Luận văn Nghiên cứu thu nhận enzym anpha – amylase từ trực khuẩn cỏ khô

điều kiện chuẩn là 500C, pH=6. • Hoá chất Dung dịch NaH2PO4 0,05M Dung dịch Na2HPO4 0,05M Dung dịch đệm phosphate 0,05M pH 6: trộn 87,7ml dung dịch NaH2PO4 0,05M và 12,3ml dung dịch Na2HPO4 0,05M thêm 100ml nước cất, đo lại pH. Dung dịch tinh bột 1% pha trong pH 6: lấy 50ml dung dịch đệm phosphate 0,05M pH 6 đem đun sôi. Cân 1g tinh bột tan, hoà vào một ít đệm, khuấy đều, đổ vào dung dịch đệm đang sôi, vừa khuấy vừa đun sôi trong 3 phút cho đến khi dung dịch trong suốt. Định mức tới 100ml bằng dung dịch đệm. Dung dịch iod: 1g I2 và 2g KI, thêm nước thành 100ml, bảo quản lạnh. Khi dùng pha loãng 500 lần. Dung dịch HCl 1N: 8,4ml HCl đậm đặc pha thành 100ml. Dung dịch HCl 0,1N: pha loãng từ dung dịch HCl 1N. • Tiến hành thí nghiệm Dựng đường chuẩn tinh bột Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 Tinh bột 1% (ml) 0 1 2 3 4 5 Dung dịch đệm (ml) 10 9 8 7 6 5 Hàm lượng tinh bột (mg/ml) 0 1 2 3 4 5 - Hút 1ml dung dịch từ các ống nghiệm, thêm vào 5ml dung dịch I2KI đã pha loãng 500 lần. Đem so màu ở bước sóng 560nm. -Vẽ đồ thị tương quan giữa hàm lượng tinh bột và giá trị ΔOD. Phản ứng enzym Thử thật (3 ống) Thử không (3 ống) Tinh bột 1% (ml) 5 5 Dung dịch enzym (ml) 0,5 0 Để ổn nhiệt ở 500C, 10 phút Dung dịch HCl 0,1N (ml) 5 5 Dung dịch enzym (ml) 0 0,5 - Hút 1ml dung dịch từ các ống nghiệm trên, thêm vào mỗi ống 5ml dung dịch I2KI đã pha loãng. - Lắc đều, đem đo OD tại bước sóng 560nm. • Công thức tính: hoạt độ α-amylase trong 1ml dịch enzym HđA vt KVX * ** = Trong đó: X: số mg tinh bột suy ra từ đường chuẩn. V: tổng thể tích hỗn hợp phản ứng enzym (10,5ml). t: thời gian enzym phản ứng (10 phút). v: thể tích enzym cho vào hỗn hợp phản ứng enzym (0,5ml). K: hệ số pha loãng. 2.3.7. Các phương pháp nghiên cứu xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu [5], [12], [14], [20], [21], [45]. Khả năng sinh trưởng và sinh amylase không chỉ phụ thuộc vào chủng giống VSV mà điều kiện nuôi cấy cũng ảnh hưởng rất nhiều. Do đó chúng tôi tiến hành các thí nghiệm sau để xác định các điều kiện nuôi cấy tối ưu để chủng nghiên cứu sinh trưởng và sinh amylase tốt nhất. 2.3.7.1. Loại cơ chất Tiến hành nuôi cấy chủng đã chọn trong môi trường sinh tổng hợp amylase có chất cảm ứng khác nhau: bột gạo, bột mỳ, bột bắp, tinh bột tan ở nhiệt độ 37oC với chế độ lắc 200 vòng/phút. Sau mỗi mốc thời gian: 20h, 30h, 40h, 45h, 50h, 55h, 60h, 70h đo OD620 xác định khả năng sinh trưởng, và ly tâm loại bỏ sinh khối ở 5000 v/p trong 15 phút lấy dịch enzym để xác định hoạt độ amylase theo phương pháp Heinkel. Chọn loại cơ chất và thời gian nuôi cấy thích hợp thu amylase có hoạt độ cao nhất. 2.3.7.2. Nồng độ cơ chất Nuôi chủng đã chọn trong môi trường sinh tổng hợp amylase có chứa loại cơ chất thích hợp như đã xác định ở thí nghiệm 2.3.7.1 với nồng độ khác nhau: 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5% trên máy lắc với chế độ lắc 200 vòng/phút ở nhiệt độ 37oC. Sau thời gian tối ưu được xác định ở mục 2.3.7.1 đo OD620 xác định khả năng sinh trưởng và đo hoạt độ amylase theo phương pháp Heinkel. Từ đó xác định được nồng độ cơ chất tối ưu cho khả năng sinh amylase của chủng đang nghiên cứu . 