Luận văn Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học từ lá cây vú bò (ficus hirta vahl.) phân bố tại miền trung Lào

enzyl-β-D- glucopyranoside. (23) 3,4-dimethoxyphenyl-1- O-β-D-glucopyranoside. Chất . Tên (24) (3,4,5-trimethoxy- phenol- tetraacetyl-β-D-glucopyranoside (25) 1,3,5-trimethoxybenzene. Chất Tên (26):1-methyl-1,2,3,4-tetrahydro-β- carboline-3-carboxylic acid. (27) Methy-1-methyl-1,2,3,4- tetrahydro- β-carboline-3-carboxylate Chất Tên (28): vomifoliol (29): dehydrovomifoliol Chất Tên (30): icariside B (31) dihydrophaseic acid (32) pubinernoid A Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN Chất Tên (33) pinocembrin-7-O-β-D-glucoside (34) narngenin-7-O-β-D-glucoside Chất Tên (35) eriodictyol-7-O-β-D-glucoside (36): phenylpropan-1,2-diol 1.2.2. Các nghiên cứu về loài F. hirta Vahl Ở Việt Nam Các nghiên cứu trong nước về chi này cũng thu được một số kết quả đáng quan tâm. Năm 2002, một hợp chất sesquitecpen, verrucarin L được xác định từ loài F. fistulosa có tác dụng kháng ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum rất cao với giá trị IC50 < 1 μg/ml. Hoạt tính của hợp chất này cao hơn cả chloroquine, artemisinin và quinine. Cặn alkaloid tổng của loài F. hispida và hợp chất hispidin phân lập từ cặn chiết này được công bố thể hiện hoạt tính gây độc tế bào cao trên các dòng tế bào ung thư người gồm ung thư gan (Hep-2), ung thư màng tim (RD) và ung thư tử cung (FI) [1]. Theo Phan Văn Kiệm và cộng sự đã tìm ra từ dịch chiết methanol của lá loài F. callosa đã phân lập và xác định cấu trúc của hai flavonoid glycosid (37-38) có tên là: (37): glucotricin, (38): rhoiflin và megastigmane glycoside: (39): corchoionoside. [2] Bảng 1.5: Cấu trúc hóa học của các hợp chất 37-39 [2] Chất Tên (37): glucotricin. (38): rhoifolin (39): Corchoionoside Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN 1.2.3. Các nghiên cứu về loài F. hirta Vahl Ở Lào Lào là một trong số những quốc gia có thảm thực vật tự nhiên đa dạng phong phú, có nhiều loài cây thuốc quý. Do còn nhiều khó khăn về kinh tế, sự đầu tư vào nghiên cứu khoa học và công nghệ còn hạn chế, nên kết quả nghiên cứu các cây thuốc nói chung và loài F. hirta Vahl. nói riêng còn rất khiêm tốn. Với loài F. hirta Vahl. hầu hết các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở mức đánh giá hoạt tính sinh học của lá loài F. hirta Vahl. chúng tôi chưa tìm thấy có tài liệu khoa học nào công bố về thành phần hóa học của loài F. hirta Vahl mọc ở Lào. 1.3. Hoạt tính sinh học của Taraxerone và Bergapten 1.3.1. Taraxerone Taraxerone (D-Friedoolean-14-en-3-one) là một triterpen, có nhiều trong thực vật. Các nghiên cứu trước đây chỉ ra taraxerone có tác dụng chống ung thư phổi (A - 549). Tác dụng của hợp chất này đối với apoptosis và hình thái tế bào cũng đã được nghiên cứu. Xét nghiệm MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide) đã được sử dụng để đánh giá ảnh hưởng của hợp chất lên khả năng sống của tế bào. Nó cũng ức chế sự hình thành khuẩn lạc tế