Luận văn Nghiên cứu tinh chế và phân tích đặc điểm cấu trúc của fucoidan từ rong nâu Sargassum oligocystum

t Nam đã xuất hiện trên thị trƣờng dƣới dạng thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị bệnh 38 ung thƣ và viêm loét dạ dày do Công ty Cổ phần Fucoidan Việt Nam sản xuất là: FucoUmi, FucoAntiK và Fucogastro. Ngoài ra, fucoidan cũng đƣợc sử dụng nhƣ một thành phần chức năng trong sản phẩm sữa chua fucoidan và nƣớc yến fucoidan của Công ty Sannet Khánh Hòa. Nhƣ vậy có thể thấy, fucoidan với rất nhiều hoạt tính sinh học thú vị cũng nhƣ tiềm năng ứng dụng hết sức rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của cuộc sống đang ngày càng thu hút sự quan tâm nghiên cứu mạnh mẽ của các nhà khoa học trên toàn thế giới. 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM LIÊN QUAN ĐẾN NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN VĂN 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Qua tham khảo các tài liệu đã công bố về nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan trên thế giới, chúng tôi nhận thấy fucoidan từ rong nâu là một polymer sinh học có cấu trúc rất phức tạp bởi tính đa dạng và sự không đồng nhất về thành phần đƣờng cũng nhƣ vị trí nhóm sulfate trên các gốc đƣờng [26,28,38,68,69]. Vì vậy, dù đã có rất nhiều công trình công bố về cấu trúc của fucoidan, nhƣng chỉ có một số công bố đƣa ra đƣợc cấu trúc một cách rõ ràng mà phần lớn chỉ đƣa ra cấu trúc của một phân đoạn có độ lặp lại cao của chúng. Cho đến nay những công bố về cấu trúc của fucoidan một cách rõ ràng nhất là fucoidan đƣợc phân lập từ các loài rong nâu sinh trƣởng ở vùng ôn đới nhƣ Fucus evnescens C.Ag, Fucus vesiculosus, Fucus distichus, Ascophyllum nodosum, Cấu trúc của fucoidan có thể khác nhau giữa các loài rong nâu khác nhau và có thể thay đổi khác nhau ngay trong cùng một loài.. Về cơ bản chia làm hai nhóm, một nhóm fucoidan từ Laminaria saccharina, L. digitata, Analipus japonicus, Cladosiphon okamuranus, và Chorda filum có mạch chính đƣợc tạo thành bởi liên kết lặp lại đều đặn của các gốc (1→3)-α-L- fucopyranose, với một số nhóm sulfate ở vị trí C-2 hoặc vị trí C-4. Nhóm thứ hai bao gồm fucoidan từ các lòai rong Fucus và Ascophyllum nodosum có liên 39 kết chính lặp lại một cách tuần tự các gốc (1→3)-α-L-fucopyranose và (1→4)-α-L-fucopyranose . Các fucoidan này đƣợc miêu tả ở bảng 1.4. Bảng 1.4. Cấu trúc hóa học của các fucoidan từ một số loài rong nâu Loài rong nâu Cấu trúc hóa học của các Fucoidan TLTK Analipus japonicus 3(4Fucp) và 1 (2Fucp) /10 (1→3)-α-L- Fucp(2/4SO3 - ) Bilan et al.,2007 [70] Ascophyllum nodosum [→3)-α-L-Fucp(2SO3 - )-(1→4)-α-L- Fucp(2,3-điSO3 - )-(1→]n Chevolot etal.,2011[27] A.nodosum (1→3)-α-L-Fucp và một ít (1→4)-α-L-Fucp cùng (1→3)-α-L-(2 và hoặc 4 Fucp) Mariais etal.,[71] Chorda filum -[→3)-α-L-Fucp-(1-]3→3)-α-L- Fucp(2Fucp)-(1→ Chizhov et al.,1999[72] Fucusdistichus L →3)-α-L-Fucp-(2,4-diSO3 - )-(1→4)-α-L- Fucp-(2SO3 - )-(1→ Bilan et al.,[28] F.evanescens →3)-α-L-Fucp(2SO3 - )-(1→4)-α-L- Fucp(2SO3 - )-(1→ Bilan et al.,[37] F.serratus L →3)-α-L-Fucp(2R1,4R2)-(1→4)-α-L- Fucp(2SO3 - )-(1→ a. (~50%): R1 = SO3 - , R2 = H b. (~50%): R1 = H, R2 = α-L-Fucp-(1→4) )- α-L- Fucp(2SO3 - )-(1→3)-α-L-Fucp(2SO3 - )-(1→ Bilan et al.,2006 Laminaria sacharina →3)-α-L-Fucp(4SO3 - )-(1→ và thêm →3) )- α-L-Fucp(4SO3 - hoặc 2Fucp)-(1→ Usov et al.,1998 [73] Stoechosperm ummarginatum →3)-α-L-Fucp(2/4SO3 - )-(1→ và →4-α-L- Fucp(2SO3 - )-(1→ Adhikari et al.,2006 [74] 40 Daniel và cộng sự chiết tách fucoidan từ rong nâu A.nodosum đã sử dụng các enzyme đặc hiệu làm xúc tác sinh học để thủy phân tạo fucoidan oligosaccharide và khẳng định sự có mặt của lƣợng lớn các liên kết glycoside của gốc α -L-fucose(1→3) và α -L-fucose (1→4)[75]. Cấu trúc fucoidan từ loài rong Ecklonia kurome đã đƣợc công bố năm 1991 bởi Nishino và Nagumo. Phổ NMR của polysaccharide là quá phức tạp để cho phép giải thích cấu trúc một cách trực tiếp, có thể do tính dị thể của cấu trúc. Cấu trúc của fucoidan này chủ yếu là α -L-fucose(1→3) với các nhóm sulfate ở C-4, không loại trừ sự có mặt của các nhóm sulfate khác hoặc các nhánh ở vị trí 2 [76]. Fucoidan từ Sargassum binderi là →3)fuc(2-OSO3 - )(1→3)fuc(1→ [77]. Fucoidan tách và phân lập từ rong nâu Pelvetia canaliculata bằng phƣơng pháp sử dụng enzyme đặc hiệu để thủy phân về fucoidan oligosaccharide bao gồm tetrasaccharide và hexasaccharide có chứa các đơn vị lặp lại disaccharide →3)-α-L-Fucp (2SO3 -)(1→4)-α-L-Fucp-2,3 (đi SO3 - )(1→, dùng enzyme đặc hiệu này chỉ thủy phân liên kết (1→4) do đó xác định đƣợc cấu trúc hoàn thiện của fucoidan này là [→4)-α-L-Fucp-2,3(đi SO3 - )(1→3)-α-L-Fucp(2SO3 -)(1→]n [1]. Fucoidan tách và phân lập từ rong nâu Cladosiphon okamuranus bằng phƣơng pháp sử dụng enzyme đặc hiệu để thủy phân về fucoidan oligosaccharide có cấu trúc là {→3)-α-L-Fucp-(1→3)-α-L-Fucp-4(SO3 - )(1→3)-α-L-Fucp-4(SO3 -)(1→3)-[α-D-GlcpA-(1→2)]-α-L-Fucp-(1→}m-3)- α-L-Fucp-(1→3)-α-L-Fucp-4(SO3 -)(1→3)-α-L-Fucp-4(SO3 -)(1→3)-L-Fuc (m =0, 1, 2, 3) [1]. Fucoidan tách và phân lập từ rong nâu Kjellmaniella crassifolia bằng phƣơng pháp sử dụng enzyme đặc hiệu để thủy phân về fucoidan oligosaccharide có đơn vị cấu trúc cơ bản lặp lại là trisaccharide {→4)-β-D- GlcpA-(1→2)-[α-L-Fucp(3SO3 -)(1→3)]-α-D-Manp-(1→}n [1]. Trong thành phần của các fucoidan ngoài fucose và sulfate còn có một lƣợng nhỏ các monosaccharide nhƣ galactose, glucose, mannose, xylose, 41 uronic axit. Cùng với sự xuất hiện của nhóm O-acetyl và các mạch nhánh trong phân tử fucoidan càng tăng thêm tính dị thể về cấu trúc của chúng. Một số fucoidan mà thành phần chủ yếu là galactose, fucose và sulfate hay còn gọi là galactofucan sulfate đƣợc tách từ một số loài rong nâu nhƣ Laminaria angustata, Laminaria longissima, Alaria fistulosa, Undaria pinnatifida, Laminaria japonica, Laminaria cichorioides, Laminaria gurjanovae và Sargassum patens. Trong khi đó có rất nhiều fucoidan có cấu trúc rất phức tạp đƣợc tách chiết và phân lập từ một số loài rong nâu Dictyota menstrualis, Padina gymnospora, Spatoglossum schroederi, Hizikia fusiforme, Sargassum fusiforme, Kjellmaniella crassifolia. Thành phần hóa học của chúng chứa rất nhiều các đƣờng