2.3.7.3. Nhiệt độ Chủng đã chọn được nuôi trong môi trường sinh tổng hợp amylase có chứa loại cơ chất với nồng độ thích hợp như đã xác định ở mục 2.3.7.1 và 2.3.7.2 ở nhiệt độ khác nhau: 25 – 280C; 30 – 330C; 35 – 370C; 40 – 420C trên máy lắc 200 vòng/phút. Sau thời gian thích hợp đo OD620 xác định sự sinh trưởng và đo hoạt độ amylase theo phương pháp Heinkel. Từ đó suy ra nhiệt độ tối ưu cho chủng đang nghiên cứu sinh amylase. 2.3.7.4. pH ban đầu Nuôi chủng đã chọn trên môi trường sinh tổng hợp amylase có các điều kiện nuôi cấy tối ưu như đã xác định ở các thí nghiệm trên, với pH ban đầu khác nhau: từ 5,0 đến 8,5 (mỗi bước nhảy là 0,5) trên máy lắc với chế độ 200 vòng/phút với thời gian thích hợp. Tiến hành xác định sự sinh trưởng và hoạt độ amylase. Từ đó vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên của hoạt độ amylase theo pH. Suy ra pH ban đầu tối ưu cho chủng đã chọn sinh amylase. 2.3.7.5. Độ hiếu khí Chủng vi khuẩn đã chọn được nuôi trong môi trường sinh tổng hợp amylase với các điều kiện nuôi cấy tối ưu như đã xác định ở các thí nghiệm trên trong các bình tam giác 500ml với dịch lên men có thể tích khác nhau : 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300ml trên cùng máy lắc với chế độ 200 vòng/phút, cùng thời gian thích hợp. Xác định sự sinh trưởng và hoạt độ amylase, kết quả thí nghiệm này cho phép xác định được tỉ lệ thể tích dịch lên men và thể tích bình nuôi cấy tối ưu để thu được hoạt độ amylase cao nhất. 2.3.7.6. Ảnh hưởng của các loại muối • Nồng độ NaCl Nuôi chủng đã chọn trong môi trường cảm ứng sinh amylase với các điều kiện tối ưu, có nồng độ muối NaCl thay đổi: 0; 0,03; 0,05; 0,08; 0,1; 0,12% trên cùng máy lắc với chế độ 200 vòng/phút . Sau thời gian thích hợp xác định khả năng sinh trưởng và hoạt độ amylase. Suy ra nồng độ NaCl tối ưu cho khả năng sinh amylase. • Nồng độ CaCl2 Chủng nghiên cứu được nuôi trong môi trường cảm ứng có nồng độ muối CaCl2 khác nhau: 0; 0,01; 0,015; 0,02; 0,025% trên máy lắc 200 vòng/phút và các điều kiện nuôi cấy tối ưu đã xác định ở các thí nghiệm trên. Sau thời gian phù hợp đo khả năng sinh trưởng và hoạt độ amylase. Từ đó kết luận được nồng độ CaCl2 tối ưu để sinh amylase có hoạt độ cao. 2.3.7.7. Nồng độ NaCl ức chế sinh trưởng Nuôi chủng đã chọn trên môi trường MPA có nồng độ muối NaCl khác nhau: từ 1% đến 7% (mỗi bước nhảy 1%) với điều kiện nhiệt độ, pH thích hợp trên máy lắc 200 vòng/phút. Sau thời gian sinh trưởng tối ưu như đã xác định ở mục 2.3.7.1 tiến hành đo pH và sự sinh trưởng OD620, so sánh với pH và OD620 của môi trường MPA. Từ đó xác định được nồng độ NaCl cao nhất ức chế sự sinh trưởng của chủng nghiên cứu. 2.3.8. Phương pháp phân loại để xác định loài của chủng đã tuyển chọn [20]: sử dụng kỹ thuật PCR  Nguyên tắc: Khuếch đại một trình tự lên nhiều lần bằng một cặp mồi chuyên biệt. Phản ứng PCR là một chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 bước: • Bước 1 (biến tính): trong một dung dịch đầy đủ thành phần cho sự sao chép, DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tmax của phân tử, thường là 94- 950C trong vòng 30s-1phút. • Bước 2 (lai): nhiệt độ được hạ thấp để các mồi bắt cặp với khuôn, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40-700C và kéo dài 30s-1phút. • Bước 3 (tổng hợp): nhiệt độ được nâng lên đến 720C để DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài ngắn của trình tự DNA, thường kéo dài từ 30s đến vài phút.  