Luận văn Nghiên cứu ứng dụng enzym tanase để thủy phân tanin và thử nghiệm lên men rượu vang từ dịch ép quả điều

đa số nấm men, thời gian lên men chính tốt nhất là 5-20 ngày, thời gian lên men phụ và tàng trữ các loại rượu phải từ vài tháng trở lên. Thời gian lên men chịu ảnh hưởng của các yếu tố như: nhiệt độ lên men, nồng độ đường, chủng nấm men,Nếu nồng độ đường càng cao thì thời gian lên men càng dài. Ngoài ra, lượng men ban đầu bổ sung cũng là một yếu tố quyết định thời gian lên men. Với đa số các loại vang, lượng giống bổ sung vào khoảng 3-10% v/v dịch lên men [28]. Do vậy mà việc xác định thời gian lên men là điều hết sức quan trọng để đảm bảo quá trình lên men tối ưu cho ra sản phẩm đạt chất lượng tốt nhất. 1.6.6.8. Ảnh hưởng của CO2 Hàm lượng CO2 hình thành trong quá trình lên men rượu từ đường được tách làm 3 phần: một phần tồn tại trong môi trường, phần thứ hai sẽ nổi lên trên bề mặt và phần còn lại được tích tụ thành một lớp màng có thể ngăn cách giữa không khí và môi trường. Lớp màng ngăn này làm giảm khả năng sinh sản của nấm men nhưng vẫn lên men bình thường. Nếu hàm lượng khí CO2 cao sẽ gây ức chế cho quá trình lên men nhưng lại có tác dụng tốt khi CO2 được thoát ra ngoài sẽ khuấy động môi trường và kéo dài được trạng thái lơ lửng của nấm men, giúp quá trình lên men diễn ra nhanh chóng. Theo nghiên cứu của Miuler- Thurrau: Hàm lượng CO2 trong rượu vang đạt 0,25% trọng lượng thì sẽ gây ức chế sự sinh sản của nấm men, đạt đến 1,5% trọng lượng thì nấm men không sinh sản được [31]. 24 Chương 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 2.1.1. Thời gian Thời gian thực hiện: 02/05/2018 đến 08/09/2019. 2.1.2. Địa điểm Đề tài nghiên cứu được thực hiện tại phòng Hóa lý - Phân tích, Viện Công nghệ Hóa học và phòng Công nghệ Biến đổi Sinh học, Viện Sinh học Nhiệt đới. 2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.2.1. Dịch ép quả điều Quả điều chín vàng sau khi tuyển chọn và thu hái tại tỉnh Bình Phước (tháng 5/2018) được vận chuyển về phòng thí nghiệm, tiến hành rửa sạch để ráo, dùng máy ép trục vít để ép thu lấy dịch quả (hình 2.1). Dịch ép quả điều được cho vào chai nhựa 5 lít đóng kín và bảo quản ở nhiệt độ -10oC trong tủ đông, khi cần sử dụng dịch ép được rã đông đưa về nhiệt độ phòng (25-30oC). 2.2.2. Enzym tanase Enzym tanase (EC 3.1.1.20) ở dạng bột trắng chuyên dùng trong chế biến thực phẩm, từ nhà sản xuất công ty Biochemifa Kikoman, Nhật Bản. Bã Dịch Hình 2.1: Quá trình ép quả điều bằng máy ép trục vít. 25 2.2.3. Gelatin Gelatin thực phẩm được sử dụng trong đề tài có màu vàng, hạt tròn được cung cấp từ công ty phụ gia thực phẩm Sài Gòn. 2.2.4. Vi sinh vật Saccharomyces uvarum 664 được cung cấp từ phòng thí nghiệm hóa thực phẩm trường Đại học California David, Mỹ. Saccharomyces cerevisiae K1 V1116 được cung cấp từ nhà sản xuất công ty Lalvin, Canada. 