đơn nhƣ fucose, galactose, glucose, mannose, xylose, còn có uronic axit và sulfate, ngoài ra có thể có nhóm acetyl hóa. Vì vậy việc xác định cấu trúc của chúng đang là một thách thức đối với các nhà khoa học nghiên cứu cấu trúc của polysaccharide nói chung và fucoidan nói riêng, tuy vậy chúng ta có thể xác định đƣợc đặc điểm cấu trúc đặc trƣng của fucoidan. Trong trƣờng hợp này các nhà khoa học phải sử dụng nhiều kỹ thuật khác nhƣ phân tích methyl hóa, đề sulfate hóa, tự thủy phân, enzyme thủy phân fucoidan, kết hợp cùng các phƣơng pháp hóa lý hiện đại nhƣ NMR 2D, 3D, MALDI-TOF/MS/MS, SAXS để giải quyết bài toán cấu trúc phức tạp của fucoidan. Việc áp dụng các phƣơng pháp phân tích khối phổ hiện đại MALDI- TOF/MS/MS và ESI-MS/MS để phân tích cấu trúc của các polysaccharide nói chung và fucoidan nói riêng đã tạo ra một bƣớc đột phá mới trong phân tích cấu trúc phức tạp của polysaccharide rong biển. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là khả năng phân tích nhanh và chính xác vị trí của nhóm sulfate cũng nhƣ trật tự giữa các gốc đƣờng trong phân tử fucoidan. Việc áp dụng thành công phƣơng pháp này nhóm nghiên cứu của Anastyuk ở Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dƣơng, Viện Hàn lâm Khoa học Nga, Chi nhánh Viễn Đông, Liên Bang Nga đã công bố lại cấu trúc fucoidan từ loài rong Fucus evanescens và thêm 03 loại cấu trúc fucoidan mới từ các loài rong Costaria costata, Laminaria cichorioides và Coccophora langsdorfii đã đƣợc công bố. Nhóm nghiên cứu do Giáo sƣ Usov đứng đầu thuộc Viện Hóa Hữu cơ, Viện 42 Hàn lâm Khoa học Nga đi tiên phong trong việc sử dụng các phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều 1D và hai chiều 2D để nghiên cứu cấu trúc của fucoidan. Kết quả đã có 04 loại cấu trúc của fucoidan từ các loài rong nâu Laminaria saccharina, Fucus evanescen, Fucus serratus, Fucus distichus L. của Nga đƣợc công bố. Do sự đa dạng về cấu trúc và hoạt tính sinh học với khả năng ứng dụng rất lớn trong lĩnh vực công nghiệp dƣợc liệu. Vì vậy dù đã đƣợc bắt đầu nghiên cứu từ hơn 100 năm trƣớc, hiện nay fucoidan vẫn luôn thu hút đƣợc sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới nhằm tìm kiếm các loại thuốc mới. Cho đến nay, phần lớn các công bố về hoạt tính sinh học của fucoidan đƣợc thực hiện trên các sản phẩm fucoidan thƣơng mại hoặc chiết thô nên mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan thực tế vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu một cách rõ ràng. Vì vậy, để có thể sử dụng fucoidan làm thuốc thì yếu tố tiên quyết và quan trọng nhất là phải xác định đƣợc cấu trúc chi tiết của chúng. Năm 2017, nhóm nghiên cứu do Roza V. Usoltseva đứng đầu cùng với các cộng sự thuộc Viện Hóa Hữu cơ, Viện Hàn lâm Khoa học Nga bằng phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều 1D, hai chiều 2D và khối phổ đã xác định đƣợc cấu trúc của fucoidan từ rong nâu Sargassum duplicatum với thành phần chủ yếu là galactose, fucose và sulfate hay còn gọi là galactofucan sulfate. Trong đó, hàm lƣợng sunfate chiếm 31,7%, tỉ lệ giữa các gốc đƣờng Fuc:Gal ~ 