Luận văn Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu ứng dụng các chủng vi sinh vật chịu mặn bản địa có khả năng cố định đạm để sản xuất phân vi sinh cải tạo đất trồng rau trên quần đảo Trường Sa

ừ những năm 90 của thế kỷ XX trong khuôn khổ của đề tài khoa học cấp Nhà nước KC.08.01. [28] Có nhiều cách để sử dụng phân bón vi sinh cố định đạm. Cách thứ nhất là tẩm phân vào hạt hoặc rễ trước khi gieo trồng. Sau khi tẩm hạt giống cần được gieo trồng và vùi vào đất ngay. Cách thứ hai là bón trực tiếp vào đất. Quá trình sản xuất phân vi sinh theo hai giai đoạn chủ yếu sau: + Giai đoạn 1: Tìm nguyên liệu sản xuất chất mang. Chất mang được dùng là các hợp chất vô cơ (bột photphorit, bột apatit, bột xương, bột vỏ sò,..) hay các chất hữu cơ (than bùn, bã nấm, phế thải nông nghiệp, rác thải,..). Chất mang được ủ yếm khí hoặc hiếu khí nhằm tiêu diệt một phần VSV tạp và 17 trứng sâu bọ, bay hơi các hợp chất dễ bay hơi và phân giải phần nhỏ các chất hữu cơ khó tan. + Giai đoạn 2: Cấy vào chất mang trên các chủng vi sinh vật cố định đạm thuần khiết trong điều kiện nhất định để đạt được hiệu suất cao. Để cho phân vi sinh được sử dụng rộng rãi, người ta thường chọn các chủng vi sinh có khả năng thích nghi rộng hoặc dùng nhiều chủng trong cùng một loại phân.[29] 18 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 2.1.1. Vật liệu Mẫu đất thu được từ các đảo trên quần đảo Trường Sa: 42 mẫu đất trên 11 đảo Bảng 2.1: Kí hiệu và vị trí lấy mẫu đất trên quần đảo Trường Sa Tên đảo Vị tí lấy mẫu Kí hiệu Đá Lát Đất nền cổ ĐL1 Đất trồng rau ĐL2 Đất gốc cây cổ thụ ĐL3 Đá Nam Đất trồng rau ĐN1 Đất nền cổ ĐN2 Trường Sa lớn Đất vườn rau TSL1 Đất gốc cột điện TSL2 Đất nền cổ TSL3 Nam Yết Gốc Cột địện NY1 Đất vườn rau NY 2 Đất nền cổ NY3 Đất gần nhà bếp NY4 Sinh Tồn Đất vườn trồng rau ST1 Đất cát ST2 Đất nền ST3 An Bang Gốc cây AB1 Vườn rau AB2 Ven bờ AB3 Gần nhà bếp AB4 19 Sơn Ca Gốc cây K1 Vườn rau K2 Ven bờ K3 Đất gần nhà bếp K4 Phan Vinh A Gốc cây PVA1 Vườn rau PVA2 Ven bờ PVA3 Gần nhà bếp PVA4 Gần nhà vệ sinh PVA5 Sinh Tồn Đông Gốc cây STĐ1 Vườn rau STĐ2 Ven bờ STĐ3 Gần nhà bếp STĐ4 Gần nhà vệ sinh STĐ5 Song Tử Tây Gốc cây STT1 Vườn rau STT2 Ven bờ STT3 Gần nhà bếp STT4 Gần nhà vệ sinh STT5 Đá Thị Vườn rau ĐT1 2.1.2. Hóa chất và môi trường - Môi trường Burk’s không đạm [30]: saccharose 20 g/l; KH2PO4 0.41 g/l; K2HPO4.3H2O 0.68 g/l; MgSO4.7H2O 0.1 g/l; Na2SO4 0.05 g/l; CaCl2 0.2g/l; FeSO4.7H2O 0.005 g/l; Na2MoO4.2H2O: 0.0025 g/l. - Môi trường nutrient agar (NA), Luria Bertani (LB) được mua từ hãng Himedia (Ấn Độ). 20 - Môi trường NBRIP: Glucose 10 g/l; Ca3(PO4)2 5 g/l; MgCl2 5 g/l; MgSO4.7 H2O 0.25 g/l; KCl 0.2 g/l; (NH4)2SO4, 0.1 g/l. - Môi trường King B medium: peptone 2 g/l; K2HPO4.3H2O 1.15 g/l; MgSO4.7 H2O 1.5 g/l; glycerol 10 ml/l. - Môi trường nutrient broth: Peptone 5g/l, Cao thịt 3g/l. - Hóa chất K2HPO4.3H2O, KH2PO4, NaCl, MgSO4.7H2O, FeSO4.7H2O, Na2MoO4.2H2O, indole acetic acid, NaOH, glycerol, huyết thanh bò, H2SO4 do hãng merck sản xuất. - Hóa chất saccharose và glucose do Việt Nam sản xuất. - Hóa chất Na2SO4, CaCl2, Ca3(PO4)2, MgCl2, KCl, (NH4)2SO4, phenol, Na2CO3 do Trung Quốc sản xuất. 2.1.3 Dụng cụ và