bào ung thư. Khoảng 90% tế bào ung thư đã bị phá hủy bởi liều điều trị taraxerone 125 M. Taraxerone cũng gây ra co rút tế bào, ngưng tụ chromatin và vỡ màng nhân là đặc trưng của apoptosis [48]. Taraxerone thể hiện khả năng chống oxy hóa tương đương với hydroxytoluene butylated (BHT) bằng các xét nghiệm DPPH (p = 0.117) và FRAP (p = 0.179). Việc sản xuất nitric oxide cảm ứng trong đại thực bào murine kích thích lipopolysacarit bị ức chế bởi taraxerone (IC50 = 38,49 ± 3,77 M) thông qua điều hòa giảm biểu hiện synthase oxide cảm ứng (iNOS) ở mức độ phiên mã. Tác dụng ức chế của taraxerone đối với việc tạo nitric oxide hiệu quả hơn đáng kể so với caffeic acid hoặc galli acid [11]. Ngoài ra, taraxerone còn có hoạt tính chống lại hoạt động của ký sinh trùng Giardia lamblia cao hơn so với taraxerol và scopoletin (IC50 = 11.33 μg/mL) [16]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN Hình 1.15: Công thức cấu tạo của taraxerone 1.3.2. Bergapten Bergapten là chất tự nhiên của psoralen và đồng phân được xác định và phân lập từ các loài thực vật khác nhau như: Angelica, Celery, Rue, Bergamot Hợp chất bergapten đã được chứng minh là một chất chống viêm và chống khối u tự nhiên được phân lập từ tinh dầu bergamot, các loại tinh dầu họ cam quýt và nước bưởi khác, đã được sử dụng để ngăn chặn sự hình thành hủy xương do lipopolysacarit (LPS), tái hấp thu xương và sự tồn tại của nguyên bào xương trong ống nghiệm [56]. Bergapten cũng đã được chứng minh là ức chế đáng kể việc sản xuất các cytokine tiền viêm [34]. Bergapten là một loại thuốc bổ được tìm thấy trong nhiều cây thuốc, có hoạt tính chống oxy hóa nhẹ được chứng minh từ các nghiên cứu trong ống nghiệm [30]. Bergapten đã được sử dụng kết hợp với bức xạ UV trong liệu pháp quang hóa da trong nhiều thập kỷ [53] và một số nghiên cứu cũng cho thấy nó có chất chống ung thư [45], thuốc chống trầm cảm [41], chống co giật [43]. Bergapten là một trong những coumarin được tìm thấy trong nhiều loại thuốc thảo dược. Các nghiên cứu dược lý cho thấy bergapten có tác dụng giảm đau, chống viêm, chống đông máu và chống ung thư [15]. Bergapten cũng đã được biết là chống lại tác dụng tăng sinh và gây ra apoptosis của các tế bào ung thư vú [36]. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng bergapten làm giảm mức độ lưu thông estrogen và cải thiện quá trình chuyển hóa oxy hóa [24]. Ngoài ra, Bergapten được sử dụng trong mỹ phẩm [44]. Hình 1.16: Công thức cấu tạo của bergapten Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN Chương 2 THỰC NGHIỆM 2.1. Đối tượng nghiên cứu Chúng tôi tiến hành khảo sát thực địa, thu thập thông tin, thu hái tiêu bản lá của loài Ficus hirta Vahl. Được thu hái tại Trường Đại học Quốc gia Lào vào tháng 7 - 8 năm 2018 do T.S Nguyễn Thế Anh, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam xác định tên khoa học. 2.2. Hóa chất, thiết bị 2.2.1. Hóa chất 2.2.1.1. Hóa chất dùng để phân lập các chất từ mẫu lá của loài F. hirta Vahl Sử dụng dung môi ethyl