1:1. Cấu trúc mạch chính của fucoidan đƣợc chiết từ rong Sargassum duplicatum đƣợc tạo ra từ các đơn vị lặp lại {→4)-α-L-Fuc- (1→4)-β-D-Gal- 1→}n Cấu trúc của fucoidan này chủ yếu là liên kết α -L-fucose(1→3) và α- L-fucose(2→4), với các nhóm sunfate chủ yếu ở vị trí C2, C4 và ít hơn ở C3 trên gốc đƣờng fucose, nhóm sunfate chủ yếu tại vị trí C2, C3 và ít hơn ở C4, C6 trên gốc đƣờng glactose [78]. Đến khoảng cuối năm 2017, nhóm nghiên cứu do Roza V. Usoltseva đứng đầu cùng với các cộng sự thuộc Viện Hóa Hữu cơ, Viện Hàn lâm Khoa học Nga đã có những công bố mới về đặc điểm thành phần và cấu trúc fucoidan thu nhận từ rong nâu Padina boryana. Về thành phần, fucoidan đƣợc 43 thu nhận từ rong nâu Padina boryana có hàm lƣợng sunfat là 18,6%, trong thành phần có chứa các gốc đƣờng gồm fucose (39,8%mol), galactose (36,7%mol), manose (17,4%mol), glucose (6%mol) [79]. Trƣớc đây, rong nâu Padina boryana cũng đã đƣợc nhóm nghiên cứu do giáo sƣ Shevchenko đứng đầu công bố trong thành phần chứa hàm lƣợng sunfate 18,2%, fucose (61%mol), galactose (31%mol), manose (4%mol), glucose (3%mol), ngoài ra còn có nhóm axetyl. Sự khác nhau về thành phần này đƣợc giải thích là do sự khác nhau về phƣơng pháp chiết. Việc xác định chính xác cấu trúc của fucoidan là vô cùng khó khăn, vì vậy tác giả đã tiến hành một số phản ứng phụ nhằm tách nhóm sunfate và axetyl. Sau khi thực hiện các phản ứng phụ này, fucoidan mới đƣợc phân lập trong thành phần chỉ chứa 2 loại gốc đƣờng galactose và fucose đƣợc gọi là galactofucan. Bằng phƣơng pháp phổ NMR, fucoidan mới đƣợc phân lập trong thành phần mạch chính có liên kết 1,4-α-L- fucopyranose và 1,3-β-D-Galactopyranose. Để làm sáng tỏ cấu trúc, các nhà khoa học đã tiến hành phản ứng tự thủy phân nhằm mục đích thu đƣợc các mảnh oligosaccharide và xác định chúng bằng khối phổ. Kết quả thu nhận đƣợc các mảnh disaccharide gồm fucose và galactose liên kết với nhau bằng liên kết 1,3 hoặc 1,4. Nhóm chức sunfate đính vào các vị trí C2,C3 và C4 trên cả 2 gốc đƣờng fucose và galactose [79]. 1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam Fucoidan mới chỉ đƣợc biết đến và nghiên cứu trong khoảng hơn 10 năm trở lại đây bởi các nhà khoa học thuộc Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Năm 2006, lần đầu tiên tại Việt Nam, Phân viện Khoa học Vật liệu tại Nha Trang (nay là Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang) đã đƣa ra quy trình công nghệ chiết xuất và phân lập fucoidan từ rong nâu Việt Nam. Đây là một quy trình công nghệ cao, sử dụng màng siêu lọc cho phép đồng thời cô đặc và loại bỏ tạp chất khỏi dung dịch fucoidan tại nhiệt độ phòng, nhờ vậy giữ nguyên đƣợc hoạt tính sinh học tự nhiên vốn có của chúng. Nƣớc ta với nguồn tài nguyên rong nâu vô cùng đa dạng và phong phú. Tuy nhiên, các nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan rong 44 nâu Việt Nam vẫn còn rất hạn chế. Các nghiên cứu công bố về fucoidan từ rong nâu Việt Nam chủ yếu đƣa ra các đặc điểm về cấu trúc nhƣ thành phần đƣờng, vị trí nhóm sulfate và phần lớn chúng thực hiện trên các mẫu fucoidan chiết thô. Năm 