Luận văn Nghiên cứu thu nhận pectic oligosaccharide từ pectin vỏ chanh leo bằng endopolygalacturonase

Sau khi ra khỏi lò nƣớng, để nguội, tách bánh ra khỏi khay và chuyển ngay vào bao gói. Tiến hành đánh giá cảm quan theo TCVN 3215-79. 2.2.3. P ƣơng p áp toán ọc 2.2.3.1. ối ưu h a sinh tổng hợp endopolygalacturonase từ A. niger UV06-12-23 Sử dụng phần mềm Design Expert 7.1.5 (State-Ease, Inc., Minneapolis, Mỹ) để phân tích các hệ số hồi quy, thiết lập bề mặt đáp ứng và tối ƣu hóa theo hàm mong đợi. ANOVA đƣợc sử dụng để đánh giá các thông số thống kê. Bƣớc 1. Xây dựng mô hình toán học dạng y = b0 + b1X1 + b11 X1 2 + b2 X2 + b22 X2 2 + b3X3+ b33X3 2 + b12 X1X2 + b13X1X3 + b23X2X3 - Xác định các biến ảnh hƣởng, các mức và khoảng thay đổi của từng biến từ khảo sát thực nghiệm nhƣ trên bảng 2.5. Bảng 2.5 Các yếu tố tối ưu trong nghiên cứu sinh tổng hợp endopol galacturonase từ chủng A. niger UV06-12-23 Biến số Yếu tố Đơn vị Mức -1 Mức +1 X1 Độ ẩm % 50 70 X2 Hàm lƣợng pectin % 10 14 X3 Nhiệt độ o C 25 35 - Lập ma trận thực nghiệm theo Box-Benken: gồm 17 thí nghiệm kết hợp các yếu tố với 3 mức +1 (mức cao nhất), -1 (mức thấp nhất) và 0 (mức trung bình), trong đó có 5 thí nghiệm lặp ở tâm (các yếu tố đều ở mức 0) (bảng 2.6). Quá trình sinh tổng hợp enzyme đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp nuôi cấy trên môi trƣờng rắn. Bình tam giác 250 ml chứa 16 g môi trƣờng rắn, cấp giống với tỉ lệ giống là 2.10 6 bào tử/g đƣợc nuôi trong 72 giờ. Sau đó, thu enzyme bằng đệm phosphate pH 4,5 với tỷ lệ 7:1. Dịch chiết đƣợc lọc, ly tâm loại bỏ cặn và xác định hoạt độ enzyme. - Tính toán hệ số của hàm hồi quy - Kiểm tra độ phù hợp của mô hình và sự có nghĩa của các hệ số hồi quy - Đánh giá sự sai lệch giữa mô hình và thực nghiệm theo chuẩn Fisher Bƣớc 2.Cực đại hóa hàm mục tiêu theo phƣơng pháp hàm kỳ vọng -46- Tìm cực trị của phƣơng trình hồi quy y = b0 + b1X1 + b11 X1 2 + b2 X2 + b22 X2 2 + b3X3+ b33X3 2 + b12 X1X2 + b13X1X3 + b23X2X3 bằng phần mềm Design-Expert 7.15 cho các kết quả đạt giá trị cực trị tại X1, X2, X3 tƣơng ứng với giá trị độ ẩm, hàm lƣợng pectin và nhiệt độ. Bảng 2.6 Ma tr n thực nghiệm tối ưu h a sinh tổng hợp EPG từ A. niger UV06-12-23 TN Độ ẩm (%) Hàm lƣợng pectin (%) Nhiệt độ ( o C) Hoạt độ EPG (U/g) 1 50 10 30 2 70 10 30 3 50 14 30 4 70 14 30 5 50 12 30 6 70 12 25 7 50 12 35 8 70 12 35 9 60 10 25 10 60 14 25 11 60 10 35 12 60 14 35 13 60 12 30 14 60 12 30 15 60 12 30 16 60 12 30 17 60 12 30 2.2.3.2. ối ưu h a quá tr nh thủy phân giới hạn pectin tạo POS Nghiên cứu tối ƣu hóa quá trình thủy phân giới hạn pectin tạo POS bằng phần mềm Design Expert 7.1.5 tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp 2.2.3.1. Trong đó các biến ảnh hƣởng, các mức và khoảng thay đổi của từng biến đƣợc biểu diễn trên bảng 2.7. -47- Bảng 2.7 Các biến số trong nghiên cứu tối ưu h a quá tr nh thủy phân giới hạn pectin tạo POS Biến số Yếu tố Đơn vị Mức -1 Mức +1 X1 Nhiệt độ o C 45 55 X2 Tỷ lệ enzyme/cơ chất U/g 30 50 X3 Tốc độ khuấy vòng/phút 200 300 Ma trận thực nghiệm theo Box-Benken đƣợc biểu diễn trên bảng 