Luận văn Nghiên cứu xây dựng phương pháp phổ hồng ngoại gần và trung bình kết hơp với thuật toán hồi quy đa biến để xác định đồng thời một số hoạt chất có trong thuốc kháng sinh thuộc họ β – lactam

u phổ sử dụng máy quang phổ Nicolet Magna 550 FTIR với độ phân giải 4 cm -1, 32 lần quét. Mô hình tốt nhất chỉ ra có r2 = 0,9936, RMSEC = 0,441 và RMSEV = 0,790. Tác giả Michaela Dračková1 [31] cũng sử đã sử dụng phương pháp phổ hồng ngoại gần biến đổi Fourie ( FT-NIR) kết hợp với phương pháp bình phương tối từng phần PLS để xác định hàm lượng dư Penicillin G và Cloxacillin trong sữa tươi. Phổ được đo trong vùng 4000 – 10.000 cm-1, 100 lần quét. Mô hình chuẩn được phát triển, đánh giá dựa trên hệ số tương quan (R) và sai số chuẩn (SEC). Giá trị thu được đối với Penicillin: R= 0,951 và SEC = 0,004 và đối với Cloxacillin: R = 0,871, SEC = 0,007. Các mô hình chuẩn được sau đó được đánh giá chéo. Tuy nhiên phương pháp phổ này không phải là một phương pháp thích hợp để xác định chính xác các chất này trong sữa tươi vì sự thay đổi thành phần sữa có thể ảnh hưởng đến giới hạn phát hiện chất ở nồng độ thấp. Tác giả YanYun Li [37]sử dụng phương pháp hồng ngoại xây dựng mô hình định lượng xác định natri cefazolin ở các dạng tinh thể khác nhau. Các natri cefazolin có thể được tạo ra từ hai dạng tinh thể α và β. Các sản phẩm vô định hình được sản xuất từ quy trình sản xuất khác nhau đã tạo ra các loại thuốc đa hình thường có tính chất vật lí, hóa học khác nhau.Phương pháp phổ hồng ngoại gần kết hợp với phương pháp Chemometric đa biến được xem là công cụ hữu hiệu cho việc xác định các tinh thể trong việc lựa chọn các dãy quang phổ tối ưu tương ứng với dạng tinh thể đặc trưng với thành phần đặc trưng. Các kết quả cho thấy các bước sóng nằm trong khoảng 9102 – 8597 cm-1 được dùng để xác định đặc tính và dãy sóng 6001– 5496 cm-1 đươc dùng để định lượng natri cefzolin. Như vậy thực tế phân tích cho thấy, các phương pháp truyền thống như HPLC, phương pháp quang học hay phương pháp phổ hồng ngoại thường chỉ được dùng để xác định các hoạt chất ở dạng riêng rẽ, không thể dùng xác định đồng thời đồng thời các hoạt chất có cấu trúc phân tử gần giống nhau trong cùng nhóm có trong cùng mẫu thuốc. Do đó Chemometrics là công cụ hữu hiệu để xác định đồng thời các hoạt chất trong cùng mẫu mà không cần phải tách loại. CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM Đối tượng nghiên cứu Chất phân tích. Penicillin V (phenoxymethyl penicillin) Công thức phân tử: C6H18N2O5S; Tên quốc tế, tên khoa học: axit (2S, 5R, 6 R) 3,3 dimethyl – 7- oxo – 6 ( 2 phenoxyacetamido] 4-thia – 1- azabicyclo [3,2,0] heptan – 2 carboxylic. Penicilin V là chất bột kết tinh trắng, khó tan trong nước, dễ tan trong etanol 96%, không tan trong dầu và paraffin lỏng [4], được sản xuất bằng nuôi cấy chủng Penicillium notatum hoặc các chủng cùng họ trong môi trường có chứa tiền chất thích hợp hay bằng các phương pháp khác. Tổng hàm lượng của phenoxylmethylpenicillin và 4- hydroxymethylpenicillin phải từ 95% đến 100,5 %, tính theo chế phẩm khan. Cephalexin. Công thức phân tử: C16H17N3O4S.H2O; Tên quốc tế, tên khoa học: axit 7 (α