thiết bị - Dụng cụ: bình định mức (100 mL, 250 ml), bình định lượng (100 ml, 500 ml), bình tam giác, bông gòn, cốc đong (50 ml, 200 ml, 1 l), đĩa petri, giá đựng ống nghiệm, ống nghiệm, ống falcon (15 ml, 50 ml), ống eppendorf, đầu côn (10 µl, 100 µl, 1.000 µl), và que cấy. - Thiết bị: nồi khử trùng, cân phân tích, kính hiển vi, máy lắc vi sinh, máy ly tâm lạnh, máy đo quang phổ, máy đo nồng độ oxy hòa tan Hanna, micropipette, thiết bị ổn nhiệt, hệ thống lên men phòng thí nghiệm ... 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGUYÊN CỨU 2.2.1 Phương pháp lấy mẫu Phương pháp lấy mẫu đất theo tiêu chuẩn TCVN 7538-2: 2005.[31] 2.2.2. Phương pháp phân lập các chủng vi sinh vật chịu mặn và bảo quản [32] - Cân 10 gram đất vào bình tam giác 250 ml chứa 90 ml nước muối sinh lý vô trùng. Lắc 120 vòng/phút trong 30 phút. - Pha loãng dịch mẫu đến nồng độ 10-6. Lấy 100 µl dịch mẫu ở các nồng độ pha loãng10-4, 10-5, 10-6 cấy trang lên các đĩa petri chứa môi trường Bruck’s không đạm có bổ sung 3 % NaCl. Mỗi nồng độ cấy 3 đĩa. 21 - Ủ đĩa trong 3-5 ngày ở 28°C. Trong quá trình đó quan sát các khuẩn lạc mọc lên hàng ngày. - Các chủng vi sinh vật được chọn lọc thông qua hình thái bề mặt, màu sắc - Các khuẩn lạc được làm sạch và lưu giữ trong ống nghiệm bảo quản ở 40 C và bảo quản lạnh sâu ở - 800 C trong glycerol. 2.2.3. Khảo sát hình thái khuẩn lạc và đặc điểm tế bào vi khuẩn [32] Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của các chủng phân lập được đánh giá theo phương pháp của Cao Ngọc Điệp. - Đặc điểm khuẩn lạc bao gồm kích thước khuẩn lạc, hình dạng, màu sắc, độ nổi và dạng rìa. - Đặc điểm tế bào vi khuẩn bao gồm các hình dáng và sự di động của tế báo được quan sát bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần. Các tế bào vi khuẩn được nhuộm gram và quan sát dưới kính hiển vi quang học. Một số dòng vi khuẩn có tiềm năng được tiến hành chụp ảnh tế bào dưới kính hiển vi điện tử. 2.2.4. Phương pháp xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn Số lượng tế bào vi khuẩn được xác định bằng phương pháp pha loãng tới hạn và nuôi cấy trên môi trường thạch [33]. Mẫu cần xác định số lượng được lắc đều dùng pipet vô trùng hút 1 ml dịch chứa vi khuẩn cho vào ống chứa 9 ml dung dịch muối sinh lý (NaCl = 0.9%) vô trùng, trộn đều. Sau đó pha loãng đến nồng độ thích hợp tuỳ theo mật độ vi sinh vật ở mẫu. Lấy 0,1 ml dịch pha loãng ở nồng độ thích hợp cấy trang trên môi trường thạch tương ứng. Mỗi nồng độ cấy trang trên 3 đĩa và đếm số khuẩn lạc. Nuôi cấy ở nhiệt độ tủ ấm 320C. Sau 3 ngày thì đếm số lượng khuẩn lạc vi khuẩn trên từng đĩa và tính theo công thức: CFU/ml (g) = a.1/K.1/V Trong đó: CFU- Conoly forming unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc riêng rẽ) 22 a: Số khuẩn lạc trung bình xuất hiện trên các đĩa thạch có cùng độ pha loãng. V: Thể tích dịch pha loãng được cấy trang trên đĩa thạch. K: Độ pha loãng của dịch được nuôi cấy. 2.2.5 Tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn Quá trình tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn được tiến hành theo phương pháp của Sakiyama et al., bao gồm các bước như sau: - Nuôi tế bào trong ống nghiệm có chứa 