2.8. Bảng 2.8 Ma tr n thực nghiệm tối ưu h a quá trình thủy phân giới hạn pectin vỏ chanh leo tạo POS TN Nhiệt độ (độ C) Tỷ lệ enzyme/cơ chất (U/g pectin) Tốc độ khuấy (vòng/phút) Hàm lƣợng POS (mg/ml) 1 45 30 250 2 55 30 250 3 35 25 250 4 45 25 250 5 35 20 200 6 45 20 200 7 35 20 300 8 45 20 300 9 40 15 200 10 40 25 200 11 40 15 300 12 40 25 300 13 40 20 250 14 40 20 250 15 40 20 250 16 40 20 250 17 40 20 250 - Tiến hành thực nghiệm: Thủy phân pectin bằng enzyme trong cốc thủy tinh đặt trong thiết bị ổn định nhiệt độ với thời gian thủy phân 4 giờ tại pH = 4,0. Kết thúc quá trình thủy phân, tiến hành vô hoạt enzyme và xác định hàm lƣợng POS trong dịch thủy phân. -48- 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu thu nhận endopolygalacturonase 3.1.1. Phân lập, tuyển chọn chủng A. niger sinh tổng hợp EPG cao Việc tìm kiếm chủng A. niger có khả năng tổng hợp EPG cao để chủ động tạo ra nguồn enzyme ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và đặc biệt ứng dụng trong sản xuất POS đang đƣợc nhiều nhà nghiên cứu quan tâm. Để chọn lọc đƣợc chủng A. niger có khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase cao, trong phần này, các thí nghiệm đƣợc tiến hành qua ba bƣớc. Bƣớc đầu, các chủng đƣợc phân lập dựa trên đƣờng kính khuẩn lạc trên môi trƣờng chứa cơ chất pectin, bƣớc tiếp theo các chủng đƣợc sàng lọc qua đƣờng kính vòng thủy phân và hoạt độ polygalacturonase của sinh khối. Bƣớc cuối cùng, các chủng đƣợc lựa chọn theo hoạt độ endopolygalacturonase cao. Từ một số nguồn vỏ quả cam, táo, bƣởi, cà phê, cà rốt giàu pectin mua tại một số chợ trên địa bàn Hà Nội (tháng 1/2013) đã phân lập đƣợc 40 chủng nấm sợi trên môi trƣờng Czapeck. Các chủng này đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng chọn lọc Czapeck- pectin ở 30 oC. Sau 3 ngày nuôi quan sát và xác định đƣờng kính khuẩn lạc. Trong số 40 chủng nấm mốc phân lập chỉ có 16 chủng có khả năng phát triển trên môi trƣờng chứa pectin và trong đó có 7 chủng có đƣờng kính khuẩn lạc >3 cm (bảng 3.1). Bảng 3.1 Nguồn gốc và đặc điểm của các chủng nấm mốc phân l p từ nguồn vỏ quả STT Ký hiệu Nguồn gốc Đặc điểm của chủng Thời gian xuất hiện bào tử (ngày) Màu của khuẩn lạc Đƣờng kính khuẩn lạc (cm) 1 T1 Vỏ táo 3 Đen 3,2 2 B3 Vỏ bƣởi Diễn 2 Đen 3,5 3 C5 Vỏ cam sành 2 Đen 3,6 4 CF1 Vỏ quả cà phê 3 Nâu đen 3,3 5 CR1 Vỏ cà rốt 3 Đen 3,2 6 C2 Vỏ cam Hà Giang 2 Đen 4,0 7 B2 Vỏ bƣởi Năm Roi 2 Đen 3,8 Các chủng phân lập đƣợc này đều mang những đặc điểm hình thái tƣơng tự nhƣ của Aspergillus niger theo mô tả của Diba K. và cộng sự với bào tử màu đen, sợi nấm màu -49- trắng, mặt trái khuẩn lạc không màu; cuống bào tử nhẵn, vách dày, không màu; phần cuối cuống bào tử mở rộng tạo thành bọng hình cầu, thể bình 2 tầng, bào tử hình cầu, ráp, xẻ rãnh [32] (hình 3.1). Hình 3.1 Khuẩn lạc, hệ sợi và bào tử chủng CF1 trên m i trư ng Czapeck (sau 3 ngày nuôi, 30oC) Bảng 3.2 Giá trị bán kính vòng thủy phân của các chủng nấm mốc thử nghiệm TT Kí hiệu chủng D - d (mm) TT Chủng D - d (mm) 1 CNTP5011 3,5 20 CNTP5014 3,5 2 CNTP5032 3,5 21 CNTP5013 6,0 3 CNTP5003 4,5 