amino αphenylacetamido) 3 methylcephem – 4- carboxylic monohyrat. Cephalexin là chất bột kết tinh trắng hơi có mùi lưu huỳnh, tan ít trong nước, tan trong các dung dịch kiềm loãng, không tan trong etanol [4,6], được điều chế bằng con đường tổng hợp hóa học. Mẫu phân tích Mẫu phân tích là các thuốc kháng sinh nhóm kháng sinhβ-lactam.Thành phần chính của thuốc là hoạt chất và tá dược. Tá dược là các chất không hoạt tính được lựa chọn để xây dựng công thức bào chế cùng với các thành phần hoạt chất khác của thuốc, nhằm mục đích xây dựng công thức bào chế thuốc. Tá dược cũng có ích cho các quá trình sản xuất, pha chế thuốc như làm tăng độ hòa tan của thuốc, làm tăng tính chất trơn chảy của hạt thuốc (dập viên, đóng nang), tá dược còn đóng vai trò quan trọng trong độ ổn định của thuốc (dược chất, dạng bào chế) giúp thuốc đạt được tuổi thọ như mong muốn. Các thuốc kháng sinh nhóm penicillin có tá dược chính là magie stearate, tinh bột sắn, talc, gelatin; Các thuốc kháng sinh nhóm cephalosporin có thành phần tá dược chính là tinh bột,lactoza, magie stearate, talc, tinh bột, natri glycolat. Một số mẫu thuốc phân tích: Mẫu 1: Hoạt chất Penicillin V: Hinh 1.1: Thuốc kháng sinh penicillin Tên thuốc: PEN-VEE-K; VEETIDS Dạng dùng: Viên nén 125mg, 250mg, 500mg Dung dịch uống: 125mg/5ml, 250mg/5ml. Thành phần hoạt chất: Phenoxymethylpenicilin Kali Tá dược thường dung: Amidon, bột talc, magnesistearat, tinh bột. Mẫu 2: Hoạt chất Cephalexin: Hình 1.2: thuốc kháng sinh cephalexin Tên thuốc: Cephalexin Dạng dùng : Nang và viên nén 250 mg, 500 mg; viên nén 1 g. Nhũ dịch 125 mg, 250 mg/5 ml (sau khi pha thêm nước cho chế phẩm). Siro 250 mg, 500 mg/5 ml (sau khi pha thêm nước cho chế phẩm). Thuốc giọt dùng cho trẻ em 125 mg/1,25 ml (sau khi pha thêm nước cho chế phẩm). Thành phần: Cephalexin monohydrate Tá dược: Tinh bột mì,lactoza,Magie stearate. 2.2. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 2.2.1. Hóa chất Tên chất chuẩn Chất chuẩn Penicillin V Kali C6H18N2O5S có hàm lượng nguyên trạng 98,6%.Viện kiểm nghiệm trung ương (chuẩn phòng thí nghiệm), số kiểm soát: 0104011. Chất chuẩn Cephalexin monohydrat C16H17N3O4S có hàm lượng nguyên trạng 94,33%, Viện kiểm nghiệm trung ương (chuẩn phòng thí nghiệm), số kiểm soát : 0108041. KBr dùng cho hồng ngoại (Merck) Tinh bột sắn (Nhà máy sản xuất tinh bột mì Quảng Ngãi), đạt tiêu chuẩn đã kiểm tra theo DĐVN 4 Magie stearat : Mã sản phẩm: dp004; quy cách: 20kg/bao. Nước sản xuất: PETER GREVEN – MALAI, hàm lượng: 6.8 - 8.3%. Bột Talc (Công ty cổ phần hóa dược Việt Nam), đạt tiêu chuẩn đã kiểm tra theo DĐVN 4. Hóa chất tinh khiết phân tích: Axit Acetic, NaOH, Acetonitril, triethylamin, Metanol (Merck). 