Luận văn Nghiên cứu thành phần loài tuyến trùng ký sinh trên cây lạc ở tỉnh Hưng Yên

đất phù sa không được bồi, màu nâu tươi, trung tính, ít chua, không glây hoặc glây yếu. Vùng này chiếm tỉ lệ 32 % diện tích đất canh tác của tỉnh, tập trung nhiều nhất ở Yên Mỹ, Khoái Châu, Văn Giang , Kim Động, Văn Lâm, Tiên Lữ, Ân Thi, Mỹ Hào. Loại đất này có độ phì cao, giàu các chất đạm, lân, tương đối nhiều mùn, thích hợp với việc trồng lúa, các loại hoa màu và cây công nghiệp như mía, đay, dâu, lạc [45]. 23 Chính vì vậy với những điều kiện thuận lợi trên nên cây lạc đã được trồng rất nhiều tại Hưng Yên nhưng có 3 vùng trọng điểm với diện tích trồng lạc lớn là: TP. Hưng Yên, Kim Động, Khoái Châu. Vì thế, chúng tôi đã tập trung thu mẫu và nghiên cứu về tuyến trùng lạc tại 3 khu vực chính này. Tình hình sản xuất cây lạc trong những năm gần đây ở tỉnh Hưng Yên Theo số liệu báo cáo mới nhất của Sở nông nghiệp và phát triển nông thôn tỉnh Hưng Yên cho thấy diện tích trồng cây lạc tại các huyện trong tỉnh như sau: Bảng 1.1. Diện tích trồng cây lạc ở tỉnh Hưng Yên trong năm 2012, 2013 Đơn vị tính: ha Huyện, thành phố Tổng diện tích đất trồng Diện tích lạc Năm 2012 Diện tích lạc 2013 Mỹ Hào 35 Văn Lâm 197 26,3 24 Yên Mỹ 464 42,1 23 Khoái Châu 2.040 428,8 370 Văn Giang 1.076 3 5 Ân Thi 190 Kim Động 1.386 105 108 Tiên Lữ 815 28,3 40 Phù Cừ 630 TP. Hưng Yên 567 123,81 130 Cộng 7.400 757,31 700 Qua bảng trên ta có thể thấy diện tích trồng cây lạc trong những năm gần đây có sự giảm đi đáng kể, cụ thể năm 2012 diện tích trồng cây lạc chiếm khoảng 10,2% so với tổng diện tích đất trồng, còn năm 2013 là 9,5%. Nguyên nhân gây giảm diện tích trồng cây lạc trong những năm gần đây là do xuất hiện một số dịch bệnh mới làm giảm năng suất cây lạc. Đồng thời ở một số huyện trọng điểm trồng cây lạc trong tỉnh có xu hướng chuyển đổi cây trồng sang cây có giá trị kinh tế cao hơn. Cụ thể ở 24 TP. Hưng Yên chuyển sang trồng cây ăn quả lâu năm, còn Huyện Kim Động chuyển sau trồng cây rau màu. Riêng có Huyện Khoái Châu nhờ phương pháp trồng xen canh cây lạc với một số loại cây khác như ngô, chuối, nghệ thì diện tích trồng cây lạc lại tăng lên so với các năm trước. Nhưng nhìn chung diện tích trồng cây lạc trong tỉnh vẫn giảm so với các năm trước. Nhìn vào bảng trên nhận thấy chỉ có 3 huyện là trồng nhiều cây lạc nhất gồm: Khoái Châu, Kim Động và TP. Hưng Yên. Cụ thể số liệu về diện tích trồng cây lạc nhiều nhất ở các xã trong từng huyện trên như sau: Bảng 1.2. Diện tích trồng cây lạc nhiều nhất ở các xã tại 3 khu vực Khoái Châu, Kim Động, T.P Hưng Yên trong năm 2013 Huyện, Thành phố Xã Diện tích (ha) H. Khoái Châu Chí Tân 214 Ông Đình 220 H. Kim Động Hiệp Cường 80 Chính Nghĩa 12 TP. Hưng Yên An Tảo 20 Bảo Khê 51 Căn cứ vào số liệu trên, chúng tôi đã tập trung thu mẫu đại diện ở 6 xã Chí Tân, Ông Đình (Khoái Châu), Hiệp Cường, Chính Nghĩa (Kim Động), An Tảo, Bảo Khê (TP. Hưng Yên) với diện tích trồng cây lạc nhiều nhất trong tỉnh. 25 Chương 2 - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm, thời gian nghiên cứu 2.1.