Giải trình tự các axit nucleic Các phương pháp nhằm xác định trình tự axit nucleic đều dựa vào 2 nguyên tắc: • Nguyên tắc hoá học (phương pháp Maxam và Gilbert): dựa vào các phản ứng thuỷ giải hoá học đặc hiệu phân tử DNA, tạo thành một tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước chênh nhau 1 nucleotide. • Nguyên tắc enzym học (phương pháp Sanger và các phương pháp cải biên): dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ DNA polymerase. Với việc tổng hợp thêm các dideoxynucleotide cùng với các deoxynucleotide thông thường, kết quả tổng hợp cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước chênh nhau 1 nucleotide. Ở cả 2 phương pháp trên, các phân đoạn DNA sẽ được phân tách qua điện di trên gel polyacrylamid. Nếu sử dụng đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ thì kết quả trình tự cần xác định sẽ được đọc trên bản phóng xạ tự ghi từ bản điện di. 2.3.9. Phương pháp nghiên cứu động học Với các điều kiện tối ưu đã xác định được ở mục 2.3.7 sẽ tiến hành nuôi cấy chủng sản – chủng đã tuyển chọn có hoạt độ enzym α - amylase cao nhất - trong bình lên men tam giác 1lít. Chúng tôi sẽ nghiên cứu động học quá trình sinh tổng hợp α – amylase với 3 thông số là pH, sinh trưởng và hoạt độ amylase. Qua các mốc thời gian: 20, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70h tiến hành đo pH, đo OD620 khả năng sinh trưởng, và ly tâm tách sinh khối để đo hoạt độ amylase theo phương pháp Heinkel. 2.3.10. Phương pháp thu dịch chiết α – amylase thô từ môi trường nuôi cấy [7], [11]. Sau khi thu nhận được dịch nuôi cấy vi khuẩn, đem ly tâm 5000 vòng/ phút trong 15 phút để loại bỏ sinh khối, thu nhận phần dịch bên trên, dung dịch này được sử dụng như dịch enzym α – amylase thô và được bảo quản ở 40C. 2.3.11. Phương pháp thu nhận chế phẩm enzym (CPE) α - amylase từ dịch chiết enzym thô bằng các tác nhân tủa [4], [11] Các tác nhân tạo tủa enzym thường được sử dụng là các dung môi hữu cơ: etanol, aceton; muối trung tính (NH4)2SO4 để thu nhận chế phẩm enzym từ dịch chiết enzym thô. Từ đó so sánh và chọn tác nhân gây tủa thích hợp.  Nguyên tắc: dựa vào tính hoà tan của protein. Trong phân tử protein có đồng thời các nhóm kỵ nước (gốc alkyl) làm cho protein không tan trong nước, và nhóm ưa nước (-COOH, -OH,…) làm cho protein tan trong nước. Các tác nhân tủa enzym có thể ảnh hưởng đến tính hoà tan của protein như sau: • Dung môi hữu cơ: chúng có thể hoà tan hoặc gây tủa protein. Ví dụ khi thêm những chất làm tăng hằng số điện môi của nước như glycin, làm tăng khả năng ion hoá từ đó tăng độ hoà tan của protein. Ngược lại, nếu thêm chất làm giảm hằng số điện môi của nước như etanol, aceton,…sẽ làm giảm tính hoà tan của protein. • Muối trung tính: nồng độ muối quá cao sẽ làm giảm độ hoà tan của protein. Tóm lại, nguyên nhân gây tủa protein là do lớp hydrate bao phủ protein bị tác nhân gây tủa giành lấy. Các protein bị mất vỏ hydrate sẽ kết hợp với nhau và kết tủa xuống. Do đó, đưa tác nhân tủa dần dần vào dung dịch enzym thô theo từng nồng độ khác nhau để thu nhận từng loại protein.  