2.2.2. Dụng cụ và trang thiết bị đo Cân phân tích Sartorious độ chính xác ± 0,0001g. Máy quang phổ hồng ngoại Agilent Technologies Cary 600 Series FTIR spectrometer, dải bước sóng đo trong vùng 7500-2800 cm-1. Bộ dụng cụ ép viên: Agilent Technologies standard sampling kit (part no: Pike- 162- 1000). Cối chày mã não: Được dùng để chuẩn bị viên KBr hoặc cho phương pháp khuếch tán và phản xạ. Cối sứ có kích thước D106xH74 mm. Thư viện phổ chuẩn: ST- Japan spectral libraries (part no: K8159-1000) Phần mềm Matlab 12: Chương trình hồi qui đa biến tuyến tính PLS, CLS, ILS và PCR để phân tích đồng thời các chất trong cùng một hỗn hợp. 2.3. Nội dung nghiên cứu Để xây dựng qui trình xác định đồng thời các hoạt chất Penicillin và Cephalexin bằng phương pháp phổ hồng ngoại kết hợp với phương pháp thống kê đa biến chúng tôi tập chung nghiên cứu vấn đề sau: Khảo sát các điều kiện tối ưu để đo phổ hồng ngoại gần và trung bình của các mẫu thuốc chuẩn của các chất trong nhóm β-lactam. Khảo sát mô hình hồi qui đa biến xác định đồng thời các hoạt chất có trong nhóm β-lactam và tá dược. So sánh phương pháp nghiên cứu với phương pháp chuẩn trong dược điển Việt Nam V. Ứng dụng phân tích một số mẫu thuốc kháng sinh đang lưu hành trên thị trường hiện nay. 2.4. Phương pháp định lượng bằng phổ hồng ngoại gần 2.4.1. Nguyên tắc phương pháp phân tích Cơ sở của phương pháp là dựa trên sự hấp thụ có chọn lọc các bức xạ hồng ngoại của Penicillin trong vùng 3950 – 2800 cm-1và Cephalexin trong vùng 3950 –2800 cm-1. Mẫu đo được chuẩn bị bằng cách trộn từng hoạt chất Penicillin hoặc Cephalexin với 3 tá dược khác nhau theo tỉ lệ phù hợp, sau đó nghiền và trộn đều để đồng nhất các chất trong một mẫu, tiến hành đo các mẫu ở điều kiện đã khảo sát thu được các tín hiệu đo. Các dữ liệu tín hiệu đo độ hấp thụ quang của các mẫu chuẩn thu được chuyển vào phần mềm Matlab tính toán theo thuật toán hồi qui cấu tử chính (PCR) để xác định đồng thời các cấu tử trong hỗn hợp. 2.4.2. Nội dung phương pháp Để xây dựng qui trình xác định đồng thời các hoạt chất Penicillin và Cephalexin bằng phương pháp phổ hồng ngoại kết hợp với phương pháp thống kê đa biến chúng tôi tập chung nghiên cứu vấn đề sau: Khảo sát các điều kiện tối ưu để đo phổ hồng ngoại gần và trung bình của các mẫu thuốc chuẩn trong nhóm β-lactam Khảo sát mô hình hồi qui đa biến xác định đồng thời các hoạt chất có trong nhóm β-lactam và tá dược So sánh phương pháp nghiên cứu với phương pháp chuẩn trong dược điển Việt Nam. Ứng dụng phân tích một số mẫu thuốc kháng sinh đang lưu hành trên thị trường hiện nay 2.4.3. Quy trình phân tích Chuẩn bị các mẫu chuẩn, mẫu kiểm tra chứa đồng thời hai hoạt chất gồm Penicillin với hai tá dược gồm tinh bột và talc; cephalexin cùng với hai tá dược là tinh bột sắn và Magie stearate có hàm lượng thay đổi sao cho tín hiệu độ hấp thụ quang của các chất thay đổi trong vùng tuyến tính. Nghiền và trộn từng mẫu trong vòng 15 phút để thu được hỗn hợp đồng nhất. Lấy 3 mg hỗn hợp chất vừa đồng nhất trên, trộn với 97 mg KBr rồi tiến hành nghiền mịn, đồng nhất mẫu trong cối mã não trong 12 phút. Lấy khoảng 15 mg bột vừa nghiền được cho vào bộ ép viên để thu được viên mẫu và đo phổ hồng ngoại trong vùng số sóng nghiên cứu từ 4000-2800 cm- 1, ghi lại phổ hấp thụ quang của từng mẫu, xuất số liệu thu được dưới dạng ASCII và chuyển toàn bộ dữ liệu vào phần mềm Matlab để tính toán. Đường chuẩn đa biến và các bộ dữ liệu dự đoán được xây dựng trên ma trận độ hấp thụ quang của các mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra đã chuẩn bị ở phần trên. Nhập số liệu ma trận hàm lượng