4 ml môi trường Bruck’s lỏng qua đêm ở 28 °C và lắc với tốc độ 120 vòng/phút . - Lấy 1 ml dịch nuôi cấy và ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 5 phút để thu sinh khối. - Bổ sung dung dịch đệm gồm (10 mM Tris + 1 mM EDTA, pH 8) và dung dịch SDS 50%. - Bổ sung 10 µl proteinase K (10 mg/L) và ủ ở 65°C trong 20 phút, cứ sau 5 phút, đảo ngược ống eppendorf để trộn đều dung dịch. - Bổ sung thêm 200 µl 10% CTAB/0,7M NaCl, trộn nhẹ nhàng, ủ ở 65 °C trong 20 phút. - Bổ sung thêm 300 µl chloroform: isoamyl alcohol (24: 1) rồi lắc trong 10 phút, sau đó ly tâm ở tốc độ 12.000 vòng/phút trong 10 phút. Chuyển lớp trên cùng sang ống eppendorf mới. - Phần dịch nổi trên mặt (0,5 ml) được trộn với 1 ml isopropanol và giữ ở -20 °C trong 30 phút. - Thu cặn DNA bằng cách ly tâm ở 13.000 vòng/phút, 4°C trong 10 phút. - DNA được rửa hai lần với 1 mL ethanol 70% và ly tâm ở 12.000 vòng/phút, 4 °C trong 20 phút. - Bổ sung thêm 30 µl nước cất vô trùng, và bảo quản DNA ở -20 °C. - DNA sau đó được điện di trên agarose gel 1% và kiểm tra bằng máy Biorad UV 2000. 23 2.2.6. Khuếch đại gen 16S rRNA Vùng gen 16S rRNA được khuếch đại bởi các đoạn mồi xuôi 27F (5'- GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') và mồi ngược 1492R (5'- CTACGGCTACCTTGTTACGA-3' [34]. Thành phần phản ứng PCR bao gồm: DNA 30 ng, master mix (10X), mồi 27F 0,2 μM, mồi 1495R. Chu trình khuếch đại PCR: biến tính ban đầu ở nhiệt độ 95°C trong 3 phút, 30 chu kỳ (95°C trong 1 phút, 54°C trong 1 phút, 72°C trong 2 phút), và kéo dài ở 72°C trong 10 phút. Sản phẩm PCR được phân tích trên gel agarose 1,5% trong dung dịch đệm TBE 1X ở 100V trong 90 phút và chụp ảnh bằng máy ảnh gel Biorad UV 2000. Các sản phẩm PCR được giải trình tự trên máy phân tích ABI PRISM®3100-Avant. Sau đó xử lý các đoạn trình tự thu được trên phần mềm Clustal X [35]. Trình tự 16S rRNA của các chủng được so sánh với trình tự 16S rRNA của các loài được công bố trên ngân hàng GenBank. Cây phát sinh chủng loại được xây dựng trên phần mềm MEGA 7. 2.2.7. Sàng lọc các chủng vi khuẩn có khả năng cố định nitơ - Những chủng vi khuẩn có khả năng mọc trên môi trường Burk’s không đạm thì có khả năng cố định đạm. - Chọn những chủng sinh trưởng mạnh (mọc nhanh, sinh khối nhiều) trên môi trương thạch Burk’s. Chuyển sang môi trường Burk’k dịch thể nuôi lắc 120 vòng/phút, sau 72h đem ly tâm dịch nuôi lấy dịch trong để xác định lượng NH+4 sinh ra bằng phương pháp so màu với thuốc thử Nessler. 24 Hình 2.1 Đồ thị đường chuẩn ammonium sử dụng dung dịch chuẩn (NH4)2SO4 2.2.8. Sàng lọc các chủng có khả năng phân giải phosphate khó tan - Khả năng phân giải lân được đánh giá bởi vòng phân giải phosphate xuất hiện xung quanh khuẩn lạc trên môi trường NBRIP agar [36] - Những chủng có khả năng phân giải phosphate được khảo sát tiếp bằng cách nuôi trong môi trường lỏng NBRIP, lắc 120 vòng/phút ở 30 0C. Sau 72h nuôi nồng độ phosphate hòa tan trong dịch nuôi được xác định theo phương pháp so màu Blue-molyphen ở bước sóng 700nm. [37] - Lập đường chuẩn Phosphate: Chuẩn bị 9 ống nghiệm đánh số lần lượt từ 0 đến 9 với các nồng độ PO4 3-(mg/l) lần lượt là 0, 5, 10, 15, 25, 35, 40, 45, 50 mg/l rồi tiến hành