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu Địa điểm: tiến hành điều tra, thu mẫu tại một số vùng trồng cây lạc chính ở tỉnh Hưng Yên. Cụ thể, tại huyện Khoái Châu gồm các xã chính: Chí Tân và Ông Đình. Huyện Kim Động: Chính Nghĩa và Hiệp Cường. TP. Hưng Yên: Bảo Khê và An Tảo. Hình 2.1. Sơ đồ thu mẫu Thời gian: đợt khảo sát thu mẫu tuyến trùng ký sinh trên cây lạc ở tỉnh Hưng Yên được triển khai vào ngày 31/03/2013 và thời gian nghiên cứu mẫu tại phòng thí nghiệm từ tháng 03/2013 đến 09/2013 tại Phòng Tuyến trùng học - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam. 26 2.1.2. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu Dụng cụ: xô nhựa, túi bóng, rây lọc với các kích thước lỗ rây từ 5 µm tới 40 µm, đĩa petri, giấy lọc, kính lúp, kính hiển vi soi nổi OLUMPUS SZ10, kính hiển vi quang học OLYMPUS BX51 gắn máy ảnh, tủ định ôn, đĩa đếm, cốc thủy tinh, pipetman, kim gắp, lamen, lam kính, máy xay, cân tiểu ly, kéo, bút Vật liệu: cồn tuyệt đối, glycerin, formalin (40%),triethanolamine, nước cất. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp thu mẫu Hầu hết tuyến trùng ký sinh di động được phát hiện ở bên trong rễ thực vật và ở vùng đất xung quanh rễ. Vì thế thu các mẫu rễ và mẫu đất ở những cây kém phát triển và cây khỏe mạnh, có độ sâu từ 15-20 cm từ mặt đất. Mỗi xã thu 3 ruộng đại diện, mỗi ruộng thu 3 điểm rồi trộn đất lại với nhau. Đất và rễ được giữ trong túi bóng và ký hiệu từng mẫu cụ thể để không bị nhầm lẫn giữa các ruộng. Sau đó mẫu sẽ để trong thùng mát vận chuyển về phòng thí nghiệm phân tách. Mẫu đất và mẫu rễ chứa chung trong một túi. Tổng số mẫu thu tại 3 vùng trồng lạc ở Hưng Yên là 18 tổ hợp mẫu. Mỗi tổ hợp mẫu như vậy bao gồm cả đất, rễ, cây và quả lạc đại diện cho một địa điểm nghiên cứu. Mẫu vật sau khi được mang về phòng thí nghiệm thì tôi tiến hành làm mẫu đất trước còn mẫu rễ được rửa sạch và bảo quản vào túi bóng trong tủ lạnh ở nhiệt độ 50C-100C, nếu cao quá hoặc thấp quá có thể ảnh hưởng không tốt đến tuyến trùng. Tránh tác động trực tiếp của tia nắng mặt trời. 2.2.2. Phương pháp tách tuyến trùng từ đất và mô thực vật Tách tuyến trùng từ đất Hầu hết các nhóm tuyến trùng ký sinh thực vật đều có mặt trong đất. Việc tách tuyến trùng từ đất luôn bắt buộc, vì qua đó có thể biết được hầu hết các nhóm tuyến trùng ký sinh ở thực vật. Từ mỗi mẫu thu được, lấy trung bình 250g đất để tiến hành 27 phân tích, kiểm tra mức độ gây hại và số lượng tuyến trùng ở đất. Thao tác tách tuyến trùng từ đất được áp dụng theo phương pháp của N.N. Châu (2003) [1, 2, 3]. Quy trình tách lọc được tiến hành như sau: - Chuẩn bị mẫu đất: mẫu đất được trộn đều, định lượng 250g. - Ngâm và hòa tan đất trong nước: cho mẫu đất vào một xô nhựa có dung tích 5 lít. Đổ thêm 1 lít nước vào, ngâm từ 30-60 phút tùy thuộc vào từng loại đất. Bóp vụn đất và khuấy đều, sau đó thêm 1,5-2 lít nước, tiếp tục khuấy đều. - Lọc thô loại bỏ cặn thô: dịch đất từ xô 1 được lọc qua rây lọc thô số 1 (đường kính rây 20cm x chiều cao 5cm, kích thước lỗ rây 0,5 µm) sang xô 2. Cặn trên