các mẫu chuẩn, ma trận hàm lượng các mẫu kiểm tra và ma trận tín hiệu đo độ hấp thụ quang tương ứng vào phần mềm Matlab, chạy chương trình tính toán ma trận hệ số hồi qui theo phương pháp PCR trên phần mềm matlab, từ đó xác định được hàm lượng mỗi hoạt chất trong từng mẫu. Độ đúng của phép đo được xác định qua sai số tương đối của phương pháp, từ đó lựa chọn ra phương pháp tối ưu nhất để tiến hành định lượng các mẫu thuốc thực tế. Tiến hành định lượng các mẫu thuốc thực tế bằng cách trộn một lượng bột mẫu với tá dược để pha loãng hàm lượng hoạt chất có hàm lượng nằm trong ma trận chuẩn đã xây dựng, đo tín hiệu đo độ hấp thụ quang của các mẫu này, lưu phổ và chuyển các ma trận hàm lượng mẫu đo và ma trận tín hiệu đo vào phần mềm Matlab để tính toán theo mô hình hồi qui cấu tử chính PCR. Từ đó tính toán được hàm lượng các hoạt chất trong các mẫu thuốc viên theo công thức dưới đây: Trong đó: X: Khối lượng của hoạt chất tìm được từ mô hình hồi qui đa biến tuyến tính (mg) mt: khối lượng của mẫu thử (mg) mtb: khối lượng trung bình của 1 viên của thuốc (mg) 2.5. Phương pháp phân tích đối chứng Penicillin và Cephalexin Phương pháp phân tích đối chứng mẫu Penicillin và Cephalexin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao được tiến hành phân tích tại phòng kiểm nghiệm – Công ty CP Dược phẩm Trung ương 1 –PHARBACO; Địa chỉ 160 Tôn Đức Thắng-Q.Đống Đa –TP. Hà nội. Định lượng Cephalexin trong viên nang Hàm lượng Cephalexin trong viên nang được xác định theo phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao như hướng dẫn trong dược điển Việt Nam IV. Điều kiện sắc ký: Cột thép không gỉ (25 cm x 4,6mm) được nhồi pha tĩnh C18 (5µm). Detector quang phổ tử ngoại tại bước sóng 254 nm, tốc độ dòng: 1,5 ml/min, thể tích tiêm:20µl. Pha động: Methanol – acetonitril – dung dịch kali dihydrophosphat 0,136% - nước (2:5:10:83). Dung dịch chuẩn: Hòa tan 50,4 mg cephalexin chuẩn vào nước và pha loãng thành 100ml với dung môi nước. Dung dịch thử: Hòa tan 50,6 mg Cephalexin, hòa tan chế phẩm vào trong nước và pha loãng thành 100ml với cùng dung môi nước. Định lượng penicillin V kali trong viên nang Hàm lượng penicillin V kali trong viên nang được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao như trong Dược điển Việt Nam IV. Điều kiện chạy sắc ký: Cột thép không gỉ (30 cm x 4mm), được nhồi pha tĩnh C18 (3µm đến 10µm), detector quang phổ hấp thụ tử ngoại đặt ở bước sóng 254nm, tốc độ dòng 1,0ml/min, thể tích tiêm 10 µl. Pha động: Nước- acetonitril- acid acetic (650:350:5,75). Dung dịch chuẩn: Cân lượng bột khoảng 49,8 mg penicillin chuẩn hòa tan trong pha động vừa đủ 100ml. Dung dịch thử: Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình viên rồi nghiền thành bột mịn. Cân chính xác lượng bột viên khoảng 51,1 mg phenoxylmethuypenicillin hòa tan trong pha động vừa đủ 100ml, lắc kỹ 5 phút, lọc.Tính hàm lượng phenoxylmethuypenicillin (C6H18N2O5S) và Cephalexin monohydrat (C16H17N3O4S) trong viên dựa vào diện tích píc trên sắc ký đồ của dung dịch thử và dung dịch kiểm tra. Công thức hàm lượng của Penicillin và Cephalexin (mg/ viên) HL (mg/viên) = StSc×13HLc ×mcmt× mtb Trong đó: St, Sc: Lần lượt là diện tích pic của dung dịch chuẩn, thử mt, mc: Khối lượng cân lần lượt của mẫu chuẩn và mẫu thử (mg) HLc: Hàm lượng nguyên trạng của mẫu của chuẩn (%) mv: Khối lượng trung bình của một viên thuốc (mg). 