Cách tiến hành • Đối với các tác nhân tủa là etanol 96o, aceton Dùng 600 ml dịch enzym thô, chia làm hai phần bằng nhau, một phần tủa với etanol, phần còn lại tủa với aceton. Dịch chiết enzym và các dung môi hữu cơ đều được giữ lạnh khoảng 4oC. Cho từ từ etanol 96o hoặc aceton vào dịch chiết enzym với tỉ lệ thể tích dung môi và dịch chiết enzym là 3:1. Khuấy đều hỗn hợp và để yên trong điều kiện lạnh khoảng 1h, sau đó đem ly tâm với 5000 vòng/phút trong 15 phút. Thu lấy phần cặn tủa, sấy khô bằng cách thổi quạt gió ở < 40oC (vì nước tồn tại trong đó sẽ làm giảm hoạt độ enzym), cân trọng lượng chế phẩm enzym, và bảo quản trong điều kiện lạnh. • Đối với tác nhân tủa là muối sunphat amon Lấy 300 ml dịch enzym thô đem tủa với muối sunphat amon (47,2g/100ml dịch enzym). Muối sunphat amon được cho từ từ lượng nhỏ vào dịch chiết enzym và khuấy đều ở nhiệt độ phòng. Thời gian tủa là 2 giờ, sau đó đem ly tâm 5000 vòng/phút trong 15 phút để lấy tủa. Tủa được sấy khô ở < 400C, cân trọng lượng rồi cho vào túi dialise thẩm tích để loại muối trong nước cất ở điều kiện lạnh. Thu lấy phần còn lại trong túi đem sấy khô, thổi gió < 400C, cân chế phẩm enzym và bảo quản lạnh. - Cách tiến hành thẩm tích bằng túi dialise: cân trọng lượng túi bán thấm dialise, và cân lượng CPE được tủa bằng muối (NH4)2SO4 cho CPE vào túi bán thấm. Tiếp tục cho túi này vào một cốc thuỷ tinh có đựng nước cất để lạnh. Khuấy và thay nước lạnh thường xuyên (5-6 lần trong một ngày đêm, túi này chỉ cho chất có phân tử lượng nhỏ thẩm tích qua túi mà giữ lại những chất có phân tử lượng lớn như protein, enzym). Sấy quạt gió làm khô túi ở < 400C, cân lại trọng lượng túi. Những vấn đề cần lưu ý khi tủa enzym - Chúng ta phải cho từ từ tác nhân tủa vào dung dịch enzym thô bằng cách sử dụng pipet nhỏ từng giọt, mục đích là tránh hiện tượng tủa cục bộ. Vì nếu thêm vào một lượng lớn tác nhân tủa sẽ tạo ra nồng độ quá cao ngay tại vùng tiếp xúc trong dung dịch enzym, điều đó sẽ dẫn đến tủa cục bộ tại một vị trí đó, và có thể làm biến tính bất thuận nghịch. - Khi thêm tác nhân tủa vào cần phải lắc đều để tăng độ khuếch tán vào dung dịch enzym thô. 2.3.12. Xác định hoạt độ chế phẩm enzym (CPE) amylase thu được từ các tác nhân tủa [4] Cân 0,1g CPE amylase từ mỗi tác nhân tủa pha với 50ml nước cất, rồi tiếp tục pha loãng tới nồng độ thích hợp. Xác định hoạt độ amylase theo phương pháp Heinkel. 