2008, NCS Nguyễn Duy Nhứt đã công bố thành phần và cấu trúc của phân đoạn fucoidan F20 đƣợc phân lập từ rong Sargassum swartzii với thành phần chủ yếu là fucose (> 45%), bên cạnh đó các đƣờng đơn khác nhƣ rhamnose, mannose và galactose cũng chiếm hàm lƣợng đáng kể (10,81 - 22,07%), tác giả đã đƣa ra trình tự liên kết giữa các gốc đƣờng hexose, uronic axít và fucose, nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C4 trong phân đoạn F20 [69]. Thành Thị Thu Thủy và cộng sự đã công bố fucoidan từ rong Turbina ornata có hàm lƣợng sulfate cao và thành phần đƣờng rất đơn giản chỉ gồm fucose và galactose theo tỉ lệ 3:1, đây là một dạng galactofucan sulfate hóa. Cấu trúc bộ khung của chúng là các gốc α-L-Fucp liên kết 3, sulfate chủ yếu ở vị trí C2 và một phần ở vị trí C4. Nhóm sulfate cũng đƣợc phát hiện thấy chiếm ƣu thế ở vị trí C2 và một phần ở vị trí C4 của gốc galactose trong mạch nhánh đƣợc tạo nên bởi các gốc galactose liên kết 4 [26,80]. Hàm lƣợng fucoidan trong rong Nâu Việt Nam chiếm từ 0,5-2,7 % khối lƣợng khô và chúng thuộc về nhóm galactofucan sunfate. Các fucoidan chiết từ 05 loài rong S. polycystum, S. oligocystum, S. swatzii, S. denticarpum và Turbinaria ornata có hoạt tính chống ung thƣ gan (Hep-2), ung thƣ màng tim (RD) và fucoidan chiết từ rong S.mcclurei có hoạt tính chống ung thƣ vú cả 06 loại fucoidan này đều có hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính chống kháng trực khuẩn mủ xanh là P. Aeruginosa. Trong số fucoidan đem thử hoạt tính thì fucoidan từ rong S.polycystum và Turbinaria ornata có hoạt tính cao nhất. Sử dụng các phƣơng pháp phân tích hóa học, GLC, IR, NMR và ESI-MS nhóm tác giả đã bƣớc đầu đƣa ra đƣợc đặc điểm cấu trúc của các phân đoạn fucoidan từ loài rong S.polycystum; S.swartzii và Turbina ornata [26,80]. Vị trí nhóm sunfate trong fucoidan chiết từ 03 loài rong thuộc chi rong Sargassum và loài rong Turbina ornata nằm ở vị trí C4 của vòng pyranosse và chỉ một phần H4 bị sulfate hóa. Nhóm sulfate ở vị trí C4 của cả 02 monome: fucose và galactose đối với fucoidan từ rong Turbina ornata. Liên 45 kết glycoside chính trong mạch là liên kết (1→3) và có thể có mạch nhánh. Tuy nhiên các cấu trúc đƣa ra trên vẫn chỉ là dự đoán và còn một số vấn đề chƣa giải quyết thỏa đáng đó là các dữ liệu phổ về các kiểu liên kết và các chuỗi oligosaccharide trong mạch chính và mạch nhánh của fucoidan. Năm 2013, các tác giả Bùi Minh Lý, Thành Thị Thanh Thủy, Trần Thị Thanh Vân, Usov và cộng sự đã tìm ra đƣợc cấu trúc của fucoidan từ Sargassum polycystum Việt Nam : Hình 1.9. Cấu trúc của fucoidan từ Sargassum polycystum Phạm Đức Thịnh và cộng sự [46] đã chiết tách fucoidan từ 05 loài rong S. denticapum, S. polycystum, S. swartzii, S. mcclurei và Turbina ornata và nghiên cứu đặc trƣng cấu trúc của các phân đoạn đại diện cho fucoidan của mỗi loài rong, thu đƣợc những kết quả chính sau: - Phân đoạn fucoidan SdF3 từ rong S.denticapum có thành phần là fucose (51,9%), galactose (34,4%), mannose (5,8%) và xylose (8,9%). Hàm 46 lƣợng sulfate (39,14%). Liên kết đƣờng trong mạch chủ yếu là liên kết 