2.6. Chương trình máy tínhcủa phương pháp phổ hồng ngoại gần kết hợp với thuật toán hồi qui cấu tử chính ( PCR) * Các bước tính toán và câu lệnh PCR trong phần mềm Matlab như sau[12,6]: - Khởi động phần mềm MATLAB - Nhập các ma trận dữ liệu trong cửa sổ WORKSPACE + Nhập ma trận nồng độ X0 (mxk) của m dung dịch chuẩn chứa k cấu tử (m hàng, k cột) + Nhập ma trận tín hiệu phân tích Y0(mxn) (n là số tín hiệu đo) + Nhập tín hiệu phân tích Y của mẫu cần định phân - Lưu các dữ liệu vừa nhập vào thành 1 file trong Matlab: PCR.mat [6] %Phuong phap PCR: load PCR.mat; %Binh phuong tap so lieu chua bien phu thuoc Y0 D = Y0'*Y0; % Su dung mot trong 3 ham tinh PC de xac dinh cac PC theo cau lenh % su dung ham SVD [V S] = svd(D); % Tinh ma tran phan tram phuong sai cua cac PC d = diag(S)/sum(diag(S))*100; % Tu gia tri phan tram phuong sai cua cac PC, can cu vao yeu cau cu the cua % bai toan de quyet dinh so PC lam co so cho khong gian moi cua tap so lieu % (n): f = V(:,1:n); % Chuyen doi tap so lieu ban dau va tinh ma tran he so hoi qui: Yj = Y0*f; F = inv(Yj'*Yj)*Yj'*X0; Fj=f*F % Nhap ma tran bien phu thuoc cua k mau can dinh phan va tinh nong do mau % theo cong thuc:X=Y*Fj % NEU MUON KIEM TRA DO CHINH XAC CUA PHUONG PHAP % Nhap ma tran do hap thu quang cua mau kiem tra:Yktra %Tinh nong do mau kiem tra theo PCR: Xktra=Yktra*Fj; %Tinh sai so giua nong do chuan voi nong do xac dinh duoc tu PLS: Saiso=(X0ktra-Xktra)*100./X0ktra ; % TINH HÀM LƯỢNG CUA CHAT TRONG MAU BAT KI. %Nhap ma tran do hap thu quang cua mau thuc: Y X=Y*Fj; % TINH LOD, LOQ CỦA PHUONG PHAP % Nhap ma tran do lech chuan cua tin hieu do lap lai mau trang: Z % Tinh toan cac gia tri LOD, LOQ theo PCR: LOD=(3*Z)*Fj LOQ=(10*Z)*Fj - Lưu lại M-file vừa thực hiện được: PCR.m - Gọi hàm M-file vừa viết được trong cửa sổ COMMAND WINDOW : >> PCR - Kích chuột vào giá trị Saiso, X trong WORKSPACE thu được các dữ liệu mong muốn. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THỰC NGHIỆM 3.1. Khảo sát các điều kiện đo phổ hồng ngoại xác định đồng thời Penicillin và Cephalexin trong cùng hỗn hợp Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến tín hiệu đo phổ hồng ngoại đối với mẫu rắn như: mức độ phân tán đồng đều của chất trong mẫu đo, độ dày mẫu, kích thước hạt cũng như hàm lượng chất trong mẫu. Để đạt được kết quả có độ chính xác và độ lặp lại cao khi ứng dụng phổ hồng ngoại trong phân tích định lượng. Trong nghiên cứu này chúng tôi đã tiến hành khảo sát tìm điều kiện chuẩn bị mẫu đo phổ hồng ngoại tối ưu qua việc khảo sát các yếu tố: lựa chọn vùng có số sóng thích hợp, hàm lượng các chất trong mẫu đo, lực ép viên, thành phần các chất trong mẫu đo. 3.1.1. Khảo sát phổ hấp thụ các hoạt chất penicillin và cephalexin Như đã trình bày ở phần 1.1, trong cấu trúc phân tử các hoạt chất penicillin và cephalexin có chứa các nhóm chức như: -CONH-, NH2, NH, C-H, O-H... có khả năng hấp thụ bức xạ hồng ngoại