2.3.13. Xác định độ bền của CPE amylase [12], [20], [33] 2.3.13.1. Độ bền nhiệt của amylase Amylase được giữ trong dung dịch đệm có pH 6, ở các nhiệt độ khác nhau từ 30-1000C (mỗi bước nhảy 100C) trong 1 giờ. Sau đó xác định hoạt độ amylase theo phương pháp Heinkel. Độ bền của dịch enzym được đánh giá bằng số phần trăm hoạt độ còn lại trong các dịch đã xử lý nhiệt độ, mẫu đối chứng là hoạt độ amylase của dịch enzym không xử lý nhiệt độ và giữ ở 40C. 2.3.13.2. Độ bền pH của amylase Dịch amylase được giữ trong dung dịch đệm có pH khác nhau từ 4,0-8,0 (mỗi bước nhảy là 0,5) trong 1 giờ ở 300C theo tỉ lệ 1:1. Xác định hoạt độ amylase theo phương pháp Heinkel. Độ bền của dịch enzym được đánh giá bằng số phần trăm hoạt độ còn lại trong các dịch đã xử lý pH, mẫu đối chứng là hoạt độ amylase của dịch enzym không xử lý pH và giữ ở pH 6. 2.3.14. Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm [4]. Sử dụng cách tính toán thống kê để xử lý các số liệu thực nghiệm thu được. • Xác định giá trị trung bình Giá trị trung bình của các số liệu là tổng giá trị thực của mỗi lần đo chia cho số lần đo: n x x n i = Trong đó: x : giá trị trung bình ix : giá trị của một lần đo n : số lần đo Nếu thực hiện sự đo đạc lặp lại nhiều lần trên một mẫu thí nghiệm thì chúng ta có thể tiệm cận đến một giá trị trung bình thật. Để giá trị trung bình của các lần đo như là một giá trị gần đúng với giá trị trung bình thật, ta phải dùng phương pháp thống kê để đánh giá mức độ chính xác của các lần đo. • Tính toán độ lệch mẫu và độ lệch chuẩn o Độ lệch mẫu (Sample deviation): Là sự khác biệt giữa giá trị của một lần đo với giá trị trung bình. Độ lệch mẫu = xi - x Trong đó: xi : giá trị của một lần đo. x : giá trị trung bình. o Độ lệch chuẩn (Standard deviation): sự sai số có thể có trong một lần đo S ( )2i 1n xx − − =  Với S : độ lệch chuẩn ix : giá trị của một lần đo x : giá trị trung bình n : số lần đo Vậy giá trị trung bình có thể diễn đạt như sau: Sx ± Độ lệch chuẩn có thể chuyển đổi thành độ lệch chuẩn của giá trị trung bình hay còn gọi là sai số chuẩn được ký hiệu là Sm. Sm n S = S: độ lệch chuẩn; n: số lần đo. Công thức trên cho thấy, số lần đo càng lớn (n càng lớn) thì độ lệch chuẩn của giá trị trung bình (Sm) càng nhỏ, hay mức độ chính xác của lần đo đạc càng cao. Chương III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng trực khuẩn có hoạt tính amylase cao Từ mẫu cỏ khô và đất vườn chúng tôi tiến hành phân lập theo phương pháp ở mục 2.3.1, thu được 17 chủng thuần. Tiếp tục xác định hoạt tính amylase theo phương pháp đục lỗ trên đĩa thạch như ở mục 2.3.5. Từ kết quả đo đường kính vòng phân giải tinh bột chúng tôi chọn 3 chủng có hoạt tính amylase cao, ký hiệu: CK1, CK2, CK3. Kết quả trình bày ở bảng 3.1 và hình 3.1 Bảng 3.1. Đường kính vòng phân giải tinh bột của 3 chủng CK Chủng D-d (mm) CK1 20 CK2 22 CK3 25 Hình 3.1. Vòng phân giải tinh bột của 3 chủng CK CK3 CK1 CK2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 20 30 35 40 45 50 55 60 70 Thời gian (h) O D 62 0 CK1 CK2 CK3 3.2. Xác định sự sinh trưởng và hoạt độ amylase của 3 chủng CK đã chọn 3.2.1. Xác định sự sinh trưởng của 3 chủng CK Chúng tôi tiến hành nuôi mỗi chủng trong môi trường MPA lỏng trên máy lắc 200 vòng/phút ở 370C. Tiến hành đo OD620 xác định khả năng sinh trưởng của mỗi chủng theo mỗi mốc thời gian: 20,30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70 giờ. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2 và đồ thị 3.1. Bảng 3.2. Sự sinh trưởng của 3 chủng CK OD620 Thời gian (h) CK 1 CK 2 CK 3 20 0,575 0,711 0,637 30 0,679 0,868 0,855 35 0,808 1,242 1,128 40 0,955 1,483 1,320 45 1,126 1,468 1,284 50 1,104 1,436 1,217 55 1,051 1,355 1,149 60 0,985 1,224 0,986 70 0,847 1,113 0,829 Đồ thị 3.1. So sánh sự sinh trưởng của 3 chủng CK 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 CK1 CK2 CK3 Chủng H oa ït đ ộ am yl as e (U I/m l) Từ kết quả trên cho thấy cả 3 chủng CK đều sinh trưởng tốt, tuy nhiên chủng CK2 có khả năng sinh trưởng cao hơn, và thời gian sinh trưởng cao nhất của CK2 vào lúc 40h. 3.2.2. Xác định hoạt độ amylase của 3 chủng CK Chúng tôi tiến hành nuôi mỗi chủng trong môi trường cảm ứng sinh amylase dạng lỏng trên máy lắc 200 vòng/phút ở 370C. Sau thời gian khoảng 45- 50 giờ chúng tôi tiến hành thí nghiệm đo hoạt độ amylase theo phương pháp Heinkel. Kết quả như sau: Bảng 3.3. So sánh hoạt độ amylase của 3 chủng CK Chủng Hoạt độ amylase (UI/ml) CK1 10,398 ± 0,239 CK2 16,168 ± 0,147 CK3 9,119 ± 0,089 Biểu đồ 3.1. So sánh hoạt độ amylase của 3 chủng CK Qua kết quả trên thì chủng CK2 cho hoạt độ amylase cao nhất. Vậy từ 3 chủng trên chúng tôi chọn chủng CK2 có khả năng sinh trưởng và tạo amylase có hoạt độ cao để tiếp tục nghiên cứu. 3.3. Một số đặc điểm sinh học của chủng CK2 3.3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Chúng tôi tiến hành cấy dàn chủng CK2 lên bề mặt thạch môi trường MPA của đĩa petri. Sau đó để vào tủ ấm 340C trong 24 giờ để thu các khuẩn lạc riêng biệt. Kết quả được nêu trong hình 3.2 Qua quan sát chúng tôi nhận thấy khuẩn lạc chủng CK2 có đặc điểm là: khuẩn lạc khô, màu trắng đục, mặt khuẩn lạc mịn, mép nhăn, bám vào môi trường thạch. 3.3.2. Đặc điểm hình thái tế bào chủng CK2 Sau 24 giờ nuôi cấy chúng tôi tiến hành làm tiêu bản sống chủng CK2 và quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 40X, nhận thấy chủng CK2 có tế bào hình que, ngắn, nhỏ, đứng riêng rẽ. Nhuộm Gram và quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại 100X, chúng tôi nhận thấy chủng CK2 bắt màu tím. Điều đó chứng tỏ chủng này là vi khuẩn Gram dương. Kết quả thu được ở hình 3.3 Hình 3.2. Hình thái khuẩn lạc chủng CK2 Hình 3.3. Hình thái tế bào chủng CK2 3.3.3. Khả năng hình thành bào tử của chủng CK2 Nuôi chủng CK2 trên môi trường MPA ở tủ ấm 340C, sau 5 ngày nhuộm bào tử theo phương pháp như đã trình bày ở mục 2.3.3. Kết qủa quan sát dưới kính hiển vi chúng tôi nhận được hình 3.4 Hình 3.4. Bào tử của chủng CK2 Vậy chủng CK2 có khả năng hình thành nội bào tử (bào tử bắt màu đỏ). 3.3.4. Nghiên cứu khả năng sinh enzym catalase Chúng tôi tiến hành nuôi cấy chủng CK2 trên bề mặt thạch môi trường MPA, trong tủ ấm ở 340C. Sau 24 giờ khi thấy xuất hiện khuẩn lạc nhỏ lên khuẩn lạc 1 giọt H2O2 10% thì thấy xuất hiện bọt khí, chứng tỏ chủng CK2 có khả năng sinh enzym catalase: H2O2 H2O + O2↑. Phân tử oxy sinh ra làm phản ứng tạo ra bọt khí, vậy chủng CK2 là vi khuẩn hiếu khí.  