rây được rửa lại bằng vòi nước sạch, sau đó lọai bỏ cặn đất và rác bẩn còn lại trên rây. - Gạn lọc: phần dung dịch đất có chứa tuyến trùng trong xô 2 tiếp tục được khuấy đều và gạn lọc từ xô 2 về xô 1 và tiếp tục như vậy 5-7 lần, tùy loại đất, cho đến khi loại bỏ hết cặn đất và cát nặng, chỉ còn lại dịch tuyến trùng ở dạng huyền phù. - Lọc lấy tuyến trùng từ dịch huyền phù: tiến hành lọc 3 lần để thu hết số lượng tuyến trùng. Lọc lần 1: đổ dung dịch huyền phù từ xô 1 sang xô 2 qua một rây lọc tinh số 2 (đường kính 20cm x chiều cao 5cm, kích thước lỗ rây 75-80 µm), phần nước đã lọc tinh lần 1 trong xô được giữ lại để lọc tinh lần 2. Phần cặn đất có tuyến trùng trên rây được rửa một cách cẩn thận cho đến khi sạch thì chuyển sang rây lọc tĩnh số 3 (đường kính 80µm x chiều cao 1,5µm, kích thước lưới lọc 87-80 µm) bằng bình rửa. Tất cả nước rửa tuyến trùng đều được hứng vào xô 1 để lọc lại. Lọc lần 2: dung dịch đất và nước rửa lần 1 tiếp tục được lọc qua rây 2, rửa sạch cặn (tiếp tục giữ lại nước rửa qua rây) chuyển tiếp cặn vào rây lọc tĩnh số 3. Lọc lần 3: nước rửa lần 2 được lọc và rửa qua (lần này không thu hồi nước rửa nên tốt nhất rửa ngược từ dưới đáy rây lên) rồi cẩn thận chuyển cặn thu được tiếp vào rây lọc số 3. - Lọc tĩnh: rây lọc 3 được đặt sẵn vào đĩa petri (đường kính 90 µm, cao 15 µm), sau khi thu nhận cặn tuyến trùng từ lần 3 lần lọc trên đây, điều chỉnh lượng nước vừa ngập cặn trên rây, đậy nắp và đặt trên tĩnh 48h ở nhiệt độ phòng. Tuyến trùng sống sẽ dễ dàng chui qua rây lọc, lắng đọng xuống đáy đĩa petri. 28 - Thu hoạch tuyến trùng: nhấc rây ra khỏi đĩa petri, thu lại dịch nước chứa tuyến trùng trong đĩa petri. Tách tuyến trùng từ mô thực vật Có nhiều nhóm tuyến trùng ký sinh chuyên hóa ở các bộ phận khác nhau của thực vật như rễ, thân, lá, hoa và hạt. Đối với cây lạc thì chúng chủ yếu ký sinh ở rễ và vỏ củ lạc. Vì vậy để thu thập tuyến trùng cần phải tách chúng ra khỏi mô rễ và mô vỏ củ lạc. Cũng giống như tách tuyến trùng từ đất, có hàng loạt phương pháp khác nhau để tách tuyến trùng từ mô thực vật. Ở đây tôi sử dụng phương pháp lọc tĩnh để tách lọc tuyến trùng từ mẫu rễ và mẫu vỏ củ lạc [1, 2, 3]. Các bước của phương pháp lọc tĩnh (Theo N.N. Châu và N.V. Thanh, 1993) [2]: Đối với mẫu rễ: sau khi rửa sạch bằng vòi nước hoa sen một cách cẩn thận thì rễ cắt nhỏ khoảng 2-5 cm, trộn đều, định lượng lấy 5gr. Sau đó thêm 250ml nước sạch, cho vào máy nghiền với tốc độ 12.600 vòng trong 30 giây. - Cho dung dịch đã được xay nhỏ lọc qua rây 40 µm để lọc lấy phần cặn rễ và gạn lọc lấy tuyến trùng ở dung dịch huyền phù còn lại. Sau đó tất cả được cho vào rây lọc tĩnh và đặt rây vào đĩa petri, thêm một lượng nước sạch vừa đủ ngập phần rễ đã xay và đặt tĩnh ở nhiệt độ phòng, tuyến trùng sẽ từ rễ chui qua rây lọc xuống đĩa petri. Sau 48h nhấc rây lọc ra, thu phần nước có tuyến trùng ở trong đĩa petri. Đối với mẫu củ: sau khi được rửa sạch bằng nước, vỏ củ lạc sẽ được tách riêng nhân hạt và được bẻ nhỏ khoảng từ 0,5-0,8 cm. Trộn đều rồi định lượng khối lượng vỏ củ là 10 gr, sau đó cho vào rây lọc tĩnh (kích thước lỗ rây 85 µm). - Đặt rây vào đĩa petri, thêm một lượng nước sạch vừa đủ để ngập vỏ củ và đặt tĩnh ở nhiệt độ phòng, tuyến trùng sẽ từ mô vỏ chui qua rây lọc xuống đĩa petri. Sau 48h nhấc rây lọc ra, thu phần nước có tuyến trùng ở trong đĩa petri. 