trong vùng gần và trung bình nên chúng tôi đã tiến hành khảo sát phổ hồng ngoại của 2 hoạt chất này trong vùng từ 4000- 400cm- 1 bằng thiết bị đo phổ hồng ngoại FTIR Affinity-1S tại bộ môn Hóa Vô cơ và trong vùng 7500-2800 cm-1 bằng thiết bị đo phổ hồng ngoại Agilent Technologies Cary 600 Series FTIR spectrometer tại bộ môn Hóa phân tích. Phổ hấp thụ hồng ngoại của 2 hoạt chất trong vùng hồng ngoại trung bình được biểu diễn ở hình 3.3, 3.4. Phổ hấp thụ hồng ngoại của 2 hoạt chất trong vùng hồng ngoại gần được trình bày trong các hình 3.5 và 3.6. Hình 3.3: Phổ hồng ngoại trung của Cephalexin trong vùng 4000-400 cm-.1 Hình 3.4: Phổ hồng ngoại trung của Penicillin trong vùng 4000-400 cm-.1 Wavenumber, cm-1 Wavenumber, cm-1 Hình 3.5: Phổ hấp thụ hồng ngoại gần của Cephalexin trong vùng 7500-2800 cm-1. Hình 3.6.Phổ hấp thụ hồng ngoại gần của Penicillin trong vùng 7500-2800 cm-1. Từ hình 3.5 và 3.6 có thể thấy, các đỉnh pic trên phổ hồng ngoại của hai hoạt chất Cephalexin và Penicillin đều có các pic dao động đặc trưng trong cùng vùng số sóng 4000 – 2800 cm-1, trong đó đối với Penicillin có dao động ν C-H ứng số sóng 2855 – 2965 (cm-1), ν C-H (thơm) tại số sóng 3039 – 3062 cm-1 và đối Cephalexin có dao động ν C-H tại số sóng 2883, ν N-H tại số sóng 3274 cm-1, ν C-H(vòng thơm) tại số sóng 3049 cm-1 nên việc phân tích định lượng đồng thời hai hoạt chất này trong dược phẩm nếu chỉ dùng phương pháp phổ hồng ngoại là rất khó khăn. Do đó chúng tôi sử dụng phương pháp kỹ thuật đa biến kết hợp với phổ hồng ngoại gần để có thể xác định từng cấu tử trong cùng một hỗn hợp. Đồng thời, có thể thấy hai hoạt chất này đều có các đỉnh pic hấp thụ mạnh trong vùng 4000-2800 cm-1. Do đó có thể tiến hành nghiên cứu trên vùng phổ đặc trưng này. 3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của các tá dược Tá dược là chất phụ gia thường được thêm vào ổn định dạng thuốc, mỗi loại tá dược đều có đặc tính và vai trò khác nhau, là yếu tố không thể thiếu trong các công thức thuốc và trong mỗi công thức thuốc thì thành phần tá dược cũng thay đổi cùng với các nhà sản xuất. Do đó chúng tôi tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng tá dược đến các hoạt chất penicillin và cephalexin. Đã tiến hành nghiên cứu một số loại tá dược thường được dùng trong nhóm thuốc kháng sinh β- Lactam như: Tinh bột, magie stearat, talc. 1. Tinh bột sắn 2. Penicillin 3. Cephalexin 2 3 1 Wavenumber, cm-1 Tiến hành trộn mỗi loại tá dược trên với KBr theo tỷ lệ khối lượng 3/97, sau đó trộn đều mẫu và đo mẫu trong vùng phổ hồng ngoại gần từ 7500 -2800 cm-1 thì sẽ thu được hình dạng các phổ tá dược. Phổ chồng của tá dược với phổ của penicillin và cephalexin được đưa ra trên hình 3.7, 3.8 và 3.9. Hình 3.7: phổ hồng ngoại của tinh bột sắn đối với penicillin và cephalexin. Wavenumber, cm-1 1 2 3 1. Magie Stearat 2. Penicillin 3. Cephalexin Hình 3.8: Phổ hồng ngoại của Magie stearat, penicilin, cephalexin. Wavenumber, cm-1 1 2 3 1. Talc 2. Penicillin 3. Cephalexin Hình 3.9. Phổ hồng ngoại của Talc, penicillin, cephalexin. Từ hình 3.7, 3.8 và 3.9 có thể thấy trong vùng số sóng khảo sát 4000-2800cm-1, các tá dược (bột talc, magie stearate và tinh bột) cũng có tín hiệu đỉnh pic tương đối mạnhvà cũng là vùng hấp thụ phổ của các hoạt chất Penicillin và Cephalexin cần khảo sát. Như vậy, khi phân tích định lượng đồng thời các hoạt chất trong hỗn hợp có chứa các tá dược sẽ xảy ra sự xen phủ giữa các đỉnh pic trong vùng khảo sát. Do đó không thể dùng phương pháp định lượng thông thường dựa trên mối quan hệ giữa độ hấp thụ quang và nồng độ để định lượng các hoạt chất mà phải sử dụng phương pháp phổ hồng ngoại kết hợp với chemometrics trên cơ sở sử dụng ma trận hệ số tương quan từ phổ toàn phần để định lượng được đồng thời hai hoạt chất này trong hỗn hợp với các tá dược. 3.1.3. Khảo sát tỷ lệ khối lượng mẫu/KBr Tiến hành cân mẫu bộ chứa hoạt chất Cephalexin 500mg một lượng có hàm lượng thay đổi trong khoảng 1-8 mg và bột KBr có hàm lượng thay đổi 92- 99 mg, sao cho hàm lượng tổng gồm mẫu bột và KBr là 100 mg. Các mẫu được trộn đều và nghiền mịn trên cối mã não. Mẫu sau khi đã được trộn thì đồng nhất, lấy khoảng 15mg cho vào bộ dụng cụ ép viên, tiến hành đo phổ hồng ngoại trong vùng 4000-2800 cm-1, kết quả được trình bày trong bảng 3.4. Bảng 3.4.Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ khối lượng mẫu/KBr đến độ hấp thụ quang tại các số sóng đặc trưng. Tỷ lệ mẫu/KBr (w/w) ν (cm-1) 1/99 2/98 3/97 4/96 6/94 8/92 2979 0,8168 0,9825 1,1319 1,8756 2,1177 2,2265 2989 0,8169 0,9837 1,1369 1,8806 2,1238 2,5321 2998 0,8177 0,901 1,1558 1,9003 2,1544 2,4533 3008 0,8188 0,9231 1,1754 1,9323 2,1851 2,7659 3018 0,8193 0,9339 1,1853 1,9525 2,1982 2,4487 Từ kết quả trên bảng 3.4 cho thấy, độ hấp thụ A có sự thay đổi giữa các lần đo. Khi tăng tỷ lệ khối lượng mẫu/KBr thì độ hấp thụ quang cũng tăng dần. Nếu độ hấp thụ quang A lớn thì dẫn đến sai số phép đo lớn còn nếu lượng mẫu quá nhỏ thì lượng cân không chính xác. Do đó để lựa chọn tỷ lệ phù hợp cho phương pháp phân tích, chúng tôi chọn tỷ lệ khối lượng mẫu/KBr = 3/97 để tiến hành khảo sát mẫu. Hình ảnh phổ của mỗi lần đo được trình bày phần Phụ lục 1. 3.1.4. Khảo sát độ lặp lại của quá trình ép viên Theo nghiên cứu ở mục 3.1.3 mẫu được trộn với KBr theo tỷ lệ tối ưu 3:97. Do đó, với tỷ lệ này đã tiến hành khảo sát độ lặp lại của quá trình ép viên đến phép đo. Tiến hành cân lặp lại 5 lần mỗi mẫu đo, các mẫu đo là hỗn hợp gồm mẫu bột chứa hoạt chất Cephalexin và KBr được cân theo tỷ lệ khối lượng 3: 97 trộn mẫu thật đồng đều trên cối mã não, sau đó lấy khoảng 15mg hỗn hợp mẫu đã được trộn đều cho vào bộ ép viên, đo mẫu trên vùng 4000 – 2800 cm-1. Các giá trị độ lệch chuẩn được tính trong phần mềm Minitab 16, kết quả thuđược trình bày trong bảng 3.5. Từ kết quả bảng 3.5 có thể nhận thấy độ hấp thụ quang hay diện tích píc thay đổi sau mỗi lần ép viên với cùng lượng mẫu ban đầu, do đó không thể dùng phương pháp định lượng thông thường dựa trên mối quan hệ tuyến tính giữa độ hấp thụ quang và nồng độ để định lượng chất phân tích. Như đã biết, phương pháp đo hồng ngoại chỉ là một phương pháp bán định lượng nên để xác định được chính xác hàm lượng các hoạt chất trong mẫu chúng ta cần phải kết hợp phương pháp này với các công cụ chemometrics. Do ưu