thí nghiệm theo các bước như bảng sau Bảng 2.2: Kết quả các phép đo OD Nồng độ PO4 3-(mg/l) 0 5 10 15 25 35 40 45 50 Ống Falcon 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Dung dịch chuẩn KH2PO4 (mL) 0 0.1 0.2 0.3 0.5 0.7 0.8 0.9 1.0 Thêm H2O (mL) 10 9.9 9.8 9.7 9.5 9.3 9.2 9.1 9.0 Thêm K2S2O8 5%(mL) 4 y = 0.0478x R² = 0.989 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 5 10 15 20 25 OD 625 nm NH4 +(mg/l) 25 Hấp khử trùng tại nhiệt độ 121oC trong 30 phút Để nguội rồi tiếp tục định mức lên 25mL Thêm Ascorbic 10% (mL) 0,5 Để yên trong 15 giây Thêm dung dịch Mo(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O (mL) 1 Để yên trong 15 phút sau đó đo OD700nm. Xây đựng phương trìnhhồi quy tuyến tính của đường chuẩn Hình 2.2. Đồ thị đường chuẩn phosphate sử dụng dung dịch chuẩn KH2PO4. 2.2.9. Phương pháp xác định khả năng sinh IAA của các chủng chọn lọc Các chủng vi khuẩn chọn lọc có khả năng cố định đạm và phân giải phosphate được đánh giá khả năng tổng hợp chất kích thích tăng trưởng IAA. Phương pháp thử hoạt tính IAA sử dụng thuốc thử Salkowski .[38] - Các chủng phân lập được nuôi trong ống nghiệm có chứa 5 ml môi trường King’ B bổ sung thêm L-tryptophan 0,5 g/l, nuôi lắc 120 vòng/phút ở 30 oC trong 72h. - Sau đó dịch nuôi cấy được ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 10 phút. Lấy 1 ml dịch trong sau khi ly tâm trộn với 1 mL thuốc thử Salkowski (FeCl3 0,5 M trong H2SO4 98%, nước cất) và ủ trong bóng tối trong 30 phút. Mẫu dịch có chứa IAA thì xuất hiện màu đỏ và được đo độ hấp thụ màu ở bước sóng 535 nm. Căn cứ vào đường chuẩn IAA để tính hàm lượng IAA sinh ra của từng chủng. y = 0.018x R² = 0.9991 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0 10 20 30 40 50 60 OD 700 nm PO4 3- (mg/l) 26 Các chủng có khả năng sinh IAA cao được lựa chọn để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. - Lập đường chuẩn IAA: Chuẩn bị 9 ống nghiệm đánh số lần lượt từ 0 đến 9 rồi tiến hành thí nghiệm theo các bước như bảng sau: Nồng độ IAA (µg/mL) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Dung dịch chuẩn IAA (µL) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 H2O (µL) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 Thuốc thử Salkowski 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Hình 2.3 Đường chuẩn IAA 2.2.10. Phương pháp xác định đường tổng bằng phenol và acid sulfuric Nguyên tắc: Axit sulfuric có khả năng phân cắt các đường có phân tử lượng lớn tạo thành glucose. Glucose tạo phức màu với phenol có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 490 nm. Dựa vào đồ thị đường chuẩn ta có thể xác định được hàm lượng đường tổng số trong mẫu. y = 0.0317x R² = 0.9904 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 0 20 40 60 80 100 O D 5 3 0 n m IAA (µg/mL) 27 Chuẩn bị: - Hoá chất : H2SO4 đặc, dung dịch phenol 5% - Dịch ly tâm canh trường nuôi cấy - Pha dung dịch glucose chuẩn: 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 mg/l Tiến hành: - Hút 0,5 ml mẫu + 0,5 ml phenol 0,5%+2,5 ml H2SO4 đặc - Lắc đều, để nguội, rồi đo OD ở bước sóng 490 nm. Dựa vào đường chuẩn để xác định lượng đường tổng số có trong mẫu. y = 0.0121x - 0.0335 