2.2.3. Phương pháp cố định, xử lý tuyến trùng và làm tiêu bản Cố định tuyến trùng 29 Cố định tuyến trùng: tuyến trùng kí sinh thực vật thu được từ các phương pháp tách lọc nêu trên được đưa vào dung dịch TAF để cố định và bảo quản (Courtney, Polley & Miller,1955) [2, 3]. TAF: Formalin (40 %) 7ml Triethanolamine 2ml Nước cất 91 ml Tuyến trùng được cố định bằng TAF sẽ giữ được hình dạng kích thước giống như thật. Trong dung dịch này, tuyến trùng giữ được sự ổn định trong một thời gian dài. Triethanolamine có khả năng trung hòa axit formic tự do và hút ẩm, bảo vệ mẫu không bị khô ngay cả trong trường hợp dung dịch cố định bị bay hơi. Tuy nhiên, có hiện tượng thoái hóa cutin xảy ra sau vài năm, vì vậy nó không nên dùng đối với những mẫu cần bảo quản trong thời gian dài. Xử lý tuyến trùng theo quy trình của Seinhorst (1959) Trước khi xử lý tuyến trùng cần chuẩn bị dung dịch I và dung dịch II như sau: Dung dịch I: Cồn 96 % 20ml Glycerin 1ml Nước cất 79ml Dung dịch II: Cồn 96 % 95ml Glycerin 5ml Chuyển tuyến trùng từ dung dịch cố định sang chén nhuộm hoặc đĩa thủy tinh sâu có chứa 0,5 ml dung dịch I. Đặt chén hoặc đĩa này trong bình thủy tinh đậy kín có chứa khoảng 1/10 thể tích là cồn 96% và áp suất bão hòa. Đặt toàn bộ bình thủy tinh có các chén chứa tuyến trùng trong tủ ấm thời gian tối thiểu 12 giờ và nhiệt độ 400C. Ở trạng thái này hầu như toàn bộ nước sẽ được bay hơi (cồn 20% sẽ hút cồn từ áp suất bão hòa và nước sẽ được bay hơi và bị hút lại bởi cồn 96% trong bình hút ẩm) và làm cho tuyến trùng được ở trong khối lượng dung dịch cồn và glycerol lớn hơn khối lượng dung dịch I ban đầu. 30 Sau 12 giờ đặt trong bình hút ẩm chuyển các chén tuyến trùng ra khỏi bình và tiếp tục đặt trong tủ ấm để dung dịch bay hơi. Thời gian xử lý bay hơi trong tủ ẩm tốt nhất là 12 giờ, cứ mỗi 3 giờ bổ sung thêm vào chén một lượng dung dịch II cho gần đầy chén và đậy nắp chỉ để hở một phần cho phép sự bay hơi của cồn diễn ra từ từ, duy trì tối thiểu 3-6 giờ tại nhiệt độ 400C. Sau khi tuyến trùng chỉ còn lại trong glycerol có thể sử dụng làm tiêu bản được. Chuẩn bị tiêu bản tuyến trùng cho quan sát, định loại Tuyến trùng sau khi đã xử lý hết nước có thể được làm thành tiêu bản cố định trong dung dịch lactophenol hoặc glycerol. Nhưng glycerol thường được sử dụng phổ biến nhất. - Dùng ống đồng để khoanh các vòng paraphin lên lam kính. - Đặt một giọt nhỏ glycerol tinh khiết ở giữa vòng paraphin - Gắp một số tuyến trùng (tốt nhất cùng loại) vào giọt glycerol. Số lượng tuyến trùng phụ thuộc vào kích thước của tuyến trùng và yêu cầu quan sát, nhưng thường không vượt quá 10 tuyến trùng một tiêu bản. Sau khi gắp đủ lượng tuyến trùng đưa lam lên kính hiển vi soi nổi để sắp xếp lại tuyến trùng sao cho tuyến trùng được xếp cùng chiều và