22 CNTP5008 3,5 4 CNTP5004 5,0 23 CNTP5055 4,0 5 CNTP5009 3,5 24 CNTP5023 3,5 6 CNTP5021 3,5 25 CNTP5034 3,5 7 CNTP5015 3,0 26 CNTP5016 4,0 8 CNTP5006 3,5 27 BK01 4,0 9 CNTP5017 6,5 28 CĐN4 4,0 10 CNTP5033 3,5 29 T1 4,2 11 CNTP5020 6,5 30 B3 4,0 12 CNTP5054 3,5 31 C5 4,5 13 CNTP5052 3,5 32 CF1 5,0 14 CNTP5053 3,5 33 CR1 4,5 15 CNTP5010 3,5 34 C2 4,0 16 CNTP5007 5,5 35 B2 4,0 17 CNTP5037 5,0 36 PDG 3,0 18 CNTP5002 5,5 37 LN 3,5 19 CNTP5012 3,5 -50- Tiếp đó tiến hành sàng lọc với 7 chủng nấm mốc phân lập đƣợc (bảng 3.1) và 30 chủng A. niger thu nhận từ các bộ sƣu tập giống theo phƣơng pháp đo bán kính vòng thủy phân (bảng 3.2 và hình PL1.2) cho thấy có 19/37 chủng cho giá trị (D - d) ≥ 4mm (trong đó có 7 chủng tự phân lập và 12 chủng A. niger từ các bộ sƣu tập giống (chủng gạch chân)). Bảng 3.3 Hoạt độ polygalacturonase của các chủng nấm mốc thử nghiệm TT Chủng Hoạt độ PG (U/g môi trƣờng) TT Chủng Hoạt độ PG (U/g môi trƣờng) 1 CNTP5016 6,89 11 CĐN4 6,73 2 CNTP5007 13,64 12 BK01 6,86 3 CNTP5004 14,57 13 T1 4,59 4 CNTP5013 11,11 14 B1 5,29 5 CNTP5002 13,02 15 C1 2,95 6 CNTP5037 15,71 16 CF 15,09 7 CNTP5020 13,32 17 CR 5,83 8 CNTP5003 11,15 18 C2 14,71 9 CNTP5055 5,03 19 B2 3,82 10 CNTP5017 4,33 Từ kết quả đo hoạt độ polygalacturonase của 19 chủng đó (bảng 3.3) chọn đƣợc 7 chủng (chủng gạch chân) cho giá trị hoạt độ polygalacturonase trên 13 U/g môi trƣờng, trong đó chủng A. niger CNTP 5037 cho giá trị hoạt độ cao nhất (15,71 U/g môi trƣờng). Abbasi H. và cộng sự nuôi cấy chủng A. niger phân lập đƣợc trên môi trƣờng bã táo - cám lúa mỳ thu đƣợc hoạt độ polygalacturonase đạt 7,93 U/g cơ chất [9]. Maciel M.H.C. và cộng sự phân lập đƣợc chủng A. niger trên môi trƣờng rắn chứa phụ phẩm bã cọ (palm) thu đƣợc 66,19 U/g sau 4 ngày nuôi [72]. Akhter N. và cộng sự, nuôi trên môi trƣờng chứa 9,68% pectin và hàm ẩm 60% thu đƣợc 144,42 U/g [13]. Tiếp theo đó, sàng lọc 7 chủng nấm mốc lựa chọn ở phần trên qua khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase trên môi trƣờng lên men rắn (bảng 3.4). -51- Kết quả cho thấy trong số 7 chủng lên men trên môi trƣờng rắn sinh tổng hợp endopolygalacturonase, chọn đƣợc chủng A. niger CNTP 5037 sinh tổng hợp EPG với hoạt độ cao nhất 22,94 U/g môi trƣờng. Bảng 3.4 Hoạt độ endopolygalacturonase của 7 chủng nấm mốc thử nghiệm TT Chủng Hoạt độ endopolygalacturonase (U/g môi trƣờng) 1 CNTP 5037 22,94 2 CNTP 5004 18,61 3 CNTP 5007 17,30 4 CF 21,09 5 C2 20,79 6 CNTP 5002 16,88 7 CNTP 5020 16,45 Nhƣ vậy, từ 40 chủng nấm sợi và 30 chủng A. niger từ các bộ sƣu tập giống đã tuyển chọn đƣợc chủng nấm mốc A. niger CNTP 5037 có khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase 22,94 U/g môi trƣờng sau 3 ngày nuôi cấy. 3.1.2. Cải tạo chủng A. niger CNTP 5037 có khả năng sin tổng hợp EPG cao Chủng A. niger CNTP 5037 trong điều kiện thí nghiệm chỉ tổng hợp endopolygalacturonase với hoạt độ thu đƣợc còn thấp. Để có thể thu nhận chủng có khả năng tổng hợp endopolygalacturonase cao hơn, chủng thử nghiệm đƣợc xử lí với tia tử ngoại ở điều kiện: UV 254 nm, công suất đèn 40W, khoảng cách chiếu xạ 20 cm. Nhằm xác định thời gian chiếu xạ phù hợp để sàng lọc các đột biến [132], thời gian chiếu đƣợc tăng dần từ 0 – 80 phút [105]. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.5 và hình 3.2. Kết quả cho thấy với thời gian chiếu UV 70 phút tỉ lệ sống chỉ còn 0,2% và chiếu 80 phút thì toàn bộ bào tử bị tiêu diệt. Tuy nhiên, theo Zambare V. và cộng sự, Hopwood D.A. và cộng sự tỷ lệ sống 0,01% là thích hợp nhất cho chọn lựa thời gian gây đột biến vì các vi sinh vật này có thể bị đột biến nhiều lần hoặc nhiều điểm dẫn tới tăng cƣờng khả năng sinh tổng hợp hoạt chất mong muốn khi nuôi cấy [50, 132]. Do đó, thời gian chiếu xạ 75 phút với tỉ lệ sống 0,02% đã đƣợc lựa chọn cho quá trình cải tạo chủng A. niger CNTP 5037 bằng tia UV. -52- Bảng 3.5 Ảnh hưởng của th i gian chiếu xạ tới tỉ lệ sống của A. niger CNTP 5037 TT Thời gian chiếu xạ (phút) Số bào tử/ml Tỉ lệ sống (%) 1 0 90000 100 2 30 43568 48,40 3 40 17840 19,8 4 45 12240 13,68 5 50 10580 11,76 6 55 4080 4,53 7 60 2020 2,24 8 65 1160 1,29 9 70 180 0,20 10 75 20 0,02 11 80 0 0 n Khuẩn lạc A. niger CNTP 5037 với th i gian chiếu UV khác nhau A – F: thời gian chiếu 30, 40, 50, 60, 70, 75 phút A B C D E F -53- 3.1.2.1. Sàng lọc dòng đột biến sinh endopolygalacturonase cao Bào tử chủng A. niger CNTP 5037 đƣợc chiếu UV với thời gian 75 phút sau đó trang trên môi trƣờng Czapeck-pectin chứa Triton X100, tiếp đó tách các khuẩn lạc và cấy chấm điểm các khuẩn lạc trên đĩa pettri chứa môi trƣờng Czapeck-pectin để xác định đƣờng kính vòng thủy phân. Bảng 3.6 Khả năng tổng hợp endopolygalacturonase của chủng xử lý bằng UV TT Ký hiệu dòng A. niger Hoạt độ EPG (U/g) Hiệu suất so với chủng gốc (%) 1 CNTP 5037 22,94 100,00 2 UV01 29,41 128,00 3 UV02 34,11 148,69 4 UV03 29,64 129,20 5 UV04 31,76 138,44 6 UV05 29,47 128,46 7 UV06 39,59 172,58 8 UV07 38,68 168,61 9 UV08 23,47 102,03 10 UV09 32,45 141,51 11 UV10 30,46 132,70 12 UV11 44,32 193,19 13 UV12 27,89 121,51 14 UV13 34,12 148,73 15 UV14 33,24 144,89 16 UV15 29,78 129,31 17 UV16 26,78 116,73 18 UV17 31,34 136,60 19 UV18 23,78 103,66 20 UV19 37,78 164,60 21 UV20 36,24 157,94 -54- Qua 10 lần chiếu UV thu đƣợc 458 dòng có khả năng sống sót trên môi trƣờng Czapeck-pectin chứa Triton X100. Trong số 458 dòng này chỉ có 48 dòng cho giá trị D/d cao hơn chủng gốc A. niger CNTP 5037 (bảng PL1.1, phụ lục 1). Đặc biệt, lựa chọn đƣợc 20 dòng có D/d cao hơn (1,76 – 3,6 lần) so với chủng gốc cho quá trình sàng lọc tiếp theo. Từ 20 dòng lựa chọn ở trên đƣợc tiếp tục tuyển chọn khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase trên môi trƣờng rắn. Sau 72 giờ nuôi cấy tiến hành thu và xác định hoạt độ enzyme. Kết quả thể hiện ở bảng 3.6 cho thấy, trong số 20 dòng có D/d cao hơn dòng tự nhiên (A. niger UV1 đến A. niger UV20) chỉ có 4 dòng có khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase cao hơn từ 164,60% đến 193,19% so với dòng tự nhiên, bao gồm: A. niger UV06, UV07, UV11, UV19. Sau quá trình cải biến, dòng A. niger có khả năng tổng hợp endopolygalacturonase hoạt độ cao hơn, từ 22,94 U/g ở dòng tự nhiên tăng lên 44,32 