acetate, n-hexan, dichloromethane, methanol ngâm để chiết mẫu. Sắc ký bản mỏng phân tích: sử dụng bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagel 60 F254, Merck, có độ dày 0,2 mm. Sắc ký cột thường: sử dụng silicagel cỡ hạt 197-400 mesh (0,040-0,063 mm). Sắc ký cột nhanh: sử dụng silicagel cỡ hạt 70-200 mesh. Bản mỏng: được kiểm tra bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng ngắn và dài (254; 365 nm), sau đó hiện màu bằng thuốc thử vanillin - H2SO4 (vanillin 1,2 g; MeOH 200 ml; CH3COOH 25 mL; H2SO4 11 ml), hơ nóng trên bếp điện cho đến khi các vệt trên bản mỏng hiện màu rõ nhất. Dung môi ethyl acetate được cất lại qua cột Vigreux trước khi sử dụng để chạy sắc ký cột và sắc ký bản mỏng. 2.2.1.2 Hóa chất dùng để thử hoạt tính ức chế Nitric oxide từ mẫu lá của loài F. hirta Vahl. Vật liệu và hóa chất - Lipopolysaccharides (LPS) từ Escherichia-coli của Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS) were from Life Technologies, Inc., (Gaithersburg, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN MD, USA). Sodium nitrite, sulfanilamide, N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride and dimethyl sulphoxide (DMSO) của Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA), các hóa chất cần thiết khác của các hãng Sigma, GIBCO, Invitrogen, Promega v.v. - Dòng tế bào RAW 264.7 do GS. TS. Domenico Delfino, Đại học Perugia, Italia cung cấp. 2.2.1.3. Hóa chất dùng để xác định hoạt tính kháng vi sinh mẫu lá của loài F. hirta Vahl. Vật liệu và hóa chất - Bacillus subtilis (ATCC 6633): là trực khuẩn gram (+), sinh bào tử, thường không gây bệnh. - Staphylococcus aureus (ATCC 13709): cầu khuẩn gram (+), gây mủ các vết thương, vết bỏng, gây viêm họng, nhiễm trùng có mủ trên da và các cơ quan nội tạng. - Lactobacillus fermentum (N4): vi khuẩn gram (+), là loại vi khuẩn đường ruột lên men có ích, thường có mặt trong hệ tiêu hóa của người và động vật. - Escherichia coli (ATCC 25922): vi khuẩn gram (-), gây một số bệnh về đường tiêu hóa như viêm dạ dày, viêm đại tràng, viêm ruột, viêm lỵ trực khuẩn. - Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442): vi khuẩn gram (-), trực khuẩn mủ xanh, gây nhiễm trùng huyết, các nhiễm trùng ở da và niêm mạc, gây viêm đường tiết niệu, viêm màng não, màng trong tim, viêm ruột. - Salmonella enterica: vi khuẩn gram (-), vi khuẩn gây bệnh thương hàn, nhiễm trùng đường ruột ở người và động vật. - Candida albicans (ATCC 10231): là nấm men, thường gây bệnh tưa lưỡi ở trẻ em và các bệnh phụ khoa. MHB (Mueller-Hinton Broth), MHA (Mueller-Hinton Agar); TSB (Tryptic Soy Broth); TSA (Tryptic Soy Agar) cho vi khuẩn; SDB (Sabourand-2% dextrose broth) và SA (Sabourand - 4% dextrose agar) cho nấm. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN 2.2.1.4. Hóa chất dùng để xác định hoạt tính gây độc tế bào ung thư từ mẫu lá của loài F. hirta Vahl. Vật liệu và hóa chất: FBS của GIBCO, KB (Human epidermic carcinoma), Hep G2 (Hepatocellular carcinoma) - ung thư gan; chất tham khảo Ellipticine (Singma) được dùng làm chất tham khảo. 2.2.2. Thiết bị Máy cất quay chân không, thiết bị phụ trợ cho thí nghiệm phân lập chất hữu cơ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được ghi trên máy Bruker Avance 500 MHz tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Đĩa 96 giếng, pipet, eppendorf và các thiết bị phụ trợ khác. Cân phân tích, máy đo OD Microplate Reader. Bộ Griess Reagent System (Promega Coopertion, WI, USA). Máy microplate reader ở bước song 540 nm. Tử ấm CO2 (INNOVA CO-170), tủ cấy sinh học an toàn cấp II, máy li tâm (Universal 320R), kính hiển vi ngược (Zeizz), tủ lạnh sâu -250C, -800C, buồng tế bào (Fisher, Hoa kỳ), máy quang phổ (Genios Tecan) và bình nitro lỏng bảo quản tế bào. 2.3. Phương pháp xử lý mẫu thực vật, chiết tách và xác định cấu trúc các chất phân lập được 2.3.1. Xử lý mẫu thực vật Mẫu lá loài F. hirta Vahl. được thu hái tại Trường Đại học Quốc gia Lào tỉnh Viêng Chăn ở miền Trung Lào (tháng 7 - 8 năm 2018). Mẫu nguyên liệu được rửa sạch. Sau đó chiết mẫu lá bằng nước sạch. 2.3.2. Chiết tách các chất - Mẫu lá của loài F. hirta Vahl. được rửa sạch, băm nhỏ và đun với nước sấp mặt lá. Đun trong vòng 3 tiếng, vớt bã lá, để nguội, vắt kiệt bã lá, thu được nước cao chiết lần 1. Phần bã lá tiếp tục cho nước sấp mặt lá, đun tiếp trong vòng 2 tiếng, vớt bã, vắt kiệt, thu được nước cao chiết lần 2. Gộp 2 lần nước chiết, đun sôi cho nước bay hơi bớt, tới khi còn 0.5L cao, đưa lên bếp cách thủy đun ở 700C cho tới khi thu được cao đặc. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN - Cao thu được cho vào phễu chiết, ngâm trong ethyl acetate trong 7 ngày, 2 ngày thay 1 lần dung môi, kết hợp lắc đều. - Sau đó lọc và gộp các dịch chiết của từng lần với nhau, quay cất dung môi dưới áp suất giảm thu được cặn chiết ethyl acetate. - Phân lập cặn chiết ethyl acetate thu được bằng phương pháp sắc ký cột trên silicagel với các hệ dung môi thích hợp. 2.3.3. Xác định cấu trúc các chất Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng sự kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC). 2.4. Phương pháp xác định hoạt tính sinh học 2.4.1. Phương pháp xác định hoạt tính ức chế Nitric oxide (NOs inhibition) từ dịch chiết nước mẫu lá của loài F. hirta Vahl. Hoạt tính ức chế nitric oxide (NOs inhibition) của chất nghiên cứu được thực hiện theo phương pháp xác định khả năng ức chế sản sinh NO của tế bào macrophage RAW 264.7 sau đó làm phép thử sinh học xác định khả năng gây độc tế bào bằng MTT. 2.4.2. Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh dịch chiết nước mẫu lá của loài F. hirta Vahl. Được thực hiện dựa trên phương pháp dãy nồng độ trên môi trường lỏng. Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính là MIC (minimum inhibitor concentration-nồng độ tối thiểu ức chế), IC50 (50% inhibitor concentration-nồng độ ức chế 50%), MBC (minimum bactericidal concentration- nồng độ tối thiểu diệt khuẩn). 