không bị đè lên nhau. - Đặt một vài mảnh sợi thủy tinh để đỡ tuyến trùng. - Đậy lamen một cách cẩn thận, tốt nhất nghiêng lamen khoảng 450C và một đầu tiếp xúc trước, hạ dần đầu kia sao cho khí không bị lẫn vào giọt glycerol. - Đặt lam kính lên thanh nhiệt (650C trong vài phút) được đốt nhẹ bằng đèn cồn bên dưới, paraphin sẽ chảy đều và gắn lamen. Chú ý: lượng paraphin và glycerol sao cho vừa phải và phù hợp với kích thước của tuyến trùng để paraphin không bị thừa và trào ra ngoài. 2.2.4. Phương pháp đếm và kỹ thuật gắp tuyến trùng Đếm tuyến trùng Tuyến trùng được đếm và tính số lượng bằng đĩa đếm tuyến trùng (counting dish) và đồng hồ đếm (counting machine) dưới kính hiển vi soi nổi. Trong trường hợp mẫu 31 có ít tuyến trùng (<1000) có thể đổ cả tuyến trùng vào đĩa để đếm. Sau khi lắc nhẹ cho dung dịch tuyến trùng dàn đều, có thể đếm toàn bộ tuyến trùng theo các dãy ô cho toàn bộ đĩa đếm hoặc có thể đếm đại diện một số ô hoặc dãy, sau đó tính trung bình 1 ô và nhân với tổng số ô trong đĩa. Trong trường hợp mẫu có quá nhiều tuyến trùng thì ta có thể pha loãng dung dịch tuyến trùng thành 50ml, sau đó lấy 10ml để đếm, lập lại lần 2 như vậy, tính trung bình số lượng tuyến trùng trên 10ml và nhân với 5. Kỹ thuật gắp tuyến trùng Đa số tuyến trùng có kích thước rất nhỏ nên phải gắp tuyến trùng dưới kính hiển vi ở độ phóng đại thích hợp. Để có thể gắp được dễ dàng cần điều chỉnh lượng dung dịch tuyến trùng dưới đĩa đếm ở mức vừa phải ( thường 10ml cho đĩa đếm tiêu chuẩn của CHLB Đức) sao cho mức nước trong đĩa không quá sâu cũng không nông quá. Đầu tiên dùng tay phải cầm kim gắp tuyến trùng đưa mũi kim vào bên dưới ở giữa cơ thể tuyến trùng đẩy nhẹ để tuyến trùng nổi lên bề mặt dung dịch, đồng thời tay trái điều chỉnh kính bám theo sự nổi lên của tuyến trùng, sau đó đưa kim gắp từ phía dưới vớt tuyến trùng cho vào dung dịch I trong chén đựng. Trước khi gắp tuyến trùng tiếp theo nên kiểm tra đầu kim gắp xem tuyến trùng đã được chuyển vào chén hay vẫn còn dính ở đầu kim. Đối với một số loại tuyến trùng dạng xoắn thường khó gắp hơn nên thường phải đưa chính xác đầu kim vào lỗ vòng tròn của tuyến trùng mới vớt lên được. Gió mạnh có thể làm cho bề mặt dung dịch chuyển động hoặc có thể làm bay mất tuyến trùng ở đầu kim nên cần che gió lại mới gắp tuyến trùng được.Đối với loại tuyến trùng hình tròn như con cái của tuyến trùng gây nốt sần không gắp được mà phải dùng pipet, panh siêu nhọn hoặc chổi lông nhỏ để gắp hoặc hút vớt chúng [1, 2]. 2.2.5. Phương pháp định loại tuyến trùng dựa vào hình thái Công thức số đo tuyến trùng Một trong những chỉ tiêu quan trọng dùng để phân loại tuyến trùng, đặc biệt phân loại đến loài là công thức số đo tuyến trùng. Công thức số đo tuyến trùng là hệ thống các chỉ số đo kích thước các phần cơ thể và tỷ lệ tương quan giữa các phần của chúng. Công thức số đo được áp dụng rộng rãi để phân loại và là phần bắt buộc khi mô tả một 32 loài tuyến trùng. Có một số công thức số đo khác nhau được áp dụng trong đó công thức theo de Man (1880) với sự cải tiến bổ sung được áp dụng