U/g ở dòng A. niger UV11. Tiếp đó 4 dòng này đƣợc lựa chọn và nuôi cấy qua nhiều lần cấy truyền để kiểm tra tính ổn định về khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase. Bốn dòng A. niger UV06, UV07, UV11, UV19 đƣợc hoạt hóa, nuôi cấy trên môi trƣờng rắn và xác định khả năng sinh tổng hợp enzyme của chúng qua 5 lần cấy truyền. Nhận thấy, chủng tự nhiên gần nhƣ ổn định qua 5 lần cấy truyền. Các dòng xử lý UV ở lần cấy truyền thứ 2 gần nhƣ không có sự thay đổi về hoạt độ nhƣng ở lần cấy truyền thứ 3 đã có sự suy giảm về khả năng sinh tổng hợp enzyme và càng về các lần cấy truyền sau sự suy giảm càng lớn. Trong bốn dòng chọn lựa có A. niger UV06 ổn định nhất, qua lần cấy truyền thứ 5 vẫn có khả năng tổng hợp enzyme đạt hiệu suất 95,57% so với lần cấy truyền đầu tiên (bảng 3.7). Do vậy, lựa chọn dòng A. niger UV06 cho nghiên cứu tiếp theo. Bảng 3.7 Khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase của chủng cải tạo qua các lần cấy truyền Tên chủng Hoạt độ endopolygalacturonase (U/g) Số lần cấy truyền (lần) 1 2 3 4 5 A. niger CNTP 5037 22,04 22,17 22,06 21,53 21,01 A. niger UV06 39,59 39,41 39,01 38,76 37,84 A. niger UV07 38,68 38,47 30,25 26,8 21,39 A. niger UV11 44,32 39,81 32,94 28,56 26,01 A. niger UV19 37,78 37,31 36,94 35,78 35,51 -55- 3.1.2.2. Cải tạo chủng bằng kỹ thu t chiếu UV nhiều lần Để tạo chủng xử lý bằng UV có khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase cao hơn nữa, tiến hành xử lý bào tử của dòng A. niger UV06 nhiều lần bằng tia UV. Kết quả thu đƣợc biểu diễn ở bảng 3.8. Bảng 3.8 Khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase của dòng xử lý bằng UV nhiều lần qua các lần cấy truyền Số lần chiếu UV Tên dòng Hoạt độ endopolygalacturonase (U/g) Số lần cấy truyền (lần) 1 2 3 4 5 2 A. niger UV06-12 45,19 45,41 44,01 44,76 44,84 A. niger UV06-13 48,68 42,47 40,15 36,51 31,14 A. niger UV06-14 54,32 40,01 32,94 18,16 6,09 A. niger UV06-15 47,78 32,13 26,62 15,18 5,58 3 A. niger UV06-12-21 64,06 60,21 54,38 52,22 50,37 A. niger UV06-12-22 57,43 47,12 35,92 25,18 14,25 A. niger UV06-12-23 60,82 59,22 59,85 58,02 58,15 Kết quả bảng 3.8 cho thấy sau khi xử lý UV lần 2 thu đƣợc dòng A. niger UV06-12 có khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase cao và ổn định trong khi hoạt độ enzyme từ dòng A. niger UV06-13, A. niger UV06-14 và A. niger UV06-15 cao hơn nhƣng không ổn định. Điều này có thể do các đột biến trên không bền và bị các cơ chế sửa chữa trong quá trình sinh trƣởng của A. niger đƣa về trạng thái giống nhƣ chủng gốc [103]. Tiến hành xử lý UV lần 3 với dòng A. niger UV06-12 và nhận đƣợc dòng A. niger UV06-12-23 có khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase cao gấp 2,8 lần so với chủng A. niger CNTP 5037 (60,82 U/g môi trƣờng), gấp 1,54 lần so với A. niger UV06 và ổn định qua 5 lần cấy truyền vẫn còn 58,15 U/g môi trƣờng. Tiếp tục nghiên cứu sự ổn định của dòng A. niger UV06-12-23 qua nhiều lần cấy truyền nhằm ứng dụng dòng này trong sản xuất công nghiệp, kết quả thu đƣợc biểu diễn ở bảng 3.9. Dòng A. niger UV06-12-23 qua 15 