2.4.3. Phương pháp xác định hoạt tính gây độc tế bào ung thư dịch chiết nước mẫu lá của loài F. hirta Vahl Phương pháp thử độ độc tế bào ung thư in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute - NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro. 2.5. Thực nghiệm 2.5.1. Quá trình phân lập các chất từ mẫu lá của loài F. hirta Vahl 2.5.1.1. Chiết, tách mẫu phần lá của loài F. hirta Vahl. Quy trình chiết mẫu phần lá của loài F. hirta Vahl. (3.8 kg) được nêu trong sơ đồ 2.1. - Mẫu lá của loài F. hirta Vahl. được rửa sạch, băm nhỏ (3.8kg) và đun với nước sấp mặt lá. Đun trong vòng 3 tiếng, vớt bã lá, để nguội, vắt kiệt bã lá, thu được nước cao chiết lần 1. Phần bã lá tiếp tục cho nước sấp mặt lá, đun tiếp trong vòng 2 tiếng, vớt bã, vắt kiệt, thu được nước cao chiết lần 2. Gộp 2 lần nước chiết, đun sôi cho nước bay hơi bớt, tới khi còn 0.5 l cao, đưa lên bếp cách thủy đun ở 700C cho tới khi thu được cao đặc (50.3g). - Cao thu được cho vào phễu chiết, ngâm trong ethyl acetate trong 7 ngày, 2 ngày thay 1 lần dung môi, kết hợp lắc đều. - Sau đó lọc và gộp các dịch chiết của từng lần với nhau, quay cất dung môi dưới áp suất giảm thu được cặn chiết ethyl acetate (5.11g). 2.5.1.2. Phân lập các chất từ cặn chiết ethyl acetate Quá trình phân lập các chất từ cặn chiết ethyl acetate lá của loài F. hirta Vahl được trình bày theo sơ đồ 2.1. Từ 5.11 g cặn chiết ethyl acetate được hòa tan vừa đủ bằng hỗn hợp dung môi CH2Cl2/MeOH và trộn với 20 g silicagel, quay cất đến khô, sau đó nghiền thành bột mịn để các chất hấp phụ đều trên silicagel. Bột silicagel có tẩm dịch chiết này được sử dụng để đưa lên cột sắc ký. Silicagel Merck (cỡ hạt 0,043-0,063 mm; 200 g) được nhồi vào cột sắc ký có kích thước 5cm x 27cm theo phương pháp nhồi ướt với dung môi ban đầu là EtOAc 100%. Sau khi cột đã ổn định, bột silicagel tẩm dịch chiết được đưa lên cột và giải hấp với hệ dung môi rửa giải là n-hexan: EtOAc có độ phân cực tăng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN dần (lượng EtOAc tăng dần từ 0→100%) thu được các phân đoạn khác nhau. Từ các phân đoạn này được gộp thành các phân đoạn có kí hiệu là: ACE2 - ACE6, theo kết quả kiểm tra trên sắc ký lớp mỏng. Phân đoạn ACE2 được làm sạch lại trên cột silicagel với hệ dung môi rửa giải là CH2Cl2: EtOAc: MeOH=15:80:5→0:50:50 thu được 10 mg chất sạch thứ nhất ký hiệu là F1. Sắc kí lại trên cột silicagel chất rắn xuất hiện ở phân đoạn ACE6 được kết tinh lại trong hỗn hợp CH2Cl2/ MeOH thu được 15,5 mg chất sạch thứ ba ký hiệu là F2. Quy trình chiết tách và phân lập hai chất trên được thể hiện trên sơ đồ 2.1. Sơ đồ 2.1: Sơ đồ chiết, tách các chất từ mẫu lá của loài F. hirta Vahl SKC silicagel: CH2Cl2: EtOAc: MeOH=15:80:5→0:50:50 1. Rửa sạch, băm nhỏ 2. Đun với nước lấy dung dịch cao 3. Đun bếp cách thủy bay hơi nước ở 700 C thu được cao chiết SKC silicagel: n-hexan:EtOAc, lượng EtOAc tăng từ 0-100% 1. Chiết ethyl acetate trong 7 ngày, 2 ngày thay 1 lần dung môi 2. Quay cất dung môi dưới áp suất giảm 3. Cất quay chân không, loại metanol Mẫu lá loài F. hirta Vahl (3,8 kg) (1.1 kg) Cặn