phổ biến nhất [4]. Ý nghĩa của các chỉ số được xác định như sau (theo de Man): n = số lượng mẫu vật đo được. L= tổng chiều dài cơ thể bằng µm hoặc mm. a = chiều dài cơ thể ÷ chiều rộng lớn nhất (thường là vị trí vulva). b = chiều dài cơ thể ÷ chiều dài từ đỉnh đầu cơ thể đến van ruột – thực quản. b’ = chiều dài cơ thể ÷ chiều dài từ đỉnh đầu cơ thể đến tận cùng thực quản tuyến c = chiều dài cơ thể ÷ chiều dài đuôi. c’= chiều dài đuôi ÷ chiều rộng cơ thể tại hậu môn. V = chiều dài cơ thể từ đỉnh đầu đến vulva x 100 ÷ chiều dài cơ thể. T= chiều dài từ huyệt đến đỉnh testis x 100 ÷ chiều dài cơ thể. st= chiều dài stylet bằng µm. Một số chỉ số đôi khi được sử dụng cho một số nhóm tuyến trùng khác nhau: a’= chiều dài cơ thể ÷ chiều rộng cơ thể không dính cutin (như ở Trichodorids hoặc gai cutin như ở Criconema spp.) (Mehta & Raski, 1971). b1= chiều dài cơ thể (chiều dài từ đỉnh đầu đến gốc diều giữa). G1= tổng chiều dài của nhánh sinh dục trước từ vulva đến đỉnh buồng trứngtính qua cả phần gập (nếu có) x 100 ÷ chiều dài cơ thể. G2= tổng chiều dài của nhánh sinh dục sau x 100 ÷ chiều dài cơ thể. H= chiều dài vùng sáng (hyaline) ở tận cùng đuôi. M= chiều dài phần trước của stylet (conus) x 100 ÷ tổng chiều dài stylet. O = chiều dài từ gốc stylet đến lỗ đổ của tuyến thực quản lưng x 100 ÷ tổngchiều dài stylet P = chiều dài từ phasmid đến hậu môn x 100 ÷ chiều dài đuôi (giá trị + hoặc là trước hoặc sau hậu môn). Pa = chiều dài từ đỉnh đầu đến phasmid trước (trường hợp lệch nhau) x 100 ÷ chiều dài cơ thể. Pp = chiều dài từ đỉnh đầu đến phasmid sau x 100 ÷ chiều dài cơ thể. S = chiều dài stylet ÷ chiểu rộng cơ thể ở gốc stylet. MB = chiều dài từ đỉnh đầu đến diều giữa x 100 ÷ tổng chiều dài thực quản. 33 Một số chỉ số được sử dụng cho họ Criconematidae (De Grisse, 1964): R = số lượng vòng cơ thể. RB = chiều rộng một vòng cutin. Rst = số vòng từ đầu đến gốc stylet. Roes = số vòng từ đầu đến gốc thực quản. Rex = số vòng từ đầu đến lỗ bài tiết. RV = số vòng từ đầu đến vulva. Ran = số vòng đuôi. RVan = số vòng từ vulva đến anus. Một số thuật ngữ được dùng trong mô tả hình thái: Anastoma: Cấu trúc nối vòng cutin dạng gân lá Areolation: Dạng cấu trúc phân ô của đường bên được tạo thành do các vạch cutin ngang cắt các đường bên của vùng bên Cutin: Lớp vỏ bọc bên ngoài cơ thể tuyến trùng không có cấu trúc tế bào Deirid: Là một nhú cổ lớn, một dạng cấu trúc thụ cảm bên nằm gần vòng thần kinh Epiptigma: Cấu trúc màng vulva Hemizonid: Cấu trúc có hình bán cầu nằm gần lỗ bài tiết phía bụng, nó có dạng một tấm sáng nằm dưới lớp biểu bì, trong lát cắt dọc dạng lồi hai cạnh và khúc xạ ánh sáng rất mạnh được nối giữa các bó thần kinh của hệ thần kinh trung ương Isthmus: Phần thắt eo của thực quản Kitin: Chất xương, chỉ mức độ hóa xương Monodelphic-prodelphic: Kiểu hệ sinh dục cái đơn với một buồng trứng ở phía sau Phasmid: Là cấu trúc dạng lỗ nằm ở khoảng giữa bên đuôi được nối với tuyến trước đuôi, có chức năng cảm thụ hóa học Rectum: Ruột thẳng, trực tràng Stylet: Kim hút-một cấu trúc hút dạng ống được