1→3, nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C4. - Phân đoạn fucoidan SpF3 từ rong S.polycystum có thành phần là fucose (68,8%), galactose (26,9%) và xylose (4,5%), hàm lƣợng sulfate (33,99%). Liên kết đƣờng trong mạch chủ yếu là liên kết →3)-α-L- Fucp-(1→, nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C4. - Phân đoạn fucoidan SwF5 từ rong S.swartzii có thành phần là fucose (57,1%), galactose (27,4%), mannose (4,0%), xylose (0,9%), rhamnose (2,0%) và glucose (2,0%), hàm lƣợng sulfate (42,3%). Liên kết đƣờng chủ yếu trong mạch là →3)-α-L-Fucp-(1→ và một phần liên kết →4)- α-L-Fucp-(1→, nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C2. - Phân đoạn fucoidan SmF3 từ rong S.mcclurei có thành phần là fucose (58,5%), galactose (41,5%), hàm lƣợng sulfate (35%) . Liên kết đƣờng trong mạch chủ yếu là →3)-α-L-Fucp-(1→ và một phần liên kết →4)- α-L-Fucp-(1→, nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C2 và/hoặc C4. - Phân đoạn fucoidan ToF2 từ rong Turbina ornata có thành phần là fucose (69,6%), galactose (27,7%) và rhamnose (2,7%), hàm lƣợng sulfate (43,26%). Liên kết đƣờng chủ yếu trong mạch là →3)-α-L- Fucp-(1→ và một phần liên kết →4)-α-L-Fucp-(1→, nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C2. - Phân đoạn fucoidan SmF3 từ rong Sargassum mcclurei, cấu trúc của chúng gồm: →3)-Fuc(2,4SO3 - )-(1→3)-Fuc(2,4SO3 - )-(1→ chèn thêm vào gốc α-L-Fucp(3SO3 -) liên kết 4 và gốc galactose liên kết 6 ở đầu cuối khử. Fuc(2SO3 - )-(1→4)-Gal-(1→3)-Fuc(2SO3 - )-(1→4)-Gal-(1→3)-Fuc Gal(2SO3 - )-(1→3)-Fuc(2SO3 - )-(1→4)-Gal-(1→3)-Fuc-(1→3)-Fuc Lần đầu tiên phát hiện ra sự có mặt đồng thời của các gốc →3)-α-L- Fucp và gốc →4)-β-D-Gal liên kết luân phiên trong mạch galactofucan từ rong Sargassum 47 Trong luận án của Hồ Đức Cƣờng [18] fucoidan chiết tách từ rong nâu Sargassum henslowianum đã đƣợc xác định với thành phần đƣờng chính là fucose và glucose. Cấu trúc hóa học của fucoidan này có mạch chính tạo thành từ α-(1→3)-L-fucose và bị sulfate hóa chủ yếu ở vị trí C-2, C-4 và một phần của C-3 của fucose. Glucose bị sulfate hóa tại vị trí C-4 và liên kết với mạch chính qua liên kết glycoside (1 - 4). Đây là một fucoidan có cấu trúc mới vì đa số các fucoidan chỉ bị sulfate hóa ở vị trí 1 hoặc 2 của gốc đƣờng fucose, trong khi fucoidan này cả 3 vị trí C-2, C-3 và C-4 đều bị sulafte hóa. Đã xác định fucoidan tách chiết từ rong nâu Sargassum swartzii có cấu trúc mạch nhánh và cấu trúc không gian của cả phân tử và ở kích thƣớc cỡ nano đều có dạng hình que. Bằng cách sử dụng cùng các phƣơng pháp hiện đại nhƣ tán xạ ánh sáng (LS) và tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS), cả cấu trúc hóa học và cấu trúc không gian của fucoidan đƣợc nghiên cứu . Hồ Đức Cƣờng và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính sinh học in vivo (lần đầu tiên ở Việt Nam) và in vitro của fucoidan từ rong nâu Sargassum henslowianum và rong nâu Sargassum swartzii thể hiện hoạt tính gây độc tế bào yếu trên các dòng tế bào ung thƣ thử nghiệm nhƣng không thể hiện hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định. Fucoidan