hợp hocmon và chúng ta đã nói đến việc sử dụng với khối lượng lớn. Vài genin của saponozit có nhân sterol (hecogenin, diosgeni) được dùng để bán tổng hợp các hocmon sinh dục và vỏ thượng thận. 1.2. HOẠT TÍNH CỦA MỘT SỐ LOÀI HẢI MIÊN THUỘC CHI PETROSIA Theo một số tài liệu đã được công bố trên thế giới, các chất phân lập được từ các loài thuộc chi Petrosia có những hoạt tính sinh học rất thú vị. Cụ thể như sau: Từ loài Hải miên Xestospongia testudinaria đã phân lập các hợp chất axit béo không no bị brôm hóa. Các hợp chất này thể hiện nhiều hoạt tính quí báu như: kháng vi sinh vật, gây độc tế bào, một số hợp chất còn ức chế enzim HIV protease, một enzim thiết yếu cho sự tái bản của HIV. [3] Từ loài Gellius viarius phân lập được hợp chất 5,8-epidioxycholest-6en- 3-ol thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đối với cả ba dòng tế bào ung thư gan bao gồm: tế bào ung thư biểu mô, tế bào ung thư màng tử cung và tế bào ung thư gan. [4] Từ loài Haliclona sp. phân lập được Maleimide-5-oxime nortetillapyrone thể hiện hoạt tính kháng lại một số chủng vi khuẩn như Candida albicans, C. glabata, C.dubliniensis, C.tropicalis, C.krusei, C.parapsilosis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, A.flavus, A.Niger, Microsporum gypseum, 25 M.canis, Trichophyton mentagrophytes, T.rubrum và Epidermophyton floccosum. [25] Từ loài Petrosia sp., các nhà khoa học đã phân lập các hợp chất là acetylenic enol ete của Glycerol và chúng thể hiện hoạt tính gây độc với tế bào gây nên bệnh bạch huyết cầu ở người.[17] Từ loài Petrosia corticata,phân lập ra được hợp chất Strongylophorine- 26, chất này thể hiện hoạt tính ức chế sự lan rộng và phát triển của các tế bào ung thư.[5] Từ loài Petrosia similis đã phân lập được hợp chất isoquinolinequinone có khả năng kháng lại một số chủng vi khuẩn như Staphylococus aureus (14 mm), Bacillus subtilis (16 mm), Escherichia coli (12 mm), Klebsiella pneumoniae ( 12 mm) ở nồng độ 100 µg/ đĩa đường kính 6,5 mm. [11] Hầu hết các chất phân lập từ các loài thuộc chi Petrosia đều có khả năng ức chế sự phát triển của các loại vi khuẩn, virut, kháng nấm, chống ung thư... [3,4,6,7,13,16]. Tuy nhiên, hiện nay vẫn chưa có công trình khoa học nào công bố về hoạt tính sinh học của loài Petrosia nigricans. 26 CHƯƠNG 2. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. TỔNG QUAN CHUNG VỀ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT [1, 5] 2.1.1. Đặc điểm chung của chiết - Khái niệm: Chiết là quá trình tách và phân ly các chất dựa vào quá trình chuyển một chất hoà tan trong một pha lỏng vào một pha lỏng khác không hoà lẫn với nó. - Mục đích chiết: • Chuyển một lượng nhỏ chất nghiên cứu trong một thể tích lớn dung môi này vào một thể tích nhỏ dung môi khác nhằm nâng cao nồng độ của chất cần nghiên cứu và gọi là chiết làm giàu. • Phương pháp chiết pha rắn để tách hay phân ly các chất trong một hỗn hợp phức tạp với điều kiện chiết thích hợp, thường dùng trong phân ly các hợp chất thiên nhiên. 2.1.2. Cơ sở của quá trình chiết. Dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất trong hai pha lỏng không hoà lẫn với nhau. Sự phân bố khác nhau là do tính tan khác nhau của các chất trong các pha lỏng. Quá trình chiết dựa trên định luật Nerst: KA = CA/ CB. trong đó: • KA là hằng số phân bố. • CA, CB là nồng độ các chất hoà tan trong chất lỏng A, chất lỏng B không tan lẫn vào nhau. 27 2.1.3. Quá trình chiết động, thực vật. 2.1.3.1. Chọn dung môi chiết. Thường thì các chất chuyển hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực khác nhau, dung môi dùng cho các quá trình chiết phải được lựa chọn rất cẩn thận. Nó cần hoà tan tốt những chất đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, không độc, không dễ bốc cháy, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), những dung môi này cần được chưng cất trước khi sử dụng vì nếu lẫn các chất khác sẽ làm ảnh hưởng đến hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết. Một số chất dẻo lẫn trong dung môi như diankylphtalat, tri-n-butyl-axetylcitrat, tributylphotphat do trong quá trình sản xuất hay bảo quản, sẽ làm sai lệch kết quả phân lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật. Cloroform, metylen clorid và metanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình chiết sơ bộ một số bộ phận của cây như lá, thân, rễ, hoa Metanol và etanol 80% là những dung môi phân cực hơn các hydrocacbon thế clo, người ta cho rằng dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được triệt để hơn các thành phần có trong tế bào. Ngược lại, khả năng phân cực của cloroform thấp hơn, có thể rửa các chất nằm ngoài tế bào. Các ancol hoà tan phần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp, vì vậy khi chiết với ancol thì các chất này sẽ bị hoà tan đồng thời. Thường thì dung môi cồn trong nước dường như có đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ. Người ta ít dùng nước để thu được dịch chiết thô từ cây mà thay vào đó là dung dịch nước của metanol. Sau khi chiết dung môi được tách ra bằng máy cô quay ở nhiệt độ không quá 30 - 400C, với một vài hoá chất chịu nhiệt thì có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn. 28 2.1.3.2. Quá trình chiết Có thể thực hiện một trong hai phương pháp sau: • Quá trình chiết sử dụng bình chiết Soxhlet: Đây là phương pháp chiết nóng bằng cách đun hồi lưu dung môi với chất rắn một thời gian rồi rút ra, dùng thiết bị này để chiết nhiều lần liên tục và để tiết kiệm dung môi. • Chiết ngâm: Ngâm chất rắn vào dung môi trong một thời gian rồi chiết dung môi ra (chiết nguội). Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật vì nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời gian. Thông thường bình chiết ngâm không được sử dụng như phương pháp chiết liên tục vì mẫu được ngâm trong dung môi khoảng 24h sau đó lấy chất chiết ra. Cần lưu ý, sau khi chiết với dung môi 3 lần thì cặn thu được hầu như không còn chứa những chất giá trị nữa. Việc kết thúc quá trình chiết được kiểm tra bằng một số cách như: - Với các ancaloit, có thể kiểm tra sự xuất hiện của loại hợp chất này bằng việc phản ứng màu với một số tác nhân đặc trưng như: Dragendorff, Mayer. - Với các flavonoit - thường là những chất màu nên khi dịch chảy ra mà không có màu thì cho biết đã rửa hết chất này trong quá trình chiết. - Với các chất béo, nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và sự xuất hiện của cặn tiếp theo sẽ thể hiện việc kết thúc quá trình chiết. - Trong trường hợp các lacton của sesquiterpen và các glycozit trợ tim, phản ứng Kedde có thể được sử dụng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với anilin axetat sẽ cho sự xuất hiện của các hydratcacbon 29 và từ đó có thể biết được khi nào quá trình chiết kết thúc. Như vậy, tuỳ thuộc mục đích và yêu cầu của chất cần lấy để lựa chon dung môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lý để đạt hiệu quả cao. 2.2. TỔNG QUAN CHUNG VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ[1, 5] Phương pháp sắc ký là một phương pháp phổ biến và hữu hiệu nhất hiện nay để phân lập các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng. 2.2.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký. Sắc ký là phương pháp tách, phân ly, phân tích các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và tĩnh. Sắc ký gồm có pha tĩnh và pha động. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tuỳ vào tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan, độ phân cực...). Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến các lớp pha tĩnh khác sẽ xảy ra việc lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ và phản hấp phụ. Kết quả là các chất có ái lực lớn pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất có ái lực yếu hơn đối với pha này. Nhờ đặc điểm này mà ta có thể tách các chất ra khỏi nhau qua quá trình sắc ký. 2.2.2. Cơ sở của phương pháp sắc ký. Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha động và tĩnh. Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch (với chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir: 30 n = n∝ bC/ (1+bC). trong đó: • n - lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng. • n∝ - lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào đó. • b - hằng số. • C - nồng độ của chất bị hấp phụ. 2.2.3. Phân loại các phương pháp sắc ký. Trong phương pháp sắc ký, pha động là các lưu thể (các chất ở trạng thái khí hay lỏng), còn pha tĩnh là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn. Theo trạng thái tập hợp của pha động chia sắc ký thành hai nhóm lớn là: sắc ký khí và sắc ký lỏng. Dựa vào cách tiến hành sắc ký lại được chia thành nhiều cách khác nhau. 2.2.3.1. Sắc ký cột. Là phương pháp sắc ký phổ biến nhất, trong đó chất hấp phụ là pha tĩnh gồm các hạt silica gel (có nhiều loại kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảo YMC, ODS, Dianion... Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể bằng thuỷ tinh hoặc kim loại). Độ mịn của chất hấp phụ là rất quan trọng vì nó phản ánh số đĩa lý thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ, độ mịn của chất hấp phụ càng lớn thì số đĩa lý thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao. Tuy nhiên, nếu chất hấp phụ có kích thước càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm. Trong một số trường hợp lực trọng trường không đủ lớn sẽ gây hiện tượng tắc cột, dung môi không chảy được, khi đó người ta sẽ phải sử dụng áp suất như các phương pháp MPC (áp suất trung bình), HPLC (áp suất cao). 31 Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột: - Cách 1: Nhồi cột khô - Theo cách này, chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột khi còn khô, dùng que mềm gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột, dùng dung môi chạy cột và chạy đến khi cột trong suốt. - Cách 2: Nhồi cột ướt - Chất hấp phụ được hoà tan trong dung môi chạy cột trước với lượng dung môi tối thiểu, sau đó đưa dần lên cột đến khi đủ lượng cần thiết. Khi chuẩn bị cột phải chú ý để không có bọt khí bên trong (nếu có bọt khí sẽ gây hiện tượng chạy rối trong cột và làm giảm hiệu quả tách), cột không được nứt, gãy, rò. Trong sắc ký cột, tỷ lệ giữa đường kính (D) và chiều dài cột (L) thể hiện khả năng tách của cột, L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ thuộc vào từng hỗn hợp cụ thể. Tỷ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi gọi là Rf, với mỗi chất thì giá trị này thường khác nhau, dựa vào đặc điểm này để tách các chất ra khỏi hỗn hợp. Tỷ lệ chất so với tỷ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng và tuỳ thuộc vào yêu cầu tách. Nếu tách thô thì tỷ lệ này thấp khoảng 1/5 - 1/10, còn nếu tách tinh thì cao hơn và phụ thuộc vào hệ số tách (tức là Rf) mà hệ số này trong khoảng 1/30 - 1/20. Việc đưa chất lên cột được thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau. Nếu lượng chất nhiều và chạy thô thì phổ biến là tẩm chất vào silica gel rồi làm khô, tơi hoàn toàn rồi đưa lên cột. Nếu tách tinh có thể đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hoà tan trong lượng tối thiểu dung môi chạy cột rồi đưa lên cột. 32 Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách, nếu tốc độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách, nếu quá chậm sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc. 2.2.3.2. Sắc ký lớp mỏng. Là phương pháp dùng để kiểm tra và định hướng cho sắc ký cột, được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silica gel trên đế nhôm hay thuỷ tinh. Ngoài ra nó còn được dùng để điều chế thu chất trực tiếp trên bản sắc ký lớp mỏng điều chế được tráng silica gel dày hơn. Sau khi đưa lượng chất lên bản và thực hiện sắc ký, kiểm tra chất bằng đèn tử ngoại, cắt một miếng nhỏ bản mỏng rồi kiểm tra bằng dung dịch H2SO4, ráp lại với bản sắc ký để cạo chất cần tách trên silica gel, sau đó giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp. 2.2.4. Các phương pháp xác định cấu trúc phân tử hợp chất. Cấu trúc hoá học các hợp chất hữu cơ được xác định nhờ vào các phương pháp phổ kết hợp. Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của từng chất mà sử dụng phương pháp phổ cụ thể, cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối hợp các phương pháp phổ càng cao. Trong một số trường hợp, để xác định chính xác hoá học của hợp chất phải dựa vào các phương pháp bổ sung khác như chuyển hoá hoá học, tiến hành sắc ký so sánh. 2.2.4.1. Phổ hồng ngoại IR. Được xây dựng nhờ vào sự khác nhau về dao động của các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại. Như vậy, dựa vào phổ hồng ngoại có thể xác định được các nhóm chức đặc trưng của từng loại hợp chất, ví dụ dao động hoá trị của nhóm OH tự do trong các nhóm hydroxyl là 3450-3300 cm-1; của nhóm cabonyl C=O khoảng 1750-1700 cm-1... 