2.3. MÔI TRƯỜNG, HÓA CHẤT, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 2.3.1. Môi trường - Môi trường nhân giống: Dịch điều đã xử lý đưa về 14 oBrix, pH=4,5, thanh trùng ở 75oC trong 15 phút, dùng làm môi trường nhân giống nấm men. - Môi trường Sabouraud (SBD): Dextrose 40 g, peptone 10 g, agar 5 g, nước vừa đủ 1 lít, pH=5,6 ± 0,2 (25 oC), tiệt trùng ở 121 oC trong15 phút dùng để nhân giống nấm men. - Môi trường PDA: Potatoes 200 g, dextrose 20 g, agar 15 g, nước vừa đủ 1 lít, pH=5,6 ± 0,2 (25 oC), tiệt trùng ở 121 oC trong15 phút dùng định lượng nấm men, nấm mốc. - Môi trường PCA: Casein peptone 5g, yeast extract 2,5 g, dextrose 1 g, agar 15 g, nước vừa đủ 1 lít, pH=7 ± 0,2 (25 oC), tiệt trùng ở 121 oC trong 15 phút dùng để định lượng vi khuẩn hiếu khí. - Môi Trường TSC: Tryptone 15 g, soya peptone 5 g, meat extract B 5 g, yeast extract 5 g, sodium metabisulphite 1g, ferric ammonium citrate 1g, agar 15g, nước vừa đủ 1 lít, pH=7,6 ± 0,2 (25 oC), tiệt trùng ở 121 oC trong 15 phút dùng để định lượng vi khuẩn Clostridium. - Đĩa petrifim 3M (Mỹ) có chứa sẵn các thành phần dinh dưỡng khô và chất tạo đông, dùng định lượng vi khuẩn Escherichia coli và Coliform. 2.3.2. Hóa chất - Hóa chất thực phẩm: + Đường tinh luyện thương phẩm từ nhà máy đường Biên Hòa. 26 - Hóa chất tinh khiết: + Folin-ciocalteu; Potassium iodide (KI); 1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl (DPPH); Axit gallic; Potassium ferric cyanide (K3[Fe(CN)6]); Axit tricloacetic (TCA); Iốt (I2); Monosodium phosphate (NaH2PO4); Disodium phosphate (Na2HPO4); Sulfo-indigocamine; Ferric chloride (FeCl3); Natri cacbonat (Na2CO3); Axit citric; Phenolphtalein của hãng Merck - Đức. + Potassium pemanganate (KMnO4) 0,1N; Sodium hydoxide (NaOH) 0,1N; hồ tinh bột của công ty hóa chất vật liệu điện Cemaco Việt Nam. 2.3.4. Dụng cụ và thiết bị − Bình Schott − Máy đo pH Hanna − Túi lọc vải − Kính hiển vi − Bộ chưng cất cồn − Máy đo OD- HACH − Buồng đếm hồng cầu − Máy ép trục vít − Máy lắc − Máy khuấy từ − Nồi hấp tiệt trùng − Bình định mức 25 mL − Bình tỷ trọng − Cân phân tích Satorius − Khúc xạ kế Atago − Tủ đông Sanaky 400L − Thiết bị ly tâm 4500 vòng/phút − Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao 1260 (HPLC) − Thiết bị đo cường độ màu Abs - DR/2000. 2.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.4.1. Xác định thành phần dinh dưỡng ở dịch ép quả điều ban đầu - Mục đích: Xác định một số thành phần dinh dưỡng ban đầu ở dịch ép quả điều. - Cách thực hiện: Dịch ép quả điều sau khi được rã đông đưa về nhiệt độ phòng (28-30oC) tiến hành phân tích xác định một số thành phần dinh dưỡng theo bảng 2.1. 2.4.2. Xác định sự ảnh hưởng của giá trị pH, nhiệt độ ở dịch ép quả điều và hàm lượng enzym tanase đến hiệu suất thủy phân tanin - Mục đích: Xác định nhiệt độ, pH ở dịch ép quả điều và hàm lượng enzym tanase bổ sung phù hợp, để phản ứng thủy phân tanin bằng enzym tanase đạt hiệu quả cao nhất. - Bố trí thí nghiệm: 27 + Thí nghiệm hai yếu tố, được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với các nghiệm thức theo bảng 2.2, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Bảng 2.1: Một số thành phần dinh dưỡng ở dịch ép quả điều. STT Chỉ tiêu Phương pháp 1 Tanin Chuẩn độ 2 Đường tổng Khúc xạ kế 3 Axit tổng số Chuẩn độ 4 pH Máy đo pH 5 Tổng