cao (45.19g) Cao EtOAc (5.11g) Cao chiết (50,3g) Phân đoạn ACE 2 Chất F1 (10 mg) Chất F2 (15,5mg) SKC silicagel: CH2Cl2/MeOH Phân đoạn ACE 6 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN 2.5.2. Dự kiện phổ của các chất phân lập được 2.5.2.1. Chất F1: Taraxerone - Là chất bột màu trắng, khối lượng 10 mg - HR-ESI-MS /m z : -1H-NMR (500 MHz, 3CDCl ) δH : 5.56 (1H, dd, J =8.0, 3.0 Hz, H-15), 2.58 (1H, m, H-2a), 2.34 (1H, m, H-2b), 1.14 (3H, s, H-27), 1.09 (3H, s, H-23), 1.08 (3H, s, H-25), 1.07 (3H, s, H-24), 0.96 (3H, s, H-29), 0.92 (3H, s, H-26), 0.91 (3H, s, H-30), 0.83 (3H, s, H-28). - 13C-NMR (125 MHz, 3CDCl ) δC : 217.58 (C-3), 157.65 (C-14), 117.22 (C-15), 55.82 (C-5), 48.85 (C-9), 48.73 (C-18), 47.60 (C-4), 40.67 (C-19), 38.91 (C-8), 38.38 (C-1), 37.78 (C-17), 37.73 (C-13), 37.57 (C-12), 36.70 (C-16), 35.79 (C-10), 35.14 (C-7), 34.16 (C-2), 33.60 (C-21), 33.38 (C-29), 33.11 (C-22), 29.94 (C-28), 29.88 (C-26), 28.82 (C-20), 26.15 (C-23), 25.58 (C-27), 21.50 (C-24), 21.37 (C-30), 20.00 (C-6), 17.47 (C-11), 14.82 (C-25). 2.7.2.2. Chất F2: Bergapten - Là chất bột, màu trắng, khối lượng 15,5 mg - 1H-NMR (500 MHz, 3CDCl ) δH : 8.16 (1H, d, J =10.0 Hz, H-4), 7.59 (1H, d, J =2.5 Hz, H-2’), 7.14 (1H, s, H-8), 7.02 (1H, dd, J =2.5, 1.0 Hz, H-3’), 6.27 (1H, d, J =10.0 Hz, H-3), 4.27 (3H, 35 OCH ) - 13C-NMR (125 MHz, 3CDCl ) δC : 161.34 (C-2), 158.53 (C-7), 152.87 (C-5), 149.72 (C-9), 144.92 (C-2’), 139.36 (C-4), 112.86 (C-6), 112.73 (C-3), 106.59 (C-10), 105.15 (C-3’), 94.02 (C-8), 60.24 (OCH3). 2.5.3. Xác định khả năng ức chế Nitric oxide từ mẫu lá của loài F. hirta Vahl. 2.5.3.1. Xác định nuôi cấy tế bào in vitro - Dòng tế bào RAW264.7 được nuôi cấy trong môi trường DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES và 1.0 mM sodium pyruyate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum - FBS (GIBCO). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN - Tế bào được cấy chuyển sau 3 - 5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 370C, 5% CO2. 2.5.3.2. Xác định khả năng ức chế sản sinh NO của tế bào macrophage RAW 264.7 - Tế bào RAW 274.7 được đưa vào đĩa 96 giếng ở nồng độ 2×105 tb/giếng và nuôi trong tủ ấm ở 370C và 5% CO2 trong 24h. - Tiếp theo, môi trường nuôi cấy được loại bỏ, thay bằng môi trường DMEM không có FBS trong 3h. - Tế bào sau đó được ủ mẫu nghiên cứu ở các nồng độ khác nhau trong 2h trước khi được kích thích sản sinh yếu tố NO bằng LPS (1 µg/ml) trong 24h. - Một số giếng không được ủ mẫu mà chỉ sử dụng trong dung dịch pha mẫu được coi là đối chứng âm. Trong khi đối chứng dương được sử dụng là NG-Methyl-L-arginine acetate (L - NMMA) (sigma) ở các nồng độ 100; 20; 4 và 0.8 m µg/ml. - Nitrie (NO2-), được xem là chỉ thị cho việc tạo NO, sẽ được xác định nhờ bộ Griess Reagent System (Promega Cooperation, WI, USA). Cụ thể là, 100 µl môi trường nuôi tế bào (ủ mẫu) được chuyển sang đĩa 96 mới và được thêm vào 100 µL Griess reagent: 50 µl of 1% (w/v) sulfanilamide trong 5% (v/v) phosohoric acid và 50 µl 0.1% (w/v) N-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride pha trong nước. - Hỗn hợp này được ủ tiếp ở nhiệt độ phòng trong 10 phút và hàm lượng nitrite sẽ được đo bằng máy microplate reader ở bước sóng 540 nm. Môi trường DMEM không FBS được sử dụng như giếng trắng (blanks). - Hàm lượng nitrite của từng mẫu thí nghiệm được xác định nhờ vào đường cong hàm lượng chuẩn NaNO2 và được so sánh % với mẫu chứng âm (LPS). - Khả năng ức chế sản sinh NO của mẫu được xác định nhờ công thức: % ức chế = 100% - [hàm lượng NOsample/hàm lượng NOLPS] x 100 - Phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự hình thành NO) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính Table Curve 2Dv4. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN 2.5.3.3. Phép thử sinh học xác định khả năng gây độc tế bào bằng MTT - Chất thử (20 µl) được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ tương tự nồng độ của thí nghiệm NO. - Sau khi điều chỉnh để có mật độ tế bào phù hợp, hút (180 µl) tế bào vào các giếng của khay 96 giếng đã có chất thử. Trên cùng một đĩa thử, bố trí một số giếng để làm đối chứng không có mẫu thử, chỉ có dung môi pha mẫu là DMSO 10%. - Để đĩa nuôi cấy vào trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37 0C, 5% CO2, nuôi trong thời gian 72 giờ. - Sau 72 giờ, 10 µl MTT (nồng độ cuối cùng là 5 mg/ml) được cho vào mỗi giếng. - Sau 4h, loại bỏ môi trường, tinh thể formazan được hòa tan bằng 50 µl (DMSO) 100%. - Giá trị OD đo ở bước song 540 nm bằng máy quang phổ. - Lượng tế bào sống sót sẽ được tính theo công thức: 2.5.4. Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh Pha loãng mẫu thử: Mẫu ban đầu được pha loãng trong DMSO và nước cất tiệt trùng thành một dãy 4 nồng độ theo yêu cầu và mục đính thử. Nồng độ thử cao nhất là 128 µl/ml. Thử hoạt tính: Lấy 20 µl dung dịch mẫu thử ở các nồng độ vào đĩa 96 giếng, thêm 200 µl dung dịch vi khuẩn và nấm có nồng độ 5×105 CFU/ml, ủ ở 370C/24h. Xử lý kết quả: - Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất ức chế sự phát triển của sinh vật. - Giá trị IC50 được tính toán dựa trên số liệu đo độ đục của môi trường nuôi cấy bằng máy quang phổ TECAN và phần mềm raw data. % tế bào sống sót = OD (chất thử) – OD (đối chứng trắng) OD (DMSO) – OD (đối chứng trắng) x 100% Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN - Giá trị MBC được xác định bằng số khuẩn lạc trên đĩa thạch. Chất tham khảo: - Kháng sinh Ampicillin cho các chủng vi khuẩn Gram (+) với các giá trị MIC trong khoảng 0.004 - 1.2 µg/ml. - Kháng sinh Cefotaxim cho các chủng vi khuẩn Gram (-) với giá trị MIC trong khoảng 0.07 - 19.23 µg/ml. - Kháng nấm Nystatin cho chủng nấm với giá trị MIC trong khoảng 2.8 - 5.0 µg/ml. 2.5.5. Xác định hoạt tính gây độc tế bào ung thư Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trường nuôi cấy phù hợp có bổ sung thêm 10% huyết thanh phôi bò (FBS) và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (370C, 5% CO2, độ ẩm 98%, vô trùng tuyệt đối). Tùy