33 2.2.4.2. Phổ khối lượng MS. Nguyên tắc là dựa vào sự phân mảnh ion của phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài. Phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác mà dựa vào đó có thể xác định được cơ chế phân mảnh và dựng lại cấu trúc hoá học của hợp chất. Hiện nay có rất nhiều loại phổ khối lượng, một số phương pháp chủ yếu: • Phổ EI - MS (Electron Impact Ionization Mass Spectroscopy): Dựa vào sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau, phổ biến là 70 eV. • Phổ ESI - MS (Electron Spray Ionization Mass Spectroscopy): Gọi là phổ phun mù điện tử, được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều phổ EI-MS nên phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử và các pic đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá vỡ. • Phổ FAB (Fast Atom Bombing mass spectroscopy): Là phổ bắn phá nguyên tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở năng lượng thấp, nên phổ thu được cũng dễ thu được pic ion phân tử. • Phổ khối lượng phân giải cao (High resolution Mass Spectroscopy): Cho phép xác định pic ion mảnh hoặc pic ion phân tử có độ chính xác cao. Ngoài ra hiện nay người ta còn sử dụng các phương pháp sắc ký kết hợp với phổ khối như: GC - MS (sắc ký khí - khối phổ); LC - MS (sắc ký lỏng - khối phổ). Các phương pháp kết hợp này đặc biệt hữu hiệu khi phân tích thành phần của hỗn hợp chất (nhất là phân tích thuốc trong nghành dược). 2.2.4.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Là phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên 34 cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử. Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C) dưới tác dụng của từ trường ngoài. Sự cộng hưởng này được biểu diễn bằng độ chuyển dịch hoá học (chemical shift). Ngoài ra, đặc trưng của phân tử còn được xác định nhờ vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling).  Phổ 1H - NMR: Trong phổ này, độ chuyển dịch hoá học (δ ) của các proton được xác định trong thang ppm từ 0 - 14 ppm, tùy thuộc vào mức độ lai hoá của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phần. Dựa vào những đặc trưng của độ chuyển dịch hoá học và tương tác spin mà xác định cấu trúc phân tử của hợp chất.  Phổ 13C - NMR: Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở trường khác nhau và cho các tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo của phổ này là 0 - 230 ppm. 2.2.4.4. Phổ DEPT. Phổ này cho ta các tín hiệu để phân loại các loại cacbon khác nhau. Trên phổ DEPT, tín hiệu cacbon bậc bốn biến mất, ở phổ DEPT 1350, tín hiệu của CH và CH3 nằm về một phía, CH2 nằm về một phía; ở phổ 900 chỉ xuất hiện tín hiệu CH. 2.2.4.5. Phổ 2D NMR. Đây là kỹ thuật phổ hai chiều cho phép xác định các tương tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều. Một số kỹ thuật tiêu biểu: • HMQC: Các tương tác trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các tương tác trên phổ này. Trên phổ, một trục là phổ 1H NMR còn trục kia là 13C NMR, các tương tác nằm trên đỉnh các ô vuông. 35 • COSY: Biểu diễn các tương tác xa của H-H, chủ yếu là các proton đính với các cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các phần của phân tử được nối ghép lại với nhau. • HMBC: Biểu diễn các tương tác xa trong không gian phân tử. Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc. • NOESY: Phổ này biểu diễn các tương tác xa trong không gian phân tử của các proton không kể đến các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian, dựa vào số liệu phổ này có thể xác định cấu trúc không gian của phân tử. Ngoài ra còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kỹ thuật phổ NOE diffeences để xác định cấu trúc không gian của phân tử. Bằng việc dựa vào một xung đúng bằng từ trường cộng hưởng của một proton xác định thì các proton có cùng phía về không gian cũng như gần nhau về không gian sẽ cộng hưởng mạnh hơn và cho tín hiệu phổ với cường độ mạnh hơn. Bên cạnh đó còn sử dụng phổ X - RAY (nhiễu xạ Ronghen) để xác định cấu trúc không gian của toàn bộ phân tử. 2.3. PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC. Theo phương pháp của Likhiwitayawuid và cộng sự (1993) đang được áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thư quốc gia của Mỹ (NCI). Dựa trên phương pháp nuôi cấy tế bào ung thư invitro của các tác giả Geran và cộng sự (1972), Penzutto và cộng sự (1983) [20] và Skehan và cộng sự (1990) [19]. Phương pháp này đã được phòng thí nghiệm thử hoạt tính sinh học, Viện hoá học các hợp chất thiên nhiên triển khai áp dụng từ năm 1996. Thử với 3 dòng tế bào ung thư người: Tế bào ung thư gan người (Human Hepatocellular Carcinoma Hep-G2), tế bào ung thư biểu mô người (Human epidemoid 36 carcinoma - KB), và tế bào ung thư màng tử cung (Fibril sarcoma of uterus - FL). Tế bào nuôi cấy trong điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; độ ẩm 98%; nhiệt độ ổn định ở 370C vô trùng tuyệt đối) cho phát triển tới pha phát triển cực đại (đạt 60-70%), thay môi trường sạch để hoạt hoá tế bào từ 18-24 giờ, lúc đó tế bào đã sẵn sàng để thực hiện thí nghiệm Mẫu thí nghiệm: Các hợp chất phân lập được từ loài Hải miên Petrosia nigricans: Hoà mẫu thí nghiệm vào dung dịch DMSO 100% (1mg/ml) cho bước sàng lọc sơ bộ. Pha 10 thang nồng độ cho bước 2 để tính giá trị IC50. Mẫu chứng: Dùng chất chuẩn có khả năng diệt tế bào, chẳng hạn Elipticine hoặc Colchicine pha trong DMSO với nồng độ 0,01 mM. Nhỏ vào mỗi giếng 10µ l mẫu pha. Tiến hành: Tế bào được xử lý Tripsin EDTA cho tách khỏi đáy bình. Hoà dung dịch huyền phù tế bào bằng môi trường sạch, rửa và đếm số lượng, pha tế bào nồng độ khoảng 3 - 4 ×104 tế bào/ml, sau đó nhỏ vào phiến mẫu đã được chuẩn bị. Phiến mẫu được ủ trong tủ CO2 thêm 3 ngày. Kết thúc thí nghiệm: Tế bào khi ủ 3 ngày được cố định bằng dung dịch TCA lạnh. Rửa, để khô, nhuộm SRB 0,4% trong axit acetic 1% và rửa lại bằng axit acetic 1% để loại màu thừa; để khô, hoà lại bằng dung dịch đệm Tris base. Đọc trên máy ELISA ở bước sóng 495-515 nm. Chú ý: Luôn phải có phiến đối chứng OD (ngày 0) để làm đối chứng cho lượng tế bào ở thời điểm bắt đầu thí nghiệm. Về đối chứng âm: Giá trị 37 OD của DMSO 10% để làm đối chứng cho giá trị của lượng tế bào khi kết thúc thí nghiệm. Cách cố định và nhuộm như trên. Sàng lọc sơ cấp tìm giá trị CS % (% Cell Survival): Giá trị CS: Là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của chất thử tính theo % so với đối chứng, mẫu nào cho giá trị CS ≤ 50% 5µg/ml đối với mẫu tinh khiết được đánh giá là có hoạt tính. Dựa trên kết quả đo được của chúng OD (ngày 0), DMSO 10% và so sánh với giá trị OD khi trộn mẫu để tìm giá trị CS (%) theo công thức: CS% = ± σ CS% được tính toán theo công thức độ lệch tiêu chuẩn của Ducan lấy giá trị trung bình với độ lệch tiêu chuẩn σ : σ= n 2 i i 1 (X X) n 1 = − − ∑ Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS50 < 50% ±σ ) sẽ được chọn ra để thử nghiệm bước 2 để tìm giá trị IC50. Cách tính IC50: Dùng giá trị CS50 của 10 thang nồng độ, dựa vào chương trình Table curve theo thang giá trị logarit của đường cong phát triển tế bào và nồng độ chất thử để tính giá trị IC50. Giá trị IC50 ≤ 4 µg/ml đối với chất sạch là có hoạt tính. Công thức: 1/Y = a+blnX. trong đó: Y - nồng độ chất thử. X - giá trị CS (%). OD (mẫu) - OD (ngày 0) OD (DMSO) - OD (ngày 0) 38 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1. MẪU HẢI MIÊN. Mẫu của loài Petrosia nigricans được sưu tầm ở độ sâu 30 - 45m ở vùng biển Trường Sa, tỉnh Khánh Hoà, Việt Nam tháng 10/2007 và được giữ đông lạnh cho đến khi đem ra sử dụng. Tên khoa học của mẫu này được giám định bởi TS. Đỗ Công Thung, Viện Tài nguyên và môi trường biển, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 3.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT. 3.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC). Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% đượ

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfluan_van_nghien_cuu_thanh_phan_hoa_hoc_va_hoat_tinh_gay_doc.pdf
Tài liệu liên quan