polyphenol Folin – Ciocalteu 6 DPPH So màu 7 TSS TCVN 9462-2012 8 Vitamin C Chuẩn độ 9 Canxi (Ca) AAS - hấp thu nguyên tử 10 Magie (Mg) AAS - hấp thu nguyên tử 11 Sắt (Fe) AAS - hấp thu nguyên tử 12 Kẽm (Zn) AAS - hấp thu nguyên tử 13 Photpho (P) AAS - hấp thu nguyên tử 14 Kali (K) AAS - hấp thu nguyên tử Bảng 2.2: Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ của dịch ép quả điều đến hoạt tính của enzym tanase. Giá trị pH 4 4,5 5 5,5 Nhiệt độ (oC) 30 NT1 NT2 NT3 NT4 40 NT5 NT6 NT7 NT8 50 NT9 NT10 NT11 NT12 + Sau khi xác định giá trị pH và nhiệt độ tối ưu cho phản ứng thủy phân bằng 28 enzym, tiến hành thí nghiệm một yếu tố để xác định ảnh hưởng của hàm lượng enzym tanase, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Bảng 2.3: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng enzym tanase. Nghiệm thức Hàm lượng enzym tanase (ppm) NT1 50 NT2 100 NT3 200 NT4 300 NT5 400 NT6 500 - Tiến hành thí nghiệm: + Sử dụng máy đo pH để điều chỉnh dịch mẫu về pH tương ứng với từng nghiệm thức (bảng 2.2) bằng dung dịch Na2CO3 10% và axit citric 10%. Điều chỉnh nhiệt độ bằng cách cho dịch ép quả điều vào bể ổn nhiệt. + Sau khi xác định pH và nhiệt độ thích hợp, tiến hành bổ sung enzym tanase ở các hàm lượng như bảng 2.3 để xác định hàm lượng enzym tanase thủy phân tanin đạt hiệu quả cao nhất. - Đánh giá hoạt tính của enzym tanase thông qua các chỉ tiêu theo dõi như sau: Hàm lượng tanin, hàm lượng polyphenol và khả năng kháng oxy hóa theo hai chỉ số: DPPH (IC50) và năng lực khử (giá trị ABS700), xác định pic của axit gallic được tạo thành. 2.4.3. Xác định sự ảnh hưởng của hàm lượng gelatin và nhiệt độ ở dịch ép quả điều đến hiệu suất tách loại tanin. - Mục đích: Dịch ép quả điều sau khi thủy phân bằng enzym tanase, xác định hàm lượng gelatin cần bổ sung và nhiệt độ ở dịch ép quả điều phù hợp để hiệu suất tách loại tanin đạt hiệu quả cao nhất. - Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm một yếu tố, bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần (bảng 2.4). 29 - Tiến hành thí nghiệm + Dịch ép quả điều sau khi bổ sung hàm lượng gelatin theo bảng 2.4, thời gian 30 phút, tiến hành lọc để thu lấy dịch. Dịch thu được đem xác định hàm lượng tanin còn lại, nhằm chọn ra hàm lượng gelatin phù hợp. + Từ hàm lượng gelatin được chọn cho vào dịch ép quả điều tại các khoảng nhiệt độ từ 30-60oC, nhằm chọn ra khoảng nhiệt độ thích hợp ở dịch ép quả điều để đạt hiệu suất tách loại tanin cao nhất. Bảng 2.4: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng gelatin đến quá trình tách loại tanin trong dịch ép quả điều. Nghiệm thức Hàm lượng gelatin (g/L) NT1 1 NT2 2 NT3 3 NT4 4 NT5 5 2.4.4. Xác định một số thành phần dinh dưỡng ở dịch ép quả điều sau khi tách loại tanin - Mục đích: So sánh thành phần dinh dưỡng trước và sau khi tách loại tanin nhằm đánh giá được vai trò hoạt động của enzym tanase trong quá trình thủy phân tanin. - Bố trí thí nghiệm: Các thí nghiệm xác định thành phần dinh dưỡng được thực hiện giống ở nội dung 2.4.1. 2.4.5. Khảo sát môi trường nuôi cấy và xác định chủng nấm men thích hợp cho quá trình lên men dịch ép quả điều - Mục đích: Đánh giá chất lượng và khả năng sinh trưởng của các chủng nấm men khảo sát. Đồng thời xác định môi trường nuôi cấy và chủng nấm men phù hợp để lên men rượu vang điều. - Bố trí thí nghiệm: Nấm men được nuôi cấy lắc trong môi trường Sabouraud và môi trường dịch điều ở nhiệt độ phòng (28oC), theo bảng 2.5. - Tiến hành thí nghiệm: 30 + Môi trường dịch ép quả điều sau khi tách loại tanin được điều chỉnh bằng đường để đưa về hàm lượng chất khô hòa tan là 14oBrix. Chuẩn bị 200 mL từng loại dịch môi trường để nhân giống nấm men, trong đó môi trường dịch điều được thanh trùng 75oC trong 15 phút và môi trường Sabouraud được tiệt trùng 15 phút ở nhiệt độ 121oC, làm nguội. Lượng nấm men ban đầu bổ sung ở mỗi bình là 4,2x106 cfu/mL. Chỉ tiêu theo dõi: Số lượng tế bào nấm men trong 1 mL canh trường được xác định bằng phương pháp đếm trên buồng đếm hồng cầu với thời gian 4 giờ/1 lần trong 40 giờ. + Sau khi chọn môi trường và thời điểm dừng để nhân giống nấm men, chuẩn bị 2 bình Schott chứa 200 mL dịch điều đưa về 22oBrix, tại pH dịch điều (pH=4,5). Sau đó cấy men giống ở 2 chủng nấm men vào trong dịch lên men với mật độ 1,04x107 cfu/mL [31], tiến hành lên men chính trong 10 ngày. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. - Chỉ tiêu theo dõi: + Thời gian số lượng tế bào nấm men trong hai môi trường nuôi cấy sinh trưởng và phát triển đạt mật độ cao nhất, chọn môi trường nuôi cấy thích hợp. + oBrix, hàm lượng axit tổng số, pH và độ cồn tạo thành nhằm chọn ra chủng nấm men phù hợp để lên men rượu vang điều. Bảng 2.5: Lựa chọn môi trường nhân giống nấm men. STT Chủng nấm men Môi trường Sabouraud Môi trường dịch điều 1 Saccharomyces cerevisiae K1 V1116 NT1 NT2 2 Saccharomyces uvarum 664 NT3 NT4 2.4.6. Xác định điều kiện tối ưu hóa trong quá trình lên men rượu vang điều - Mục đích: Khảo sát sự ảnh hưởng của ba yếu tố (bảng 2.6) trong quá trình lên men chính. Qua đó, ở bảng 2.7 chọn được các giá trị tối ưu: oBrix (hàm lượng chất khô), pH và tỉ lệ men ở dịch ép quả điều để hiệu suất tạo cồn của quá trình lên men là cao nhất. Ở đây, (+): giá trị cận trên, (-): giá trị cận dưới, (A): giá trị trục thấp, (a): giá trị trục cao, (0): giá trị tại tâm. Để xác định giá trị tối ưu cho quá trình lên men, kết quả phân tích khớp với phương trình đa thức 31 bậc 2 bao gồm phần tuyến tính bậc 1, bậc 2 và tương tác ba yếu tố bậc 1 bằng phương pháp hồi quy đa biến. Mô hình toán học sử dụng để xác định giá trị tối ưu cho các yếu tố có dạng như sau: Y = b1X1 + b2X2 +b3X3+ b4X1X2 + b5X1X3 + b6X2X3 + b7X1X2X3 + b8X1 2 + b9X2 2 + b10X3 2 Trong đó: b1, b2, b3, b4, b5, b6, b7, b8, b9, b10 là hệ số hồi quy. X1; X2; X3 là yếu tố thí nghiệm cần tối ưu. Y: chỉ số theo dõi sau quá trình lên men. Bảng 2.6: Giá trị thay đổi của các thông số trong quá trình lên men chính. Biến (yếu tố) Giá trị biến đổi X1 (pH) 4 4,5 5 X2 ( oBrix) 20 22 24 X3 (tỉ lệ men) 4 7 10 - Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm tối ưu hóa được thực hiện theo phần mềm JMP bằng phương pháp đáp ứng bề mặt