hình thành từ xoang miệng 34 TAF: Dung dịch cố định tuyến trùng có thành phần từ Formalin (7 phần), Triethanolamine (2 phần) và nước (9 phần) Vagina: Âm đạo, ống sinh dục được bao phủ bằng lớp cutin và được nối với tử cung Vulva: Âm hộ, lỗ sinh dục cái Phương pháp đo tuyến trùng Tất cả các số đo đều được thực hiện qua kính hiển vi với độ phóng đại khác nhau. Để đo tuyến trùng có thể tiến hành theo 2 cách: Đo trực tiếp bằng trắc vi thị kính: dùng một thị kính có lắp thước đo để đo trực tiếp các cấu trúc của tuyến trùng. Để đo được các cấu trúc dài như chiều dài cơ thể tuyến trùng cần đo từng đoạn và dịch chuyển liên tiếp cho đến khi hết toàn bộ phần cần đo. Tuy vậy, phương pháp này chỉ phù hợp để đo các phần nhỏ và có cấu trúc thẳng của tuyến trùng. Việc đo dịch chuyển từng đoạn sẽ bị sai số nhiều vì khó định vị các điểm nối trong các lần dịch chuyển. Đo qua máy vẽ: để đo được trước hết vẽ toàn bộ hoặc các phần cần đo qua máy vẽ được lắp vào kính hiển vi, sau đó tiến hành đo trên bản vẽ bằng một thước phân đến µm bằng giấy hoặc vải có thể uốn cong theo hình dạng của tuyến trùng. Phương pháp này đòi hỏi có mãy vẽ nhưng cho phép đo cả chiều dài của tuyến trùng và có thể đo cả các cấu trúc cong. Để tính được kích thước của tuyến trùng ở cả 2 cách đo trên cần lập các bảng hệ số đo quy đổi được xác định cho từng loại kính, từng loại vật kính với các độ phóng đại khác nhau [4]. 2.2.6. Xử lý số liệu Đánh giá vai trò của các loài tuyến trùng ký sinh gây hại chính đối với cây lạc được xử lý thống kê theo chương trình SPSS 13. Mật độ tuyến trùng ký sinh trong đất và trong rễ được chuyển sang log(x+1) và các chỉ số như tỷ lệ hoại tử rễ, củ được chuyển sang arcsin(x/100)^(1/2) trước khi xử lý thống kê. Tần số xuất hiện (TSXH) của loài tuyến trùng được tính theo công thức: TSXH = (N – count if)/N * 100 (trong đó, N = tổng số mẫu thu được). 35 Chương 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thành phần loài tuyến trùng ký sinh trên cây lạc ở tỉnh Hưng Yên Kết quả phân tích 18 tổ hợp mẫu (gồm đất, rễ và quả / củ lạc) tại 3 địa điểm thuộc 3 vùng trồng cây lạc của tỉnh Hưng Yên chúng tôi đã xác định11 loài tuyến trùng ký sinh thuộc 5 giống, 5 họ của phân bộ tuyến trùng Tylenchina, bộ Rhabditida. Dưới đây là Danh sách các loài tuyến trùng ký sinh ở cây lạc Hưng Yên được xếp theo Hệ thống phân loại tuyến trùng của De Ley & Blaxter (2002) [16]: Bảng 3.1. Danh sách các loài tuyến trùng ký sinh cây lạc ở Hưng Yên BỘ RHABDITIDA (PHÂN BỘ TYLENCHINA Thorne, 1949) Họ Anguinidae Nicoll, 1935 Giống Ditylenchus Filipjev, 1936 1 Ditylenchus anchilisposomus (Tarjan, 1958) Fortuner, 1982 2 Ditylenchu s ausafi Husain & Khan, 1967 3 Ditylenchus equalis Heyn, 1964 Họ Belonolaimidae Whitehead, 1960 Giống Tylenchorhynchus Cobb, 1913 4 Tylenchorhynchus clavicaudatus Seinhorst, 1963 5 Tylenchorhynchus dispersus Siddiqi & Sharma,1995 6 Tylenchorhynchus leviterminalis Siddiqi, Mukherjee & Dasgupta, 1982 Họ Hoplolaimidae Filipjev, 1934 Giống Helicotylenchus Steiner, 1945 7 Helicotylenchus laevicaudatus Eroshenko & Nguyen, 1981 Họ Pratylenchidae Thorne, 1949 Giống Pratylenchus Filipjev, 1936 8 Pratylenchus brachyurus (Godfrey, 1929) Filipjev & Sch. Stekhoven, 1941 9 Pratylenchus neglectus (Rensch, 1924) Filịpev & Sch. Stekhoven, 1941 Họ Criconematidae Thorne, 1949 Giống Criconemellade Grise & Loof, 1965 10 Criconemella onoensis (Luc, 1959) Luc & Raski, 1981 11 Criconemella sphaerocephala (De Grisse, 1967) Luc & Raski, 1981 36 3.2. Một số đặc điểm hình thái của các loài tuyến trùng ký sinh ở cây lạc Hưng Yên 3.2.1. Giống Ditylenchus Filipjev, 1936 Hiện ở Việt Nam đã xác định được 5 loài. Định loại các loài trong giống Ditylenchus theo khóa định loại của tác giả N. N. Châu và N. V. Thanh (2000) [4]. Loài Ditylenchus anchilisposomus (Tarjan, 1958) Fortuner, 1982 Mẫu nghiên cứu và số đo: Mẫu tuyến trùng trên cây lạc Hưng Yên: Con cái (n =1): L = 760 µm; a = 42; b = 5,9; c = 14,6; c’ = 5,3; V = 80,6 %; st = 8,3 µm. Các số đo tham khảo: Theo Zeidan & Geraert, 1991 [4]: Con cái (n =8): L = 645 (505-850) µm. a = 31 (27-34); b = 6,1 (4,7-7,1); b’ = 4,8 (3,6-6,0); c = 16,3 (13,3-19,9); c’ = 3,3 (2,7-3,9); V = 82 (81-84) %; st = 8,0 (7,0-8,5) µm; MB = 30-36 (34). Theo Pham T. B, 1988 (mẫu Việt Nam) [4]: Con cái (n =4): L = 821 (768-868) µm; a = 46 (39-54,3); b = 6,1 (5,9-6,2); c = 13,1 (12,8-13,6); c’ = 5,7 (5,6-5,8); V = 78,3 (73,4-82,6) %; st = 8-8,5 µm. Nhận xét: So với các mẫu nghiên cứu trước đây của một số tác giả khác, thì loài D. anchilisposomus ở trên cây lạc Hưng Yên có những đặc điểm chính sau : Con cái: cơ thể cong về phía bụng khi cố định. Vỏ cutin với những đường khía ngang nhạt mờ, hầu như là khó nhìn thấy trên toàn bộ cơ thể. Vùng bên có 6 đường rõ ràng. Vùng môi thấp, phía trước bẹt không có khía, nối tiếp với đường viền cơ thể. Stylet mảnh, gốc stylet nhỏ, tròn, hơi hướng về phía sau. Diều giữa hình oval.Vị trí 37 trung tâm của thực quản có hình thìa rộng, thùy lớn phủ lên phần đầu của ruột từ phía bên với 1 nhân tuyến thực quản lưng lớn nằm phía sau của van thực quản ruột.Vị trí lỗ bài tiết thay đổi từ đối diện với phần sau của isthmus đến phần trước thực quản tuyến. Hemizonid lồi lên, chiếm 2 vòng cutin ngay tại vị trí lỗ bài tiết hoặc 1 vòng phía trước của lỗ bài tiết.Vulva nằm phía sau cơ thể.Vagina vuông góc với trục của cơ thể. Buồng trứng kéo dài với noãn bào xếp thành 1 hàng. Đuôi hình chóp dài, thuôn dần và hơi uốn cong về phía bụng. (a) (b) (c) Hình 3.1. Ảnh chụp kính hiển vi của Ditylenchus anchilisposomus (a): phần đầu cơ thể con cái (x 400), (b): phần đuôi cơ thể con cái (x 1000), (c): toàn bộ cơ thể con cái (x 200) ( Ảnh chụp: Tạ Thị Mai Anh). Con đực: không thấy ở quần thể cây lạc tại Hưng Yên. 38 Cây chủ: ngoài cây lạc, chúng còn ký sinh trên khoai tây [4]. Phân bố: - Việt Nam: Đà Lạt (Lâm Đồng), Hưng Yên. - Thế giới: Mỹ, Sudan [4]. Loài Ditylenchus ausafi Husain & Khan, 1967 Mẫu nghiên cứu và số đo: Mẫu tuyến trùng trên cây lạc Hưng Yên: Con cái (n =1): L =590 µm; a = 36,1; b = 5,8; c = 14,6; V = 74 %; st = 9 µm. Các số đo tham khảo: Theo Husain & Khan, 1967 [4]: