Luận văn Nghiên cứu vai trò của Allicin tách từ tỏi Việt Nam trong quá trình điều hoà đáp ứng viêm thông qua thụ thể Dectin – 1

g khuẩn do viêm là rất cao. Cho đến nay, viêm nặng và choáng do viêm vẫn là một trong các nguyên nhân chính của những ca tử vong ở các bệnh nhân cần chăm sóc đặc biệt. Các trường hợp này vẫn tiếp tục gia tăng rộng khắp cả trên thế giới và Việt Nam. Trong nhiều trường hợp , quá trình bị viêm kéo dài mà không được điều trị kịp thời còn dẫn đến những bệnh mạn tính nguy hiểm như tim mạch, tiểu đường, thấp khớp Việt Nam cũng là nước có nguồn tài nguyên sinh vật rất phong phú, đặc biệt về thực vật. Theo thống kê của Viện Dược liệu thì tính đến năm 2000, nước ta có gần 4000 loài thực vật, 22 loài tảo và trên 33 loài động vật được dùng làm thuốc ở các mức độ khác nhau, đó là chưa kể đến nhiều loài tảo biển và động vật biển cũng có thể được dùng làm thuốc [2]. Các số liệu trên đây cho thấy tiềm năng to lớn của nguồn dược liệu Việt Nam có thể sử dụng trong các nghiên cứu sàng lọc để tìm ra những chất có hoạt tính dược học quý hiếm, trong đó có các chất chống viêm mới có hiệu quả cao mà không gây ra các phản ứng phụ. Tuy vậy, có thể nói các nghiên cứu khoa học một cách có hệ thống và chi tiết về điều tra, khai thác, đánh giá tác dụng và sử dụng các chất hoạt tính sinh học từ nguồn tài nguyên sinh vật trong nước để phát triển thành các sản phẩm thuốc mới, phục vụ cho bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng còn rất hạn chế. Trong lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng các chất kháng viêm, có thể nói rằng chúng ta chưa có các nghiên cứu sâu cũng như chưa có các hệ thống và mô hình nghiên cứu hiện đại về quá trình viêm và tác dụng của chất chống viêm. Đây chính là cơ sở để phát triển các sản phẩm thuốc có thể thương mại được trên thị trường Việt Nam và quốc tế. Các nghiên cứu về viêm được thực hiện chủ yếu ở Viện Dược liệu Trung ương, các trường Đại học Dược, trường Đại học Y Hà Nội và Học viện Quân y 103. Các nghiên cứu ở những cơ sở này mới chỉ dừng ở mức tạo được mô hình gây viêm thực nghiệm in vivo cổ điển như đã trình bày ở trên . Cụ thể là các thí nghiệm được thực hiện trên chuột thông qua sử dụng chất gây viêm carrageenan để tạo mô hình viêm cấp dưới hình thức gây phù bàn chân chuột và gây viêm màng bụng chuột sau khi tiêm chất gây viêm này. Việc gây viêm mãn tính sử dụng chất amiant để tạo u hạt trong cơ thể chuột. Việc đánh giá tác dụng kháng viêm được thực hiện bằng cách đo thể tích bàn chân, đo thể tích dịch viêm ổ bụng, đo trọng lượng khối u hạt tách ra, đếm số lượng bạch cầu so với mẫu đối chứng, từ đó đánh giá tác dụng kháng viêm của các chất nghiên cứu. Ngoài ra, việc đánh giá tác dụng kháng viêm cũng chủ yếu được thực hiện với các cao chiết thô của thực vật. Điển hình như các nghiên cứu của Đặng Diễm Hồng và cộng sự với các dịch chiết rong tảo biển Việt Nam [1]. Nhóm nghiên cứu đã phát hiện thấy dịch chiết methanol của hai loài tảo biển là Sargassum swartzii và Ulva reticulata thể hiện hoạt tính kháng viêm cao mà không gây độc với động vật thử nghiệm [1]. Hàng loạt các nghiên cứu khác trong thời gian gần đây cũng chỉ sử dụng các mô hình nghiên cứu này để đánh giá tác dụng kháng viêm của các dịch chiết thực vật nghiên cứu. Ví dụ như Hà Vân Oanh và cộng sự (2010) trên cao lỏng của rễ cây bạch đồng nữ (Clerodendrum chinense) [4], Đỗ Thị Oanh và cộng sự (2010) trên cao sói rừng (Sapium sebiferum) [3] hay Nguyễn Thị Bích Hằng (2009) trên cao lỏng lá vọng cách (Premna corymbosa) [5]... Như vậy có thể nói rằng, mô hình nghiên cứu viêm và đánh giá tác dụng kháng viêm ở Việt Nam hiện nay là đơn giản, cổ điển, tốn nhiều thời gian và thiếu tin cậy . Như vậy, chúng ta còn thiếu các nghiên cứu hiện đại với các mô hình gây viêm đạt chuẩn quốc tế hay nghiên cứu cơ chế kháng viêm thông qua đánh giá ảnh hưởng của chất nghiên cứu lên các thụ thể như TLR, GC, mức độ giải phóng các chất trung gian được tiết ra trong quá trình tiền viêm và viêm, các tín hiệu gây viêm đặc hiệu. Đặc biệt, cho đến nay chúng ta chưa có mô hình sàng lọc in vitro cho phép sàng lọc nhanh, chính xác và hiệu quả các chất kháng viêm mới từ các nguồn nguyên liệu khác nhau. 1.7. CÂY TỎI VÀ VAI TRÒ CỦA ALLICIN TRONG QUÁ TRÌNH KHÁNG VIÊM 1.7.1. Cây tỏi Cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, khuynh hướng quay về với thiên nhiên, tìm tòi và phát triển những phương thuốc truyền thống ngày càng được chú trọng. Thảo dược thiên nhiên ngày càng đóng vai trò quan trọng trong phòng, chữa bệnh và nâng cao sức khỏe của nhân dân. Với lãnh thổ trải dài từ Bắc đến Nam, thuộc vùng nhiệt đới gió mùa ẩm, nước ta có nguồn tài nguyên thực vật phong phú và đa dạng, trong đó cây cỏ làm thuốc chiếm một tỉ lệ khá cao. Nhiều loài cây cỏ Việt Nam là những nguồn hoạt chất quý cho y học dân tộc và y học hiện đại, là nguồn chất thơm có giá trị kinh tế cho các ngành thực phẩm, hương liệu, mỹ phẩm, dược phẩm Tỏi là một cây được trồng khắp nơi để làm gia vị- hàng ngàn năm nay- từ cổ Hy Lạp và La Mã, từ Châu Á đến Trung Đông, tỏi luôn đứng ở tuyến đầu điều trị chống vi khuẩn. Đến khi thuốc kháng sinh được khám phá, tỏi bắt đầu lùi lại tuyến sau. Đến nay, cùmg với sự xuất hiện của những siêu vi trùng kháng kháng sinh, tỏi lại đứng trong danh sách những thuốc chống lây nhiễm. Cái lợi nhất của dược thảo tự nhiên như tỏi là nó không tấn công vi khuẩn bừa bãi hay cản trở sự phòng vệ tự nhiên của cơ thể như thuốc kháng sinh, chúng là những probiotic kích thích các cơ chế phòng vệ tự nhiên của cơ thể mà không làm hại những vi khuẩn có ích [5]. Tỏi được sử dụng phổ biến trong đời sống hàng ngày của con người. Từ lâu đời con người đã biết sử dụng tỏi để chữa bệnh, nhưng hiểu biết những tác dụng huyền bí của tỏi thì ít người biết. Việt Nam ta có nhiều vùng trồng tỏi, nhưng nổi tiếng thơm ngon nhất là “Vương quốc tỏi- huyện đảo Lý Sơn”. Điều làm nên sự khác biệt của tỏi Lý Sơn là củ của nó không quá to, không quá cay lại có mùi thơm đặc biệt. Mùi thơm nồng ấy là do người dân Đảo đã dùng cát biển để “lót” khi gieo trồng. Và việc khai thác cát để trồng tỏi đã tạo điều kiện cho triều cường lấn át đất đai nơi đây. 1.7.1.1. Phân loại thực vật – Đặc điểm sinh thái 1.7.1.1.1. Phân loại thực vật Tên khoa học: Allium sativum L. Thuộc họ Hành tỏi Alliaceae. 1.7.1.1.2. Phát sinh tên gọi:[ 33] Các nhà thực vật học gọi cây tỏi là Allium Sativum [ 33], (URL4, 5, 6). Tiếng La tinh gọi tỏi là Olere – có nghĩa là “ngửi thấy”, tiếng Hy lạp là Hallestai là “nhảy vọt ra” để mô tả sự tăng trưởng nhanh chóng các tép tỏi trong một củ. Một nhà thơ La mã Plaupus (250 – 184 trước CN) dùng thuật ngữ Allium để gọi cây tỏi, nên người ta cho rằng đó là một từ phát sinh từ chữ Arya cổ áluh hoặc álukám qua alum mà ra, vì người xưa dùng từ đó với nghĩa là một gia vị. Một cách giải thích khác Allium là phát sinh từ alare hoặc halare có nghĩa là “thở”, “thở ra” đều liên quan đến mùi ngửi thấy. Ngoài ra từ Celtic all có nghĩa là “ấm áp”, “làm nóng, đốt nóng” cũng được coi là nguồn gốc phát sinh của tên gọi cây tỏi. 1.7.1.1.3. Khái quát chung về họ hành tỏi: [38] Tỏi, “gia vị của cuộc đời”, là loại độc nhất vô nhị trong vương quốc thảo mộc có nguồn gốc sâu xa, huyền bí gắn liền với những truyền thuyết xa xưa của nhiều dân tộc khác nhau trên thế giới. Tỏi cùng y học dân gian hay những tập quán dân tộc đã thật sự hòa nhập vào nhau. Cùng với thiên nhiên-tỏi cũng chịu ảnh hưởng sâu sắc của sự biến hóa trong quá trình chọn lọc tự nhiên nên có rất nhiều loài khác nhau [33]. Trên thế giới có hơn 600 loại tỏi khác nhau bởi độ lớn, màu sắc, hình dáng của củ, mùi vị, số lượng tép tỏi trong một củ, vị hăng cay và công dụng trong từng loại tỏi khác nhau [33]. Các nhà phân loại thực vật học cho rằng sơ khai chỉ có một loài Allium Sativum. Loài tỏi này có hai loài phụ: Ophioscorodon (hard-necked garlics) và Sativum (soft-necked garlics). Tỏi Ophioscorodon là loại tỏi chính gốc và Sativum là loại tỏi Ophioscorodon đã bị lai hóa bởi do điều kiện thổ nhưỡng gieo trồng khác nhau trong quá trình chọn lọc tự nhiên. Nghiên cứu mới nhất (2003) đã công bố rằng có 8 nhóm tỏi khác biệt đã được tiến hóa; 6 nhóm thuộc loại hard-necked garlics (tỏi cổ cứng) có tên gọi là Asiatic, Creole, Purple Stripe, Marbled Purple Stripe, Porcelain, Rocambole và 2 nhóm thuộc loài soft-necked garlics (tỏi cổ mềm) là Artichoke và Silverskin. Một nghiên cứu gần đây cho rằng có 17 loài tỏi khác nhau được biến hóa từ 8 nhóm trên. Thực tế trên khắp thế giới, có hàng trăm loài tỏi khác nhau đều được phát triển từ 17 loài cơ bản trên. Chúng có những đặc tính khác nhau bởi được trồng trong điều kiện thổ nhưỡng khác nhau như: Sự phì nhiêu của đất, lượng mưa, nhiệt độ, độ cao so với mực nước biển, thời điểm gieo trồng trong năm và chế độ nghiêm ngặt của nước tưới[33]. Tỏi - Cây thảo sống một năm. Thân thực hình trụ, phía dưới mang nhiều rễ phụ, phía trên có nhiều lá. Lá cứng, hình dài, thẳng dài 15-50cm, rộng 1- 2,5cm có rãnh khía, mép lá hơi ráp. Phần dưới của lá phía gốc có một chồi nhỏ sau này phát triển thành một tép tỏi; các tép này nằm chung trong một cái bao (do các bẹ lá trước tạo ra) thành một củ tỏi tức là thân hành (giò) của tỏi. Hoa mọc ở ngọn thân trên, một cán hoa dài 55cm hay hơn. Bao hoa màu trắng hay hồng bao bởi nhiều tán, rơi rụng thành mũi nhọn dài. Hoa mọc thành cụm trên đầu một trục hình trụ từ thân củ kéo dài ra. Cụm hoa là một tán giả hình cầu, màu trắng, đỏ hoặc xanh nhạt. Hình 5: Cây tỏi 1.7.2. Allicin và các sản phẩm chứa Allicin Đối với hàng nghìn năm trước tỏi đã được biết đến có nhiều tiềm năng y học đặc biệt. Trong lịch sử, tỏi đã được sử dụng để chữa bệnh thương hàn, bệnh dại. Thực sự, sau khi Cavallito phát hiện ra Allicin – một hoạt chất được hình thành từ Alliin thành phần quan trọng của tỏi năm 1944 đã có tới 1500 công bố khoa học và vô số các nghiên cứu khác xung quanh vấn đề dược học của tỏi (ULR1). Vì vậy, người xưa đã đặt cho tỏi những biệt hiệu: thần dược, thuốc bách bệnh. Trong những thập niên gần đây, cùng với sự phát triển của 2 loại bệnh tim mạch và ung thư, các nhà khoa học đặc biệt quan tâm đến tác dụng chống oxy hóa, chống đột biến tế bào, hạ độ mỡ trong máu và làm giảm nguy cơ máu đông của một số hoạt chất thiên nhiên. Trong đó, tỏi là một gia vị có hoạt chất quan trọng tổng hợp nên Allicin - chất có khả năng chống oxy hóa mạnh nhất, có thể ngăn chặn các quá trình trên (ULR2). Tỏi có 3 hoạt chất chính: alliin, liallyl sulfide và ajoene. Alliin là hoạt chất mạnh nhất và quan trọng nhất của tỏi. Khi tỏi được cắt mỏng hoặc đập dập và dưới sự xúc tác của men allinase, chất alliin có sẵn trong tỏi biến thành allicin. Do đó, càng cắt nhỏ hoặc càng đập nát, hoạt tính càng cao. Allicin dễ mất hoạt tính sau khi được hình thành và càng để lâu càng mất hoạt tính. Đặc biệt là sẽ bị phá hủy hoạt tính khi ở nhiệt độ cao. Allicin là một chất kháng sinh tự nhiên rất mạnh, mạnh hơn cả penicillin (ULR2). Bên cạnh đó, Allicin có một số dược tính có lợi mà giúp cho cơ thể có khả năng tăng cường đáp ứng lại một số bệnh [34]. Các nghiên cứu gần đây đã công bố Allicin : - Tăng cường hoạt tính của các tế bào trong quá trình thực bào. - Tăng cường hoạt tính của các tế bào giết tự nhiên - Ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh - Ức chế sự phát triển của những tế bào ung thư (ULR3) Alliin Allinase/H2O Allicin CH2=CH-CH2-SO-CH2-CH(NH2)-COOH CH2=CH-CH2-SO-S-CH2-CH=CH2 + pyruvic acid + NH4 Quá trình tạo Allicin trong tỏi Trong một số thực phẩm chức năng hiện này có chứa Allicin được biết đến như chế phẩm Alimax, Weissin, Garcin, Knoflox, Alli-C, AliTRU, Alli-Oregano, Aliforce, AliPro, Betacal, PreRRO, AlliMED. Các sản phẩm này được khuyến cáo sử dụng hỗ trợ làm giảm cholesterol trong máu, ngăn ngừa xơ vữa mạch, cao huyết áp. Đặc biệt là có khả năng ngăn ngừa ung thư trong trường hợp uống thường xuyên. Các sản phẩm này đã sự dụng phổ biến ở nhiều nước trên thế giới. Sản phẩm Alimax đã nhận được giải thưởng bạc của hội bảo vệ sức khỏe tự nhiên ở Canada với số chứng nhận sản phẩm : 80022062 (ULR1). 1.7.3. Sản xuất Allicin từ alliin có trong tỏi Allinase là enzym có trong tỏi giúp cho quá trình chuyển alliin thành Allicin. Nhưng lượng Alliin thường có ở trong tỏi khoảng 0,4 đến 0,9% thành phần phụ thuộc vào điều kiện trồng tỏi. Trên thực tế với phương pháp sử dụng lượng allinase có trong tỏi để sản xuất Allicin thì cần alliin chiếm khoảng từ 1%-15% [36]. Do vậy, để sản xuất Allicin từ Alliin của tỏi cần bổ sung thêm alliin từ tinh thể deoxyalliin. Sau đó, lượng alliin này sẽ được tiếp xúc với tỏi đã được nghiền để quá trình phản ứng giữa alliin và allinase xảy ra dễ dàng cho ra sản phẩm là Allicin. Với nồng độ alliin, nhiệt độ, pH và thời gian tối ưu để phản ứng xảy ra triệt để sẽ thu được lượng Acillin nhiều nhất. Để sản xuất Allicin từ Alliin của tỏi cho mục đích làm thực phẩm chức năng và một dạng thuốc dùng cho điều trị một số bệnh cũng như các ứng dụng khác trong dược học các nhóm nghiên cứu mạnh hiện nay ở Mỹ, cộng đồng Châu Âu đã có patent sử dụng alliin để sản xuất Allicin tự nhiên từ thực vật thuộc họ tỏi hành. Nguyên nhân chủ yếu là để đảm bảo Allicin sản xuất ra hoàn toàn không liên quan đến nguyên liệu chuyển gen và tổng hợp bằng con đường hóa học. Tóm lại, để sản xuất Allicin có khả năng kích thích miễn dịch từ tỏi, các tác giả thường dùng phối hợp alliin với allinase để sản xuất Allicin và một số dung môi hữu cơ không phân cực để tinh sạch Allicin trong điều kiện thích hợp về pH, nhiệt độ và thời gian. Trong nước có một số công trình nghiên cứu về tỏi theo hướng điều trị bệnh dựa vào các phương pháp điều trị dân gian và chưa sản xuất Allicin theo phương pháp sử dụng bổ sung thêm alliin vào tỏi để tổng hợp Allicin. Mới đây, Viện Các Hợp chất tự nhiên đã thực hiện đề tài cấp cơ sở do Trần Văn Sung và cộng sự thực hiện cũng đã nghiên cứu tách chiết tỏi dưới dạng tinh dầu. Trên cơ sở này, công ty thuốc Tuệ Linh cũng đã sản xuất ra chế phẩm bán trên thị trường với tên gọi là Oil Garlic. Tuy nhiên, với sản phẩm này, tỏi vẫn chỉ tách chiết dưới dạng tinh dầu, do vậy mà khi ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm vẫn gặp phải nhiều khó khăn và hoạt tính quan trọng của Allicin vẫn chưa được sử dụng hiệu quả nhất. Hơn nữa, Tỏi Lý Sơn của Việt Nam đã được công bố có rất nhiều hoạt tinh sinh học quý báu. Trong khi đó, dầu tỏi tạo ra vẫn chưa được đánh giá khả năng điều hòa đáp ứng viêm. Để góp phần giải quyết những tồn tại nêu trên, đề tài nghiên cứu này với mục tiêu làm sáng tỏ một trong các công dụng của tỏi, đặc biệt là đánh giá khả năng của Allicin như một dạng thuốc trong quá trình điều hòa đáp ứng viêm, cũng như định hướng ứng dụng Allicin như một liệu pháp hỗ trợ và phòng bệnh cho con người, cụ thể là bệnh nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng. Trong nghiên cứu này sẽ tập trung vào tổng hợp Allicin từ tỏi Lý Sơn. Đây là một trong những loại tỏi đã có thương hiệu từ lâu của Việt Nam và đã được biết đến ở nhiều nước trên thế giới. Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1. Động vật thí nghiệm Chuột Swiss được mua từ Viện vệ sinh dịch tễ trung ương. Hóa chất Tỏi lý sơn được mua ở Huyện đảo lý sơn, cấu tử đặc hiệu của Dectin-1: zymosan (sigma, Mỹ), ELISA kit IL-6, IL-10, TNF, IL12p40 (BD Bioscience, Mỹ). Kit đếm tế bào sống chết (CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, Mỹ). Laminarin (chất ức chế Dectin-1), Galactan (chất đối chứng dương, Sigma), các hóa chất mua của hãng Sigma. Thuốc chống viêm C- K (một loại thuốc sử dụng chống nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng, quà tặng của giáo sư Jo, Compound – K, một chất được chiết xuất từ nhân sâm Hàn Quốc). Thiết bị nghiên cứu Tủ ấm CO2, Tủ cấy vô trùng Naure, Máy đọc ELISA(bio-rad, Mỹ), Tủ lạnh: Kính hiển vi soi ngược (Olympus, Nhật), Máy khuấy từ nhiệt (Đức), kính hiển vi laze hội tụ (LSM 510) và các dụng cụ thí nghiệm thông thường khác như: đĩa nuôi cấy 24, 48, 96 giếng (Corning, Mỹ), kim uống, kim tiêm, dao, kéo. 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Tách chiết macrophage từ tủy xương của chuột Tế bào đại thực bào (BMDM) được tách ra từ xương đùi của chuột. Sau đó, BMDM được phân chia từ 5 đến 7 ngày trong môi trường DMEM đã được bổ sung cùng với 10% môi trường điều kiện nuôi tế bào L929 (được xem như yếu tố kích thích M-CSF (macrophage-specific colony stimulating factor)), 10% FBS, 1mM sodium pyruvate, 50U/ml penicillin, 50 μg/ml streptomycin, và 5 × 10−5 M chất 2-mercaptoethanol. 2.2.2. Đánh giá hoạt tính độc tố của Allicin tới khả năng sống của BMDM bằng kít CCK-8 Khả năng sống của tế bào được đánh giá bằng sử dụng Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo Laboratories, Kumammoto, Japan). BMDMs được ủ cùng với Allicin hoặc C-K trước 24 giờ. Sau quá trình này, 10µl của dung dịch CCK-8 được đưa vào macrophage đã được ủ cùng với Allicin hoặc C - K trong 1 giờ. Khả năng hấp thụ của các mẫu này sẽ được đo ở bước sóng 450nm bằng máy đọc ELISA. Giá trị hấp thụ ở 450 nm của mỗi mẫu này được tính như tỉ lệ phần trăm so với mẫu không được xử lý với Allicin hoặc C-K (xem như 100% tế bào sống). 2.2.3. Sản xuất Allicin từ tỏi a) Sản xuất tinh thể deoxyalliin - L-cysteine hydrochloride monohydrate được hòa tan vào nước cất và khuấy đều ở nhiệt độ 20-25ºC. - Bổ sung thêm sodium hydroxide đã được hòa tan trong nước cất từng giọt. - Bổ sung allyl chloride ở nhiệt độ 25 - 30oC. - Sau đó làm lạnh dung dịch ở 4oC, tiếp tục bổ sung thêm axit glacial acetic ở dạng giọt tới tạo ra dạng kết tủa màu trắng. Sau đó, tách phần kết tủa trắng bằng lọc và làm khô. - Phần kết tủa trắng được hòa tan trong nước cất ở nhiệt độ 45oC, sau đó làm lạnh methanol -20oC và làm khô. Lập lại 4 lần. - Sau đó, chất rắn này được rửa với diethyl ether và làm khô. b) Sản xuất alliin - deoxyalliin ở trên được bổ sung thêm nước và khuấy đều. - hydrogen peroxide bổ sung vào dung dịch ở dạng nhỏ giọt. - Bổ sung thêm methanol, khuấy đều. - hydrogen peroxide bổ sung từng giọt và khuấy ở nhiệt độ thích hợp. C) Sản xuất Allicin - Lấy 10 gram Alliin hòa tan trong 800ml nước cất. Sau đó bổ sung thêm 12 gram tỏi đã được nghiền nát. Bổ sung thêm nước cất đủ tới 1 lít. - Ủ hỗn hợp này ở 4ºC. - Sau 24 giờ lọc thu dịch (chính là Allicin thu được). - Dịch lỏng này tiếp tục được đông khô thu được Allicin dạng bột. - Chạy HPLC kiểm tra độ tinh sạch:(URL7). + 1mg bột sau khi đông khô được hoà tan vào 1ml methanol. + Sau đó dung dịch này được phá bọt bằng bể siêu âm. + Đưa đệm methanol lên cột C18 đảo pha. + Đưa dịch lên cột tốc độ 1,2ml/phút. + Sử dụng pha động gồm acetonitrile: đệm phosphate (0,01N, PH=2,5) là 85:15. + Đo bước sóng UV 375nm. 2.2.4. Đánh giá khả năng sản xuất cytokine bằng ELISA Kit 2.2.4.1. Giới thiệu phương pháp ELISA (Enzyme linked Immuno Sorbent Assay) hay EIA(Enzyme Immuno Assay) là một kỹ thuật sinh hoá để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm. Hiện nay, ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm sinh học. 2.2.4.2. Nguyên tắc Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên – Kháng thể và gồm các bước căn bản như sau: - Kháng nguyên – antigen(KN) chưa biết được gắn trên một bề mặt. - Kháng thể - antibody(KT) biết trước được rửa qua bề mặt đó. Kháng thể này được gắn kết với enzyme. - Thêm vào một cơ chất, enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu có thể xác định được. 2.2.4.3. Qui trình thí nghiệm a. Áo đĩa bằng 100l Capture antibody pha trong dung dịch đệm Coating buffer theo tỉ lệ 1/250. Ủ qua đêm ở 40 C. b. Rửa lại 3 lần bằng dung dịch rửa với 200l/giếng. c. Thêm 200l/giếng dung dịch Assay. Ủ 1h ở nhiệt độ phòng. d. Rửa lại 5 lần bằng dung dịch rửa. e. Bổ sung mẫu chuẩn có chứa kháng nguyên ở thể tích 100l/giếng. Ủ 2h ở nhiệt độ phòng. f. Rửa lại 5 lần bằng dung dịch rửa. g. Thêm 100l/giếng dung dịch Worrking detector gồm: Dung dịch Assay + Detection antibody + Sav - HRP. Ủ trong 1h ở nhiệt độ phòng. h. Tiến hành rửa đĩa 7 lần bằng dung dịch rửa. i. Tiếp tục bổ sung 100l dung dịch develop vào mỗi giếng. Ủ đĩa 30 phút ở trong bóng tối. j. Cuối cùng, thêm vào mỗi giếng 50l dung dịch stop để dừng phản ứng. Đọc bằng máy đọc ELISA Biorad, sử dụng bước sóng 540nm. 2.2.4.4. Pha dung dịch chuẩn Sử dụng dung dịch chuẩn có nồng độ 1000pg/ml và dung dịch Assay. Sau đó tiến hành pha về các dung dịch có nồng độ thấp hơn gồm:500pg/ml; 250pg/ml;125pg/ml; 62,5pg/ml; 31,3pg/ml; 15,6pg/ml. Dung dịch Assay được coi là có nồng độ 0pg/ml. Sau khi đã thu được các dung dịch có nồng độ chuẩn như trên, tiến hành dựng đường chuẩn. Đường chuẩn là đường có dạng hàm log, cho biết mối quan hệ giữa lượng OD đo được và nồng độ thực tế của các cytokine. Máy đọc ELISA sẽ cho kết quả là lượng OD trong dung dịch mẫu sau quá trình bắt cặp đặc hiệu KN _ KT. Kết quả này có được là do một chất hoá học đặc biệt được bổ sung trong kit, cho bước sóng nhận biết đặc hiệu là 540nm. Sau khi thu được kết quả OD của các mẫu cần đo, số liệu được so sánh với đường chuẩn. Dựng số liệu OD qua đường tuyến tính sẽ cho kết quả nồng độ thực tế của cytokine. Các sai số trong phép đo được biểu thị thông qua hai lần xử lý số liệu: - Sai số trong quá trình dựng đường chuẩn biểu thị bằng sự sai lệch so với đường tuyến tính. - Sai số trong phép đo. Đối với phân tích khả năng sản xuất cytokine tiền viêm và kháng viêm bằng Zymosan trong BMDM bằng kit ELISA, ở đây là TNF , IL- 6, IL -10. BMDMs được tách từ chuột được ủ cùng với Zymosan sau một số thời gian nhất định. Thu dịch các mẫu tế bào. Sau đó các dịch này sẽ được đo nồng độ TNF , IL- 6, IL -10 bằng kit ELISA. Các thủ tục tiến hành đo cytokine tiết ra từ các tế bào nuôi cấy sẽ được đánh giá thông qua khả năng hấp thụ ở bước sóng 540nm bằng máy đọc ELISA. Đối với đánh giá hoạt động kích thích viêm của Dectin- 1 bằng Zymosan, BMDMs được tiền xử lý cùng với Allicin hoặc C-K trong 1h. Sau đó, các tế bào sẽ được xử lý cùng với zymosan sau 18h. Dịch các mẫu tế bào được thu lại và ly tâm sau đó tiến hành đo nồng độ các cytokine giống như trên. Đối với đánh giá ức chế hoạt động của Dectin 1, BMDMs được tiền xử lý cùng với lamilarin (Một chất có khả năng ức chế hoạt động của Dectin -1) hoặc với Galactan (đối chứng với lamilarin) trong 1h. Sau đó, các mẫu tế bào này tiếp tục được ủ cùng với Allicin. Sau 1h, các mẫu tế bào này sẽ được xử lý cùng với Zymosan. Dịch tế bào các mẫu thu được đem ly tâm và đánh giá nồng độ cytokine giống như trên. 2.2.5. Phân tích hiệu quả ức chế con đường tín hiệu MAPK (p38) của Allicin khi gây viêm bằng zymosan sử dụng kỹ thuật western blot BMDM được tiền xử lý cùng với Allicin hoặc C-K. Sau đó các tế bào sẽ được xử lý cùng với zymosan. Dịch chiết tế bào thu được sau khi phá tế bào được chạy điện di trên gel 12% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE) và chuyển lên màng PVDF. Màng này được ủ cùng với kháng thể thứ nhất phosphor-p38, p38 tổng số. Sau đó, màng sẽ được ủ cùng với kháng thể thứ hai là kháng kháng thể IgG có mang đuôi horseradish peroxidase. Liên kết của các kháng thể này sẽ được phát hiện bằng các chất làm tăng phát quang hóa. 2.2.6. Phân tích ức chế của Allicin trong quá trình tạo phản ứng oxy hóa BMDMs được sử lý cùng với Laminarin hoặc galactan trong 60 phút, và tích lũy với zymosan sau khi đã được ủ với không hoặc cùng với Allicin hoặc C-K trong 60 phút. Sau đó, các tế bào được ủ với DHE trong 15 phút ở 37 0C trong 5% CO2. Những tế bào này sẽ được kiểm tra bằng laser-scanning confocal microscopy (LSM 510) để xác định mật độ khác nhau của ROS trong các mẫu đã được xử lý. 2.2.7. Xây dựng mô hình in vivo gây bệnh nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng trên chuột sử dụng zymosan 2.2.7.1. Gây nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng ở chuột bằng tiêm zymosan: Chuột có độ tuổi từ 8-10 tuần (khoảng 18-22 gram) sẽ được gây nhiễm trùng nặng và choáng khuẩn bằng cách tiêm dưới da bụng với zymosan 2mg/kg. Khả năng sống của chuột được đánh giá sau 5 tiếng đối với 40 giờ đầu và sau đó là 10 giờ trong 5 ngày [50]. 2.2.7.2. Đánh giá hiệu quả chống viêm của Allicin sử dụng chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng bằng phân tích khả năng sống xót của chuột: Chuột có độ tuổi từ 8-10 tuần (khoảng 18-22 gram) sẽ được uống với các nồng độ khác nhau của Allicin. Sau đó, sẽ tiêm zymosan đối với cả chuột đã được tiêm và không tiêm với Allicin. Khả năng sống của chuột được đánh giá sau 5 tiếng đối với 40 giờ đầu và sau đó là 10 giờ trong 5 ngày. 2.2.7.3. Đánh giá hiệu quả ức chế sản xuất cytokine tiền viêm (TNF-α, IL-6) trong huyết thanh của chuột: Chuột được tiêm với các nồng độ khác nhau của Allicin (10mg/kg, 20mg/kg, 30mg/kg). Sau đó, cả chuột được tiêm và không tiêm với Allicin sẽ được tiêm cùng với zymosan. Tiếp sau, lấy huyết thanh và xác định TNF-α, IL-6 bằng kít ELISA. 2.2.7.4. So sánh hiệu quả kháng viêm của chất nghiên cứu và chất đối chứng C-K (Một hợp chất chiết xuất từ sâm Hàn quốc [50]) trong điều trị chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng: Chuột có độ tuổi từ 8-10 tuần (khoảng 18-22 gram) được chia thành các nhóm khác nhau và được thực hiện gây nhiễm trùng nặng và choáng khuẩn. Chuột sẽ được uống với các