theo mô hình CCD-Uniform Precision (Central Composite Design-CCD) được trình bày theo bảng 2.7 với 16 nghiệm thức bố trí ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. - Tiến hành thí nghiệm: + Chuẩn bị dịch lên men: Cho 200 mL dịch điều đã tách loại tanin vào 16 bình Schott đã được tiệt trùng 121oC. Điều chỉnh hàm lượng chất khô (oBrix) bằng đường tinh luyện và pH bằng dung dịch axit citric 10% và dung dịch Na2CO3 10% ở mỗi bình đạt các giá trị theo bảng 2.7. Sau đó, tất cả các bình được thanh trùng ở nhiệt độ 75oC trong vòng 15 phút. + Nhân giống và cấy men: Tiến hành nhân giống nấm men đã chọn, cấy men vào bình Schott ngay tại điểm dừng đã xác định. Trong đó, tỉ lệ men (v/v) bổ sung dựa vào tỷ lệ của các nghiệm thức với mật độ ở bình nhân giống là 4,16x1010 cfu/mL. + Lên men: Tiến hành lên men chính ở nhiệt độ phòng (28-32oC) trong điều kiện kỵ khí và kết thúc quá trình sau 7 ngày. - Chỉ tiêu theo dõi: Độ biến thiên các chỉ tiêu: oBrix, pH, axit và độ cồn tạo thành ở mỗi ngày trong 7 ngày lên men chính. 32 Bảng 2.7: Thiết kế thí nghiệm CCD để tối ưu hóa quá trình lên men chính ở dịch ép quả điều. 2.4.7. Xây dựng quy trình lên men rượu vang điều Sau khi thực hiện quá trình lên men dịch ép quả điều đã tách loại tanin theo điều kiện tối ưu hóa. Tiến hành xây dựng quy trình sản xuất rượu vang điều. Sản phẩm rượu vang điều tạo thành phù hợp theo tiêu chuẩn rượu vang của Việt Nam (TCVN 7045:2013). 2.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.5.1. Xác định hàm lượng tanin theo phương pháp Lowenthal Dùng pipet hút 10 mL dịch mẫu + 1 mL chất chỉ thị indigo-carmine cho vào bình tam giác 250 mL + 100mL nước cất 2 lần. Sau đó, chuẩn độ bằng dung dịch KMnO4 0,1 N cho đến khi dịch trong bình chuyển sang màu vàng ánh kim [32]. Hàm lượng tanin: Tanin (mg/100mL) = m VV 100*025,0*)1( − STT Pattern 0Brix (X1) pH (X2) Tỉ lệ men (%- X3) 1 −−− 20 4 5 2 −−+ 20 4 10 3 a00 20 4,5 7,5 4 −+− 20 5 5 5 −++ 20 5 10 6 0a0 22 4 7,5 7 00a 22 4,5 5 8 000 22 4,5 7,5 9 000 22 4,5 7,5 10 00A 22 4,5 10 11 0A0 22 5 7,5 12 +−− 24 4 5 13 +−+ 24 4 10 14 A00 24 4,5 7,5 15 ++− 24 5 5 16 +++ 24 5 10 33 Trong đó: V1: là lượng KMnO4 dùng để chuẩn độ V: là lượng KMnO4 dùng để chuẩn độ mẫu đối chứng m: là lượng mẫu được chuẩn độ (mL) 0,025 là lượng 1mL KMnO4 phản ứng với 1mL tanin [33]. 2.5.2. Xác định hàm lượng polyphenol Hàm lượng polyphenol ở dịch ép quả điều được xác định theo phương pháp Folin-Ciocalteu [34], dựa trên nguyên tắc: Thuốc thử Folin-Ciocalteu chứa các chất oxy hóa là axit phospho-vonframic có khả năng khử các nhóm hydroxy phenol dễ bị oxy hóa trong dịch quả sinh ra màu xanh của vonfarm và molypden có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 765 nm. Tiến hành pha loãng mẫu với nồng độ phù hợp, hút 1mL mẫu cho vào ống nghiệm + 3mL Folin-Ciocalteu 10%, để trong 4 phút rồi bổ sung thêm 4mL Na2CO3 10%, lắc đều. Để dung dịch khoảng 60 phút trong bóng tối, sau đó đem đo độ hấp phụ quang học ABS ở bước sóng 765 nm. Đường chuẩn axit gallic được xây dựng từ dung dịch chuẩn (0, 10, 20, 30, 40, 50 mg GAE/100mL). Hàm lượng polyphenol được xác định dựa trên đường chuẩn axit gallic tương đương mg GAE/100mL dịch ép (bảng 2.8). Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Bảng 2.8: Kết quả xây dựng đường chuẩn axit gallic. ABS Hàm lượng (mg/100mL) 0 0 0,171 10 0,362 20 0,561 30 0,748 40 0,945 50 y = 52,569x + 0,5815 R² = 0,9996 0 10 20 30 40 50 60 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 H àm l ư ợ n g a x it g al li c (m g G A E /1 0 0 m L ) ABS 34 2.5.3. Khả năng bắt gốc tự do theo DPPH (2,2-Diphenyl-1- picrylhydrazyl) Phương pháp DPPH được xây dựng dựa vào khả năng hoạt động của các chất chống oxy hóa, các electron lẻ có trong gốc tự do DPPH cho sự hấp thu mạnh nhất ở bước sóng 517 nm, bắt màu tím. Khi các electron này kết hợp với hydro của chất kháng oxy hóa để hình thành dạng DPPH-H, hợp chất sẽ chuyển từ màu tím sang màu vàng. Khả năng bắt gốc tự do của một chất càng cao thì sự hấp thu quang phổ được đo ở bước sóng 517 nm có giá trị càng thấp và ngược lại [35]. Tiến hành pha loãng dịch mẫu theo các nồng độ thích hợp, lấy 0,2 mL dịch mẫu + 3 mL cồn + 2 mL DPPH 0,3 mM, lắc đều. Sau đó ủ trong bóng tối 60 phút, tiến hành đo độ hấp phụ quang học ABS ở bước sóng 517 nm. Khi đó khả năng khử gốc tự do DPPH được xác định theo công thức: (%) = 100 x (AMT - Asp)/AMT Trong đó: AMT: Độ hấp thu quang học của mẫu trắng không chứa dịch ép Asp: Độ hấp thu quang học của mẫu có chứa dịch ép. Giá trị IC50 là nồng độ của dịch ép quả điều khử được 50% gốc tự do DPPH ở điều kiện xác định. Nồng độ 9,6 µg/mL là giá trị IC50 của vitamin C được khảo sát tại điều kiện phòng thí nghiệm. Giá trị IC50 là nồng độ mà tại đó vitamin C khử 50% gốc tự do DPPH. Giá trị IC50 càng thấp thì hoạt tính khử gốc tự do DPPH càng cao. 2.4.4. Xác định năng lực khử [36] Quy trình khảo sát năng lực khử được dựa trên nguyên tắc: Dịch mẫu thử sẽ khử ion Fe3+ trong phân tử kali ferricyanid (K3[Fe(CN)6]) thành ion Fe2+ trong phân tử (K4[Fe(CN)6]). Khi bổ sung FeCl3, Fe3+ phản ứng với ion ferrocyanid tạo thành phức hợp ferris ferrocyanid (K4[Fe(CN)6]3) có màu xanh dương. Sau đó đo độ hấp thụ tại bước sóng 700 nm, nồng độ dịch mẫu cho giá trị tại độ hấp phụ quang là 0,5 được gọi là EC50, nếu giá trị mật độ quang OD phản ánh khả năng khử của mẫu càng cao chứng tỏ năng lực khử của mẫu càng cao. Quy trình khảo sát năng lực khử được tiến hành như sau: 1 mL mẫu thử ở các nồng độ khảo sát + 2,5 mL dung dịch đệm phosphate 0,2M (pH = 6,6), ủ 35 ở nhiệt độ 50oC trong thời gian 20 phút. Sau đó, mỗi ống nghiệm được bổ sung thêm 2,5 mL dung dịch axit tricloacetic 10%, lắc đều. Lấy 2,5 mL dung dịch trên, thêm 2,5 mL nước cất và 0,5 mL dung dịch FeCl3 0,1% lắc đều rồi đo độ hấp thụ quang phổ. 2.5.5. Xác định hiệu suất tách loại tanin Thực hiện chuẩn độ theo phương pháp Lowenthal để xác định hàm lượng tanin ban đầu và còn lại khi dùng enzym tanase kết hợp với gelatin ở dịch ép quả điều. Hiệu suất tách loại tanin: H(%) = (1 - T1 T2 ) x 100 Trong đó: T1: làm hàm lượng tanin còn lại (mg/100ml). T2: làm hàm lượng tanin ban đầu (250 mg/100ml). 