điểm của chemometrics là trích xuất thông tin về chất theo mối quan hệ giữa hàm lượng các chất với nhau chứ không phải theo giá trị tuyệt đối của độ hấp thụ, nên hoàn toàn có thể sử dụng để định lượng các hoạt chất phân tích. Bảng 3.5. Khảo sát độ lặp lại quá trình ép mẫu theo độ hấp thụ và theo diện tích píc. ν (cm-1) Diện tích píc 2856 2425 3062 3370 3449 Giá trị TB(Stb) 0,527 1,945 0,362 14,281 0,445 % RSD 2,95 5,43 7,00 5,03 9,10 ν (cm-1) Độ hấp thụ 2979 2998 3001 3018 3027 Giá trị TB(Atb) 0,8945 0,8701 0,8257 0,8076 0,8001 %RSD 6,08 6,14 7,32 6,89 6,49 Kết luận: Từ khảo sát các điều kiện tối ưu cho phép đo đã lựa chọn được: Vùng phổ đo mẫu: 4000 -2800 cm-1 Tỷ lệ khối lượng mẫu/KBr = 3/97 Tá dược thường dùng tạo mẫu: Tinh bột, magie stearat, talc 3.2. Xây dựng mô hình hồi qui đa biến tuyến tính phân tích hoạt chất Penicillin 3.2.1. Mô hình đường chuẩn đa biến xác định hoạt chất Penicillin khi có chứa tá dược Tiến hành mô hình hồi quy đa biến để xác định hỗn hợp gồm Peniciilin và các tá dược được thực hiện dựa trên ma trận chuẩn (23x2) và ma trận kiểm tra (12x2), các mẫu chuẩn có hàm lượng khối lượng khác nhau dao động trong khoảng 15-40 mg (bảng 3.6). Chuẩn bị 23 mẫu có chứa hoạt chất penicillin cùng với 2 loại tá dược tinh bột và talc, trộn đều và đồng nhất các mẫu đo trên cối mã não sau đó lấy khoảng 3mg mỗi mẫu đã đồng nhất trên trộn với 97mg KBr, lấy khoảng 15mg lượng bột vừa nghiền cho vào bộ dụng cụ ép viên. Đo độ hấp thụ quang từng mẫu chuẩn sau khi trừ tín hiệu nền trong vùng phổ 4000 – 2800 cm-1. Bảng 3.6.Ma trận chuẩn hàm lượng của penicillin và tá dược trong hỗn hợp Mẫu Penicillin(g) Tá dược Tinh bột(g) Tacl(g) Ʃ tá dược 1 0,0154 0,0423 0,0423 0,0846 2 0,0175 0,0413 0,0413 0,0826 3 0,0185 0,0410 0,0410 0,0820 4 0,0205 0,0040 0,0400 0,0440 5 0,0224 0,0390 0,0390 0,0780 6 0,0237 0,0382 0,0382 0,0764 7 0,0275 0,0372 0,0372 0,0744 8 0,0268 0,0370 0,0370 0,074 9 0,0285 0,0356 0,0356 0,0712 10 0,0301 0,0350 0,0350 0,0700 11 0,0317 0,0342 0,0342 0,0684 12 0,0326 0,0334 0,0334 0,0668 13 0,0335 0,0333 0,0333 0,0666 14 0,0345 0,0328 0,0328 0,0656 15 0,036 0,0320 0,0320 0,0640 16 0,0339 0,0330 0,0330 0,0660 17 0,0374 0,0313 0,0313 0,0626 18 0,0354 0,0323 0,0323 0,0646 19 0,0379 0,0311 0,0311 0,0622 20 0,0393 0,0304 0,0304 0,0608 21 0,0405 0,0300 0,0300 0,0600 22 0,0419 0,0291 0,0291 0,0582 23 0,0422 0,0290 0,0290 0,0580 Sau khi đo độ hấp thụ quang của các mẫu chuẩn, các kết quả đo được trình bày ở dạng ma trận tín hiệu đo (23x51), trong đó độ hấp thụ quang A được đo tại 51 số sóng (Phụ lục 2-(mục Penicillin)).Sau đó các dữ liệu ma trận hàm lượng và ma trận tín hiệu đo được chuyển vào phần mềm Matlab tính theo phương pháp hồi quy đa biến PCR để tìm số PC phù hợp và các ma trận trị riêng, vectơ riêng của mô hình (phụ lục số 2). Trong số các phương pháp hồi qui đa biến tuyến tính như bình phương tối thiểu cổ điển (CLS), bình phương tối thiểu nghịch đảo (ILS), bình phương tối thiểu riêng phần (PLS), thì công trình nghiên cứu [6] trên cùng phương pháp phân tích phổ hồng ngoại gần cho thấy cả ba phương pháp này đều cho kết quả sai số lớn hơn nhiều so với phương pháp PCR. N