từ rong nâu Sargassum henslowianum và rong nâu Sargassum swartzii ở liều 100mg/kgP/ngày đã có tác dụng làm giảm một số chỉ tiêu sinh hoá mỡ máu, khối lƣợng mỡ trên mô hình chuột béo phì. Đến năm 2017, Bùi Văn Nguyên và cộng sự đã chiết xuất, phân lập, xác định các thành phần cấu tạo và khối lƣợng phân tử trung bình của các fucoidan từ 06 loài rong nâu của Nha Trang là: S. polycystum (Fsp), S. mcclurei (Fsm), S. oligocystum (Fso), S. denticarpum (Fsd), S. swatzii (Fss), và T. ornata (Fto)[81]. 48 Bảng 1.5. Hàm lƣợng, thành phần hóa học và KLPT trung bình của các mẫu fucoidan phân lập từ 6 loài rong nâu Việt Nam Tên loài (ký hiệu mẫu fucoidan) HS (%) Thành phần đƣờng trung bình (% mol) Gluc A (%) Sulfate (%) M W kDa Fuc Man Gal Xyl Glc S. polycystum (Fsp) 2,70 32,4 2,7 36,3 11,1 10,2 6,8 25,7 52 S. mcclurei (Fsm) 2,10 40,0 2,1 33,1 6,2 20,6 5,2 26,5 26 S. oligocystum (Fso) 1,60 37,6 1,6 37,0 10,7 7,1 6,5 24,9 38 S. denticarpum (Fsd) 2,20 42,1 2,2 38,9 15,9 2,0 5,8 25,2 41 S. swatzii (Fss) 0,68 37,0 0,68 34,8 15,5 6,5 7,4 23,4 41 T. ornata (Fto) 2,75 30,3 vết 9,0 vết vết 7,8 25,6 88 Điểm nổi bật nhất trong luận án của tác giả Bùi Văn Nguyên là đã nghiên cứu và mô tả đƣợc đặc điểm cấu trúc của fucoidan từ hai loài rong Sargassum duplicatum và Sargassum binderi. Kết quả cho thấy các fucoidan từ hai loài rong này là các galactofucan sulfate. Kết quả này một lần nữa góp phần khẳng định đại đa số các fucoidan tách từ các loài rong nâu sinh trƣởng ở vùng nhiệt đới thƣờng gặp dạng galactofucan sulfate. Các kết quả nghiên cứu phổ IR, NMR (1D và 2D) và ESI-MS/MS chothấy phân đoạn FTD-2,0N từ rong Turbinaria decurrens là một galactofucan tạo thành từ 2 loại đƣờng (1→3)-α-L-Fuc với nhóm thế sulfate tại vị trí C-2 và β -D-galactose mang nhóm sulfate tại vị trí C-6. Galactose nối 49 với fucose qua liên kết glucoside 1→4. Mảnh cấu trúc cơ bản của FTD-2,0N đƣợc đề xuất nhƣ sau: [→3-α-L-Fucp2(OSO3 - )-(1→4)-β-D-Gal6(OSO3 - )-1→]n Hình 1.10. Mảnh cấu trúc cơ bản fucoidan chiết tách từ rong Turbinaria decurrens Bùi Văn Nguyên và cộng sự [81] đã tiến hành nghiên cứu hình dáng và kích thƣớc của các mẫu fucoidan bằng phƣơng pháp tán xạ tia X góc nhỏ. Kết quả phân tích đồ thị Kratky của sự tán xạ tia X góc nhỏ cho thấy các mẫu fucoidan có hình dáng kiểu que (rod-like) với các mạch nhánh cồng kềnh và mức độ phân nhánh khác nhau. Kết quả tính toán cho các mô hình lý thuyết cho thấy các mạch nhánh có khả năng nằm kề nhau và có độ dài tới 5 gốc đƣờng. Ngoài ra, tác giả Bùi Văn Nguyên đã thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào của các mẫu fucoidan trên hai dòng tế bào ung thƣ gan Hep-G2 và ung thƣ mô liên kết RD. Kết quả cho thấy các mẫu α đều thể hiện hoạt tính. Hai mẫu có hoạt tính cao nhất là Fto (IC50 đối với Hep-G2 và RD là 3,1 và 1,6 µg/mL) và Fsp (IC50 đối với Hep-G2 và RD là 5,5 và 5,7 µg/mL). 