lần cấy truyền vẫn giữ đƣợc 95% hoạt độ so với thế hệ đầu tiên. Kết quả thu đƣợc tƣơng tự nhƣ nghiên cứu tạo chủng đột biến có khả -56- năng sinh tổng hợp cellulase cao, Sangkharah K. và cộng sự tạo ra chủng đột biến bằng UV có khả năng sinh tổng hợp cellulase ổn định qua 12 lần cấy truyền [114], Fawzi E.M. tạo chủng đột biến ổn định qua 9 lần cấy truyền [38]. Bảng 3.9 Khả năng sinh tổng hợp EPG của A. niger UV06-12-23 qua các lần cấy truyền Số lần cấy truyền (lần) 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Hoạt độ EPG (U/g) 58,05 58,63 58,18 57,49 57,95 57,37 57,60 57,49 57,30 57,65 Nhƣ vậy, qua quá trình cải tạo chủng A. niger CNTP 5037 đã thu đƣợc dòng A. niger UV06-12-23 có khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase cao gấp 2,8 lần so với chủng gốc và ổn định qua nhiều lần cấy truyền. Kết quả đạt đƣợc cao hơn so với một số tác giả khác trên thế giới [12, 105]. Akbar S. và cộng sự đã sử dụng nhiều tác nhân đột biến nhƣ tia UV, colchicine, hydrogen peroxide, ethidium bromide nhằm cải thiện khả năng sinh tổng hợp pectinase của chủng A. carbonarius tạo đƣợc chủng E8 có khả năng sinh tổng hợp enzyme gấp 1,8 lần chủng tự nhiên [12]. 3.1.3. Thu nhận và đặc tính của endopolygalacturonase từ A. niger UV06-12-23 3.1.3.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp EPG a. Ản ƣởng của àm lƣợng pectin Pectin đóng vai trò là cơ chất cảm ứng cho quá trình tổng hợp endopolygalacturonase. Với phƣơng pháp lên men rắn, lƣợng pectin sử dụng đƣợc khảo sát trong khoảng 8 – 16% (w/w). Sau 3 ngày nuôi, hoạt độ endopolygalacturonase cao nhất đạt 65,78 U/g ở hàm lƣợng pectin 12% (w/w) (hình 3.3). Kết quả nghiên cứu cũng tƣơng ứng với công bố của Akhter N. và cộng sự [13], Phutela U. và cộng sự [100]. Theo các tác giả này hoạt độ enzyme thu đƣợc cao nhất trong môi trƣờng rắn có bổ sung 12% cơ chất pectin. -57- Hình 3.3 Ảnh hưởng của hàm lượng pectin đến khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase của A. niger UV06-12-23 b. Độ dà môi trường Độ dày môi trƣờng nuôi cấy có ảnh hƣởng lớn đến khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase của A. niger. Khi độ dày môi trƣờng nhỏ, nƣớc từ môi trƣờng sẽ bị bay hơi nhanh, không đảm bảo độ ẩm cho quá trình lên men. Ngƣợc lại, khi độ dày môi trƣờng quá lớn, tỷ lệ tƣơng đối giữa bề mặt tiếp xúc và khối lƣợng môi trƣờng nhỏ, độ lƣu thông – thoáng khí giảm, khả năng thoát nhiệt kém, ảnh hƣởng bất lợi tới quá trình sinh tổng hợp endopolygalacturonase. Từ kết quả hình 3.4 lựa chọn đƣợc độ dày môi trƣờng 17 mm (16 g môi trƣờng trong bình tam giác 250 ml) để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Hình 3.4 Ảnh hưởng của độ dà m i trư ng đến khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase của A. niger UV06-12-23 -58- c. Ản ưởng của độ ẩm môi trường Độ ẩm môi trƣờng ban đầu có ảnh hƣởng rất lớn đến sự sinh trƣởng và phát triển của vi sinh vật khi lên men rắn, do đó ảnh hƣởng tới sự sinh tổng hợp các enzyme thủy phân cơ chất. Độ ẩm môi trƣờng sẽ thay đổi liên tục trong quá trình lên men, do vậy việc nghiên cứu độ ẩm cho môi