2.5.6. Xác định hàm lượng chất khô hòa tan (oBrix) [37] Dụng cụ: Khúc xạ kế Atago thang đo 0-32oBrix. Cách sử dụng: Dùng nước cất rửa sạch và làm khô bề mặt kính bằng giấy mềm, sau đó điều chỉnh nồng độ khô về 0, để đo hàm lượng chất khô của dung dịch thì thay nước cất bằng dung dịch cần đo. Quan sát và đọc nồng độ chất khô qua ống kính bằng vạch phân chia vùng tối và vùng sáng trên thang đo. Sau khi đọc xong, rửa kính bằng nước cất và lau khô bằng giấy mềm. 2.5.7. Xác định pH Dụng cụ: Để xác định pH sử dụng máy đo pH Mettler Toledo. Cách sử dụng: Rửa sạch điện cực bằng nước cất, lau khô bằng giấy thấm. Nhúng điện cực vào nước cất để ổn định pH=7, để đo pH mẫu thì thay nước cất bằng dung dịch cần đo và đọc giá trị trên màn hình. Sau khi đọc xong rửa sạch điện cực bằng nước cất, lau khô bảo quản điện cực bằng dung dịch KCl 3M. 2.5.8. Xác định hàm lượng axit tổng số [37] Nguyên tắc: Độ chua toàn phần được xác định dựa vào phản ứng với kiềm nên dễ dàng chuẩn độ bằng NaOH 0,1 N hay KOH 0,1 N chuẩn với chất chỉ thị màu là phenolphthalein. Cách thực hiện: Hút 10 mL mẫu cho vào bình tam giác 250 mL, thêm 20 mL nước cất và 3 giọt dung dịch phenolphtalein 0,1% lắc đều rồi chuẩn độ bằng 36 NaOH 0,1N đến khi dung dịch có màu hồng nhạt bền trong 30 giây. Công thức tính hàm lượng axit tổng: X = (V * K * 1000) /V1 Trong đó: V - thể tích NaOH 0,1N (mL) V1 - thể tích mẫu hút để chuẩn độ (mL) K - hệ số axit sulfuric bằng 0,0049 2.5.9. Xác định tế bào nấm men bằng buồng đếm hồng cầu [38] Cách tiến hành: Đặt lá kính lên khu vực buồng đếm, chuẩn bị ống nghiệm đựng dung dịch huyền phù nấm men đã được pha loãng với tỷ lệ thích hợp. Lấy một ít dịch cho vào khe ở mép giữa buồng đếm, tránh tạo bọt khí, chỉnh kính hiển vi với vật kính 40, tìm mạng ô đếm ở khu vực buồng đếm. Chỉnh thị trường sao cho một thị trường chứa trọn một ô lớn (4×4 = 16 ô). Sau đó tiến hành đếm số tế bào trên 5 ô vuông lớn đại diện (5 vuông theo đường chéo hoặc 4 ô vuông ở bốn góc và 1 ô trung tâm). Và tính toán theo công thức: N = [(a/b) * 400/0,1] * 103 *10n Trong đó: N: Số lượng tế bào trong 1 mL dung dịch huyền phù nấm men a: Số tế bào trong 5 ô vuông lớn b: Số ô vuông nhỏ trong 5 ô vuông lớn (16×5 = 80 ô vuông nhỏ) 400: Tổng diện tích số ô vuông nhỏ trong ô trung tâm 0,1: Thể tích dịch tế bào (tính bằng mm3) chứa trên ô trung tâm 103: Số chuyển mm3 thành mL (1000mm3 = 1mL) 10n: độ pha loãng mẫu 2.5.10. Xác định độ cồn trong rượu [37] Nguyên tắc: Xác định tỷ số giữa khối lượng chất lỏng và nước cất ở cùng thể tích. Cách thực hiện: Cho vào bình cầu 100 mL hỗn hợp dung dịch gồm: 50 mL nước cất và 50 mL dịch điều lên men. Tiến hành chưng cất thu cồn đến khi đủ 30 mL dung dịch thì ngừng chưng cất. Rửa sạch bình tỉ trọng (dung tích 25 mL) bằng nước cất, tráng kỹ bằng cồn 96o, sau đó sấy khô, hút ẩm. Làm lạnh đến 20oC, lau khô và cân khối lượng bình (m1). Cho nước cất vào bình tỉ trọng, làm lạnh đến 20oC, cân khối lượng (m2). Tiếp theo tráng bình bằng cồn 96o và 37 sấy nhẹ cho khô, hoặc tráng lại bằng cồn cất được. Cho cồn cất được vào bình, thao tác như khi cân nước cất để xác