Tóm tắt một số đặc điểm sinh học của chủng CK2 Bảng 3.4. Một số đặc điểm sinh học của chủng CK2 Đặc điểm Chủng CK2 Hình thái khuẩn lạc Khô, màu trắng đục, mặt khuẩn lạc mịn, mép hơi nhăn, bám vào môi trường thạch. Hình thái tế bào Hình que, ngắn, nhỏ, đứng riêng rẽ Phân giải tinh bột + Gram + Hình thành nội bào tử + Khả năng phân giải H2O2 + Nhu cầu về oxy + 3.4. Nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng tới khả năng sinh tổng hợp α – amylase của chủng CK2. 3.4.1. Loại cơ chất Chúng tôi tiến hành nuôi cấy chủng CK2 trong môi trường lỏng sinh tổng hợp enzym α – amylase có chất cảm ứng khác nhau: bột gạo, bột mỳ, bột bắp, tinh bột tan ở nhiệt độ 37oC với chế độ lắc 200 vòng/phút. Sau mỗi mốc thời gian: 20, 30, 40, 45, 50, 55, 60, 70 giờ đo OD620 xác định khả năng sinh trưởng, và ly tâm loại bỏ sinh khối ở 5000 v/p trong 15 phút để xác định hoạt độ amylase theo phương pháp Heinkel. Kết quả được trình bày ở bảng 3.5 và đồ thị 3.2. catalase Bảng 3.5. Ảnh hưởng loại cơ chất đến hoạt độ amylase Thời gian (h) Cơ chất OD620 Hoạt độ amylase (UI/ml) Bột gạo 0,672 2,221 ± 0,05 Bột mỳ 0,655 3,819 ± 0,045 Bột bắp 0,798 3,920 ± 0,034 20 Tinh bột tan 0,841 4,913 ± 0,034 Bột gạo 0,734 4,172 ± 0,017 Bột mỳ 0,711 5,131 ± 0,073 Bột bắp 0,943 6,326 ± 0,089 30 Tinh bột tan 1,055 7,403 ± 0,067 Bột gạo 1,203 6,477 ± 0,045 Bột mỳ 1,121 6,545 ± 0,034 Bột bắp 1,286 8,059 ± 0,061 40 Tinh bột tan 1,502 10,263 ± 0,045 Bột gạo 1,155 8,311± 0,045 Bột mỳ 1,100 7,672 ± 0,077 Bột bắp 1,206 10,212 ± 0,073 45 Tinh bột tan 1,488 14,890 ± 0,058 Bột gạo 1,045 8,227 ± 0,077 Bột mỳ 0,962 7,537 ± 0,034 Bột bắp 1,131 10,128 ± 0,061 50 Tinh bột tan 1,374 14,654 ± 0,073 0 2 4 6 8 10 12 14 16 20 30 40 45 50 55 60 70 Thời gian (h) H oạ t đ ộ a m yl as e (U I/m l) Bột gạo Bột mỳ Bột bắp Tinh bột tan Bột gạo 0,964 8,008 ± 0,034 Bột mỳ 0,902 7,453 ± 0,017 Bột bắp 1,067 9,960 ± 0,045 55 Tinh bột tan 1,228 14,419 ± 0,034 Bột gạo 0,876 7,722 ± 0,077 Bột mỳ 0,844 7,319 ± 0,058 Bột bắp 0,981 9,186 ± 0,058 60 Tinh bột tan 1,163 13,796 ± 0,089 Bột gạo 0,711 7,134 ± 0,089 Bột mỳ 0,689 6,578 ± 0,045 Bột bắp 0,843 8,446 ± 0,017 70 Tinh bột tan 0,936 12,517 ± 0,050 Bảng 3.5. Ảnh hưởng loại cơ chất đến hoạt độ amylase (tiếp theo) Đồ thị 3.2. Ảnh hưởng các loại cơ chất đến hoạt độ amylase Chủng CK2 đã chọn khi nuôi cấy với các loại cơ chất khác nhau đều sinh trưởng tốt nhất vào thời gian là 40h. Tuy nhiên với cơ chất là tinh bột tan thì chủng CK2 sinh trưởng cao hơn hẳn là 1,502, và cũng loại cơ chất này thì hoạt độ amylase cũng cao nhất khi thời gian nuôi cấy được 45 - 50h. Từ kết quả trên có thể thấy nguồn cơ chất thích hợp cho chủng CK2 sinh trưởng và sinh enzym amylase được sắp xếp theo thứ tự như sau: Tinh bột tan > bột bắp > bột gạo > bột mỳ. Vậy chủng CK2 có thời gian sinh trưởng cao nhất lúc nuôi cấy được 40h và hoạt độ amylase cao nhất lúc 45-50h. 3.4.2. Ảnh hưởng nồng độ tinh bột tan Từ kết quả trên cho thấy tinh bột tan là nguồn cơ chất thích hợp nhất để chủng CK2 sinh amylase có hoạt độ cao. Tuy nhiên nồng độ khác nhau của cơ chất cũng ảnh hưởng không nhỏ đến hoạt độ amylase. Vì thế chúng tôi tiến hành nuôi chủng CK2 trong môi trường cảm ứng có chất cảm ứng là tinh bột tan với nồng độ khác nhau: 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5% trên máy lắc 200 vòng/phút ở 370C. Sau 40