50 Bảng 1.6. Hoạt tính gây độc tế bào của các mẫu fucoidan trên các dòng tế bào ung thƣ gan Hep-G2 và ung thƣ mô liên kết RD Mẫu Fucoidan Hep-G2 RD CS% IC50 (µg/mL) CS% IC50 (µg/mL) S. polycystum (Fsp) 29.7 5.5 11.8 5.7 S. mcclurei (Fsm) 39.3 14.2 64.8 > 20 S. oligocystum (Fso) 35.3 15.8 11.2 11.4 S. denticarpum (Fsd) 37.5 7.3 27.9 15.9 S. swatzii (Fss) 31.1 5.8 16.5 18.7 T. ornata (Fto) 21.8 3.1 4.5 1.6 Khảo sát mối liên hệ giữa hoạt tính gây độc tế bào với một số đặc điểm cấu tạo và cấu trúc của các mẫu fucoidan sơ bộ cho thấy: - Khối lƣợng phân tử trung bình có tƣơng quan rõ rệt nhất với hoạt tính gây độc tế bào. Các mẫu có khối lƣợng phân tử trung bình cao nhất cũng có hoạt tính cao nhất. Các mẫu có khối lƣợng phân tử trung bình thấp nhất cũng có hoạt tính thấp nhất; - Mức độ sulfate hóa của các đƣờng cũng thể hiện ở một mức độ nhất định tƣơng quan với hoạt tính gây độc tế bào. Tỉ lệ sulfate/đƣờng cao gắn liền với hoạt tính cao và ngƣợc lại; - Không thấy có biểu hiện tƣơng quan rõ rệt giữa mức độ cồng kềnh (độ dài) của các mạch nhánh (thể hiện qua bán kính hồi chuyển của mặt cắt ngang Rgc) với hoạt tính gây độc tế bào. Các dữ kiện trên gợi ý rằng khối lƣợng phân tử cao và cấu trúc phân nhánh với tỉ lệ sulfate/đƣờng cao là các yếu tố cần thiết cho hoạt tính gây độc tế bào của các mẫu fucoidan. Năm 2017, Bilan và cộng sự đã công bố cấu trúc của fucoidan từ Sargassum aquifolium Việt Nam, bằng phƣơng pháp phân tích methyl hóa kết 51 hợp phổ NMR các tác giả này đã xác định đƣợc 03 polysaccharide có cấu trúc khác nhau sau khi khử sunfate deS-2, deS-4, deS-6. Ngoài ra, nhóm các nhà khoa học này đã sử dụng thêm phƣơng pháp đo phổ NMR, HSQC và chứng minh đƣợc rằng fucoidan thu nhận từ rong Sargassum aquifolium là một polysaccharide sulfate có cấu trúc vô cùng phức tạp. Thành phần mạch chính đƣợc bắt đầu với fuco(xylo)glucuronomannan, xylo(fuco)glucuronan và fucogalactan, mức độ phân nhánh cao và bất thƣờng. Trong thành phần cấu trúc có chƣa các gốc đƣờng mannose, galactose, fucopyranose, xylose, fucofuranose, glucoronic axit và một số lƣợng lớn nhóm sunfate đính tại các vị trí khác nhau. Hình 1.11. Sơ đồ cấu trúc deS-2, deS-4, deS-6 rong Sargassum aquifolium 52 Kết luận: Tổng quan cho thấy, Việt Nam mặc dù có nguồn tài nguyên rong nâu vô cùng đa dạng và phong phú [9,10,11,14]. Tuy nhiên, các nghiên cứu về fucoidan từ rong nâu Việt Nam mới chỉ bắt đầu từ hơn một thập kỉ nay và số các công bố về thành phần, cấu trúc của fucoidan phân lập từ các loài rong nâu Việt Nam vẫn còn rất hạn chế. Do vậy, tôi chọn đề tài “Nghiên cứu tinh chế và phân tích đặc điểm cấu trúc của fucoidan từ rong nâu Sargassum oligocystum” là cần thiết nhằm đóng góp thêm các nghiên cứu về fucoidan từ rong nâu Việt Nam theo hƣớng phát triển các hoạt chất mới cũng nhƣ khả năng ứng dụng hiệu quả của fucoidan trong lĩnh vực y dƣợc. 53 CHƢƠNG 2.NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU Việc nghiên cứu thành phần hóa học và cấu trúc của fucoidan có ý nghĩa quan trọng trong việc tìm kiếm nguồn dƣợc liệu mới từ tài nguyên rong biển, từ đó làm cơ sở cho việc khai thác và sử dụng một cách hợp lý nguồn tài nguyên rong biển ở Nha Trang nói riêng và ở khu vực Nam Trung Bộ của Việt Nam nói chung. Vì vậy, trong khuôn khổ thực hiện đề tài, tôi tiến hành nghiên c