R² = 0.9912 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 0 20 40 60 80 100 O D mg/l Hình 2.4: Đồ thị đường chuẩn glucose 2.2.11. Phương pháp định lượng protein bằng phương pháp Lowry. [39] Nguyên tắc: Dựa vào đường chuẩn của protein và dựa vào phản ứng màu của protein với thuốc thử Folin. Cường độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ protein. Chuẩn bị : + Dung dịch 1: dung dich Na2CO3 trong NaOH 0,1N + Dung dịch 2: dung dịch CuSO4 1% 28 + Dung dịch 3: dung dịch muối seignhett 2% + Dung dịch 4: dung dịch Folin pha loãng với nước cất tỉ lệ 1:1 + Làm đường chuẩn: Pha dung dịch protein huyết thanh bò chuẩn có các dải nồng độ từ 0.05 đến 0.9 g/l. Tiến hành : - Pha dung dịch hỗn hợp của dung dịch 1, 2, 3 với tỉ lệ 100 :1 :1 - Hút 1 ml dung dịch hỗn hợp + 0,1 ml dung dịch mẫu để ở 300C trong 10 phút, sau đó bổ sung 1 ml dung dịch 4 rồi để tiếp ở 300C trong 30 phút rồi đo ở bước sóng 660 nm. Dựa vào đường chuẩn để xác định hàm lượng protein có trong mẫu. Hình 2.5: Đồ thị đường chuẩn biển diễn protein. 2.2.12. Phương pháp lên men Quá trình lên men dịch thể được tiến hành trong các bình tam giác dung tích từ 100 ml, 250 ml, 500 ml chứa môi trường tương ứng tuỳ từng thí nghiệm, nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ nghiên cứu, thời gian lên men có thể từ 18 đến 72 giờ. Kết thúc quá trình lên men lấy dịch lên men để phân tích các chỉ tiêu cần thiết. y = 0.0025x - 0.0429 R² = 0.992 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 100 200 300 400 500 O D mg/l 29 2.2.13. Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 2.2.13.1 Ảnh hưởng của NaCl lên sinh trưởng, khả năng cố định nitơ và tổng hợp IAA Chủng vi sinh được nuôi cấy trong môi trường được bổ sung các nồng độ muối khác nhau: 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, và 10%. Dịch vi khuẩn được nuôi ở trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút ở 30°C. Sau 72h thu dịch lên men xác định khả năng sinh trưởng bằng phương pháp đếm khuẩn lạc và ly tâm 10,000 vòng/ phút trong 5 phút lấy dịch trong đo nồng độ IAA bằng phương pháp so màu với thuốc thử Salkowki, đo hàm lượng NH4 + bằng phương pháp indolephenol blue. Từ đó chọn được nồng độ muối thích hợp cho sự tổng hợp amoni, tăng chất kích thích sinh trưởng IAA và khả năng sinh trưởng của vi sinh vật. 2.2.13.2 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng carbon đến sinh trưởng của các chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng cố định đạm a) Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng carbon. Dùng môi trường dịch thể Bruck’s với các nguồn carbon có hàm lượng 10 g/l gồm: glucose, sucrose, tinh bột, manitol, lactose Tiến hành nuôi cấy dịch môi trường với các chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng cố định đạm với các nguồn cacbon như trên ở pH 7 trên máy lắc tốc độ 120 vòng/phút. Sau 24h nuôi cấy tiến hành xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Từ đó chọn được nguồn cacbon thích hợp nhất cho quá trình sinh trưởng và phát triển của các chủng vi sinh vật đã tuyển chọn. b) Ảnh hưởng của nồng độ nguồn carbon Nuôi lắc các chủng chọn lọc trên môi trường Bruck’s chứa nguồn carbon thích hợp nhất vừa được xác định, với các nồng độ khác nhau: 5, 10, 15, 20, 25, 30 g/l ở pH 7 trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút. Sau 24 giờ nuôi cấy tiến hành xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Từ đó chọn được nồng độ cacbon thích hợp nhất cho quá trình sinh trưởng và phát triển của các chủng vi sinh vật đã tuyển chọn. 30 2.2.13.