thuộc vào đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác nhau. Tế bào phát triển ở pha log sẽ được sử dụng để thử độc tính. Thử độc tế bào: 200 µl dung dịch tế bào ở pha log nồng độ 3×104 tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường DMEM cho các dòng tế bào KB, HepG2. Mẫu thử được pha loãng sao cho đạt đến nồng độ cuối cùng là 128 µg/ml và các nồng độ pha loãng thấp hơn. Ủ 370C, 5% CO2 3 ngày. Đối chứng dương gồm 200 µl dung dịch tế bào 3×104 tế bào/ml. Đối chứng âm gồm 200 µl môi trường nuôi cấy. Ellipticine (Sigma) được dùng làm chất tham khảo. Sau 3 ngày nuôi cấy; ủ tiếp với MTT 0.2 mg/ml ở 370C trong 4 giờ, loại bỏ môi trường, thêm 100 µl DMSO lắc đều đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy Spectrophotometter Genios TECAN. IC (%) = 100 x ODtest – ODcontrol(+) ODcontrol(-) – ODcontrol(+) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN Phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào (Growth inhibition) được tính toán dựa trên số liệu đo mật độ quang học OD trên máy quang phổ TECAN theo công thức sau: Giá trị IC50 được tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào bằng phần mềm máy tính table curve. 2.6. Phương pháp xử lý số liệu Số liệu được xử lý trên hệ thống Excel và GraphPad Prism. IC (%) = 100 x ODtest – ODcontrol(+) ODcontrol(-) – ODcontrol(+) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập các chất từ cặn chiết ethyl acetate mẫu lá của loài F. hirta Vahl. Mẫu phần lá của loài F. hirta Vahl. rửa sạch 3.8 kg được ngâm chiết (xem mục 2.5.1.1) thu được 5.11g cặn ethyl acetate (sơ đồ 2.1). Quá trình phân lập các chất ethyl acetate mẫu lá của loài F. hirta Vahl. được trình bày chi tiết ở phần thực nghiệm (xem mục 2.5.1.2) Từ 5.11g cặn ethyl acetate mẫu lá của loài F. hirta Vahl. được phân tách bằng sắc ký cột silicagel với các hệ dung môi khác nhau thu được 2 chất sạch: ký hiệu là F1, F2. + Chất F1: 10 mg hiệu suất 2.63 ×10-4 % so với trọng lượng mẫu lá. + Chất F2: 15.5 mg hiệu suất 3.97 ×10-4 % so với trọng lượng mẫu lá. 3.2. Xác định cấu trúc chất tách được Cấu trúc hóa học của 2 chất sạch F1, F2 được xác định dựa vào dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, DEPT và so sánh với tài liệu tham khảo. 3.2.1. Chất F1: Taraxerone Kết hợp với số liệu phổ khối phân giải cao 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC (Bảng 3.1, 3.2) chúng tôi đã xác định được công thức cấu tạo của chất F1 như sau: 3.2.1.1. Phân tích phổ 1H-NMR (CDCl3 δH ppm) Phổ 1H-NMR của chất F1 (500MHz, CDCl3), δH (ppm) cho các tín hiệu của một proton olefin ở δH: 5.56 (1H, dd, J = 8.0, 3.0 Hz, H-15) và tám nhóm methyl gắn với carbon bậc bốn ở δH: 1.14 (3H, s, H-27), 1.09 (3H, s, H-23), 1.08 (3H, s, H-25), 1.07 (3H, s, H-24), 0.96 (3H, s, H-29), 0.92 (3H, s, H-26), 0.91 (3H, s, H-30), 0.83 (3H, s, H-28). Trên phổ 1H-NMR không có tín hiệu cộng hưởng của proton thuộc nhóm hydroxymetin. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN Hình 3.1: Phổ 1H-NMR của chất F1