định khối lượng bình và cồn (m3). Tỷ trọng của rượu so với nước cất ở nhiệt độ 20oC được xác định: 𝑑20 = 𝑚3 − 𝑚1 𝑚2 − 𝑚1 Trong đó: m1: Khối lượng bình tỷ trọng (g) m2: Khối lượng bình và nước ở 20oC (g) m3: Khối lượng bình và cồn ở 20oC (g) Kết quả thu được tra bảng xác định độ cồn theo tỷ trọng của etanol ở 20oC. 2.5.11. Đánh giá cảm quan [39] + Cho điểm chất lượng tổng hợp của sản phẩm: được sử dụng để đánh giá tổng quát mức chất lượng của sản phẩm so với tiêu chuẩn hoặc so với một số sản phẩm cùng loại trên tất cả các chỉ tiêu cảm quan: độ trong, màu sắc, mùi vị (bảng 2.9). Tình trạng chất lượng của mỗi chỉ tiêu được đánh giá bằng điểm, giá trị điểm tăng theo mức chất lượng. Bảng 2.9: Điểm trung bình và hệ số trọng lượng. Chỉ tiêu Hệ số trọng lượng Độ trong và màu sắc Mùi Vị 0,8 1,2 2 Do mỗi chỉ tiêu có vai trò khác nhau ảnh hưởng đến chất lượng chung của sản phẩm nên các giá trị của mỗi chỉ tiêu được nhận thêm một giá trị tương ứng gọi là hệ số trọng lượng. Các chỉ tiêu có vai trò lớn hơn thì hệ số trọng lượng cao hơn, thường được xác định theo kinh nghiệm, phương pháp điều tra kết hợp với phương pháp chuyên gia trên cơ sở thống kê. Khi đánh giá chất lượng cảm thì điểm cảm quan được dùng hệ điểm 5 (từ 0-5), xây dựng trên một thang thống nhất 6 bậc. Trong đó điểm 0 tương ứng với chất lượng sản phẩm bị hỏng, còn điểm từ 1-5 ứng với mức khuyết điểm giảm dần. Ở điểm 5 sản phẩm coi như không có sai lỗi trong tính chất đang xét. 38 Tổng hệ số trọng lượng của tất cả các chỉ tiêu được đánh giá cho một sản phẩm bằng 4. Chất lượng sản phẩm là điểm trung bình của từng chỉ tiêu nhân với hệ số trọng lượng của nó. Hội đồng đánh giá gồm có 10 người, mỗi người được phát một phiếu đánh giá theo 6 mức đánh giá chất lượng sản phẩm (bảng 2.10). Bảng 2.10: Bảng điểm chất lượng của sản phẩm. Bậc Điểm Tính chất 1 0 – 3,9 Hỏng 2 4,0 – 7,1 Rất kém 3 7,2 – 11,1 Kém 4 11,2 – 15,1 Trung bình 5 15,1 – 18,5 Khá 6 18,5 – 20 Tốt + Phép thử cho điểm thị hiếu: Phép thử gồm hai mẫu được chuẩn bị để so sánh mức độ ưa thích của người thử đối với hai sản phẩm (không so sánh về cường độ của một tính chất cảm quan nào đó). Thang điểm thị hiếu từ 1 đến 9 tương ứng: cực kỳ không thích đến cực kỳ thích. Giá trị điểm trung bình của từng sản phẩm có thể so sánh nhờ chuẩn t. Chuẩn bị mẫu và mời người thử, mỗi người nhận được hai mẫu rượu vang điều có ký hiệu trên ly kèm theo “Phiếu trả lời”. 2.5.12. Xử lý số liệu Các số liệu trong đề tài được xử lý trên phần mềm Microsoft Excel 2010 và phần mềm JMP 10. Số liệu được biểu diễn bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (mean ± SD). Kết luận về sự ảnh hưởng của các yếu tố thí nghiệm dựa trên phân tích ANOVA, sự sai khác có ý nghĩa giữa các công thức thí nghiệm được xác định so với giá trị sai khác nhỏ nhất (5% LSD). 39 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. MỘT SỐ CHỈ TIÊU DINH DƯỠNG TRONG DỊCH ÉP QUẢ ĐIỀU BAN ĐẦU Kết quả phân tích ở bảng 3.1 chỉ ra dịch ép quả điều chứa nhiều thành phần dinh dưỡng như: hàm lượng vitamin C đạt 211 mg/100mL cao gần gấp 2 lần quả chanh (Citru