trƣờng rất quan trọng. Độ ẩm thấp sẽ không đủ lƣợng nƣớc cho nấm sinh trƣởng, ngƣợc lại độ ẩm quá cao cũng ảnh hƣởng tiêu cực đến sự sinh trƣởng do độ thoáng khí giảm. Kết quả hình 3.5 cho thấy ở độ ẩm 60% chủng A. niger UV06-12-23 cho khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase cao nhất đạt 68,35 U/g. Giá trị hàm ẩm 60% cũng đƣợc xác định cho chủng A. niger IM-6 khi nuôi trên môi trƣờng rắn [13]. Hình 3.5 Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase của A. niger UV06-12-23 d. Ản ưởng của nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hƣởng rất lớn đến sự phát triển của vi sinh vật, mỗi vi sinh vật có thể sinh trƣởng và sinh tổng hợp enzyme mục tiêu trong một phạm vi nhất định. Mặc dù, A. niger là chủng nấm mốc hoạt động trong vùng nhiệt độ ƣa ấm khoảng 20 – 40oC nhƣng qua nghiên cứu tài liệu cho thấy nhiệt độ sinh tổng hợp endopolygalacturonase của các chủng A. niger rất khác nhau. Kiran R.R.S. và cộng sự nuôi cấy chủng A. niger GHRM5 ở 30oC cho sinh tổng hợp endopolygalacturonase [59], trong khi đó Akhter N. và cộng sự lại chọn 40oC cho nuôi cấy A. niger IM-6 [13], Zhou H. và cộng sự nuôi cấy A. niger GJ-2 ở 37oC [134]. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ đến quá trình sinh tổng hợp enzyme của chủng A. niger UV06-12-23 đƣợc thực hiện trong khoảng 20 - 40oC. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.6 cho thấy ở nhiệt độ 30oC A. niger UV06-12-23 phát triển mạnh nhất và cũng sinh tổng hợp endopolygalacturonase cao nhất (69,13 U/g). Do đó lựa chọn nhiệt độ nuôi cấy 30oC cho các nghiên cứu tiếp theo. -59- Hình 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase của A. niger UV06-12-23 e. Ản ƣởng của thời gian Thời gian lên men có ảnh hƣởng lớn trong sản xuất enzyme. Thời gian lên men để đạt hoạt độ endopolygalacturonase cao nhất càng ngắn thì chi phí sản xuất càng thấp. Kết quả hình 3.7 cho thấy chủng A. niger UV06-12-23 có khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase cao nhất 70,05 U/g sau 72 giờ. Kết quả của Fontana R.C. và cộng sự nuôi cấy chủng A. niger trên môi trƣờng rắn chứa nguồn pectin cam cũng cho hoạt độ polygalacturonase cao nhất sau 72 giờ [39]. Do vậy lựa chọn thời gian nuôi cấy 72 giờ để thu nhận enzyme A. niger UV06-12-23. Hình 3.7 Ảnh hưởng của th i gian nu i đến khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase của A. niger UV06-12-23 Từ kết quả khảo sát cho thấy 3 thông số hàm lƣợng pectin, hàm ẩm và nhiệt độ ảnh hƣởng đáng kể đến hoạt độ endopolygalacturonase. Với hàm lƣợng pectin 12%, độ dày môi -60- trƣờng 17 mm, độ ẩm 60% và nhiệt độ 30oC hoạt độ enopolygalacturonase thu đƣợc cao nhất sau 72 giờ lên men. 3.1.3.2. Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp EPG từ A. niger UV06-12-23 Mục đích của quá trình này là tìm sự tƣơng tác đồng thời của các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình sinh tổng hợp endopolygalacturonase để lựa chọn điều kiện nuôi cấy tối ƣu cho chủng A. niger UV06-12-23 đạt hoạt độ endopolygalacturonase cao nhất. Dựa trên cơ sở đã khảo sát sự ảnh hƣởng của các yếu tố đến quá trình sinh tổng hợp enzyme, tiến hành xác định ảnh hƣởng đồng thời của 3 yếu tố: hàm lƣợng pectin, hàm ẩm, nhiệt độ. Kết quả thí nghiệm đƣợc thể hiện ở bảng 3.10 cho thấy sau 72 giờ nuôi cấy trong môi trƣờng rắn, hoạt độ endopolygalacturonase thu đƣợc từ chủng A. niger UV06-12-23 nằm trong khoảng 51,71 - 73,29 U/g, tƣơng ứng với các thí nghiệm số 3 và số 17. Kết quả phân tích phƣơng sai của mô hình tối ƣu bằng phần mềm DX7.1.5 (State- Ease) trình bày trong bảng 3.11 cũng cho thấy yếu tố độ ẩm và nhiệt độ ảnh hƣởng mạnh đến quá trình sinh tổng hợp enzyme. Giá trị F của mô hình là 45,52 với p < 0,0001 (p<0,05) cho thấy dạng mô hình đã đƣợc lựa chọn đúng. Giá trị p của “Không tƣơng thích” là 0,3620 (p>0,05) cho thấy mô hình này tƣơng hợp với thực nghiệm. Phƣơng trình hồi quy biểu hiện hoạt độ enzyme mô tả ảnh hƣởng của các yếu tố độc lập và các mối tƣơng tác giữa chúng đƣợc biểu diễn nhƣ sau: Hoạt độ EPG = +72,02 + 4,53X1 + 1,55X2 + 2,61X3 + 3,40X1X2 – 2,00X1X3 + 3,13X2X3 – 6,91X1 2 – 7,04 X2 2 – 2,53X3 2 . Trong đó: X1 – Độ ẩm, X2 – Hàm lƣợng pectin, X3 – Nhiệt độ -61- Bảng 3.10 Ma tr n thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố và hoạt độ EPG thu được trong các điều kiện nuôi cấy khác nhau TN Độ ẩm (%) Hàm lƣợng pectin (%) Nhiệt độ ( o C) Hoạt độ EPG (U/g) 1 50 10 30 54,42 2 70 10 30 58,28 3 50 14 30 51,05 4 70 14 30 68,53 5 50 12 30 53,71 6 70 12 25 65,17 7 50 12 35 64,00 8 70 12 35 67,45 9 60 10 25 62,13 10 60 14 25 58,64 11 60 10 35 60,02 12 60 14 35 69,03 13 60 12 30 70,05 14 60 12 30 72,21 15 60 12 30 73,17 16 60 12 30 71,38 17 60 12 30 73,29 -62- Bảng 3.11 Kết quả ph n tích phương sai mô hình tối ưu bằng phần mềm DX7.1.5 Thông số Tổng p ƣơng sai Chuẩn F Mức c ng ĩa p Mô hình 817,94 45,52 <0,0001 X1 X2 X3 X1X2 X1X3 164,26 19,22 54,34 46,38 16,04 76,85 8,99 25,42 21,70 7,50 <0,0001 0,0200 0,0015 0,0023 0,0289 X2X3 39,06 18,28 0,0037 X1 2 X2 2 X3 2 Không tƣơng thích 201,12 208,61 26,87 7,70 94,09 97,60 12,57 1,41 <0,0001 <0,0001 0,0094 0,3620 Sử dụng phƣơng pháp hàm kỳ vọng để tối ƣu hóa hoạt độ EPG thu đƣợc sau quá trình nuôi cấy bằng phần mềm Design-Expert. Kết quả tìm đƣợc 43 phƣơng án thí nghiệm trong đó phƣơng án tốt nhất để cực đại hàm mục tiêu dự đoán là: độ ẩm 64%, hàm lƣợng pectin 12,5% và nhiệt độ 31oC. Khi đó, hoạt độ EPG đạt đƣợc trong các điều kiện trên theo tính toán là 73,4 U/g (hình 3.8). Thực nghiệm nuôi cấy A. niger UV06-12-23 trên môi trƣờng rắn tại điều kiện tối ƣu (độ ẩm 64%, pectin 12,5%, 31oC) sau 3 ngày thu đƣợc hoạt độ EPG 73,15 U/g, kết quả này có độ tƣơng thích cao so với lý thuyết. Hình 3.8 Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu để nuôi cấy thu EPG từ A. niger UV06-12-23 -63- Nhƣ vậy, kết quả nghiên cứu đã xác định đƣợc các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp endopolygalacturonase của chủng A. niger UV06-12-23 là 31oC, hàm lƣợng pectin 12,5%, độ ẩm là 64%. Hoạt độ enzyme đạt 73,15 U/g sau 72 giờ nuôi. Dƣới điều kiện tối ƣu cho lên men rắn chủng đột biến A. niger GHRM5 sinh tổng hợp EPG với hoạt độ 42,66 U/g [59]. Theo Maci