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ Để nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh khối của các chủng vi sinh vật chịu mặn bản địa. Tiến hành nuôi cấy các chủng chọn lọc trên môi trường Bruck’s chứa nguồn carbon thích hợp ở các nhiệt độ khác nhau: 25oC; 27 oC, 30oC, 35oC, 37 oC ,40oC, 45oC trên máy lắc có tốc độ 120 vòng/phút. Sau 24 giờ nuôi cấy tiến hành xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Từ đó chọn được nhiệt độ thích hợp nhất cho quá trình sinh trưởng và phát triển của các chủng vi sinh vật đã tuyển chọn. 2.2.14.4 Ảnh hưởng của pH Để nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến sinh khối các chủng vi sinh vật chịu mặn bản địa tiến hành tăng sinh các chủng vi sinh vật chịu mặn bản địa chọn lọc trên môi trường Bruck’s chứa nguồn carbon, nồng độ carbon và nhiệt độ thích hợp nhất đối với các chủng đã chọn lọc ở các pH khác nhau: 5.5; 6; 6,5; 7,5; 8; 8.5; 9 trên máy lắc xoay 120 vòng/phút. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Từ đó chọn được pH thích hợp nhất cho quá trình sinh trưởng và phát triển của các chủng vi sinh vật đã tuyển chọn. 2.2.13.5 Ảnh hưởng của thời gian nhân sinh khối Các chủng vi sinh vật được nhân sinh khối trên môi trường có các yếu tố thích hợp để tăng sinh khối chủng vi sinh vật như nhiệt độ, pH, nguồn cacbon, nguồn nitơ Trong quá trình nuôi lấy mẫu ở các thời điểm 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 48h để xác định mật độ tế bào sinh ra, hàm lượng đường, đạm tiêu hao trong quá trình lên men. Từ đó chọn được thời gian để sinh khối đạt cực đại cho quá trình sinh trưởng và phát triển của các chủng vi sinh vật đã tuyển chọn . 31 2.2.14 Sản xuất thử nghiệm chế phẩm phân vi sinh chịu mặn cố định đạm [29][40] Qui trình tạo chế phẩm vi sinh: Sinh khối vi sinh vật sau quá trình lên men được ly tâm và trộn với chất mang sạch được lựa chọn là mùn hữu cơ để đạt chế phẩm phân vi sinh có vi sinh vật đạt mật độ 108 cfu/g. Nhân giống cho sản xuất (cấp1, 2) Các chất dinh dưỡng Tạo môi trường lên men Giống cho sản xuất Lên men Các điều kiện cần thiết cho lên men Thu sinh khối Trộn với chất mang Chế phẩm Giống vi sinh vật 32 2.2.15. Thử nghiệm, đánh giá chế phẩm vi sinh Thí nghiệm có 2 công thức : Công thức 1: Hạt được trồng trên mẫu đất nền cổ lấy từ đảo Trường Sa xử lý sạch về mặt vi sinh vật được phối trộn chất mang mùn dùng làm phân vi sinh cố định đạm xử lý sạch về vi sinh vật làm đối chứng 1. Công thức 2: Hạt được trồng trên mẫu đất nền cổ lấy từ đảo Trường Sa được xử lý sạch về mặt vi sinh vật phối trộn phân vi sinh cố định đạm từ hai chủng vi khuẩn chụi mặn bản địa. Mỗi công thức gồm 3 khay ( 3 lần lặp lại). Hạt rau muống sẽ được gieo vào hai giá thể trông cây trên. Quy trình chăm sóc theo hưởng dẫn canh tác rau thông thường. Các chỉ tiêu theo dõi số lá trên cây, chiều cao cây, khối lượng rễ, trọng lượng tươi sau 30 ngày gieo hạt. Thí nghiệm gồm 2 lô: 01 lô đối chứng không nhiễm vi sinh vật chịu mặn cố định đạm bản địa.; 1 lô thực nghiệm có xử lý nhiễm vi sinh vật chịu mặn có khả năng cố định đạm, thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp 3 khay. Các chỉ tiêu theo dõi sinh trưởng của cây rau muống sau 30 ngày tuổi: số lá/cây, chiều cao cây, chiều lá, khối lượng rễ, khối lượng tươi. Các chỉ tiêu được đo đếm theo phương pháp thông thường. 33 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 PHÂN LẬP VI SINH VẬT CHỊU MẶN CÓ KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM TỪ MẪU ĐẤT LẤY TẠI CÁC ĐẢO THUỘC QUẦN ĐẢO TRƯỜNG SA Từ 42 mẫu đất được thu thập từ các vi trí khác nhau trên quần đảo Trường Sa, đã phân lập được 185 chủng trên môi trường môi trường NA có bổ sung 3% NaCl. Từ 185 chủng vi sinh vật phân lập được tiến hành nuôi cấy trên môi trường Burk’s không đạm. Những chủng sinh trưởng được trên môi trường này là những chủng có khả năng cố định nitơ. Đã lựa chọn được 36 chủng. Kết quả hình thái khuẩn lạc của các chủng vi sinh vật cố định đạm chịu mặn được trình bày trong bảng 1 phần phụ lục Bảng 3.1: Hình thái khuẩn lạc của các chủng cố định đạm Hình 3.2 Hình ảnh khuẩn lạc (trái) và tế bào (phải) của chủng STT3 3.1 quan sát dưới vật kính 100X 34 Hình 3.3: Hình ảnh khuẩn lạc (trái) và tế bào (phải) của của chủng N 4.1 quan sát dưới vật kính 100X 3.2. KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM, HÒA TAN PHOSPHATE VÀ SINH IAA CỦA CÁC CHỦNG CHỌN LỌC Tiến hành nuôi cấy 36 chủng vi khuẩn được lựa chọn trên môi trường Bruck’s để xác định khả năng cố định đạm. Ba mươi sáu chủng trong nghiên cứu này có khả năng tổng hợp amoni khá cao (Hình 3.4). Nồng độ amoni tạo ra từ 12,78 đến 25,18 mg/l. Trong đó hai chủng STT3 3.1 và N4.1 có hoạt tính sinh học đạt kết quả cao nhất lần lượt là 25,18 ± 1,14 mg/l và 19,02 ± 0,21 mg/l sau 72h nuôi cấy. Kết quả tương tự cũng được các tác giả Nguyễn Anh Huy và Nguyễn Hữu Tiệp (2018) công bố, họ đã phân lập được 116 chịu mặn trên môi trường Burk’s từ đất sản xuất lúa - tôm ở Bạc Liêu, Sóc Trăng và Kiên Giang. Tất cả 116 vi khuẩn có khả năng tổng hợp amoni. Trong đó hai dòng PL2, PL9 có cả nitơ cố định nitơ cao, ammoni tổng hợp PL2 đạt 3,73 mg/l, PL9 đạt 2,71 mg/l [31]. Hình 3.4: Đồ thị thể hiện hàm lượng amoni tổng hợp của 36 chủng. 35 Sàng lọc khả năng phân giải phosphate khó tan từ 36 chủng vi khuẩn cố định đạm phân lập từ đất Trường Sa trên. Tiến hành nuối cấy các chủng vi khuẩn này trên môi trường NBRIP dịch thể để xác định hàm lượng PO4 3- sinh ra. Thí nghiệm này được lặp lại 3 lần và lấy giá trị trung bình các lần đo, số liệu được xử lý qua phần mền IRISTART có chỉ số LSD= 1,085. Cv% là 0,5%. Kết quả được trình bày trong hình 3.5. Trong 36 chủng vi khuẩn phân giải phosphate, hai chủng AB3 1.3, chủng STT3 và chủng N4.1 có hoạt tính đạt hiệu quả cao nhất lần lượt là 307,08 ± 1,08 mg/l và 295,02 ±1,08 mg/l và 282,88± 1,08mg/l sau 96h nuôi cấy, cao hơn so với các chủng còn lại. Thấy rằng tác giả Nguyễn Thị Thanh Mai và cộng sự (2017) [41] cũng đã phân lập được chủng CF9 từ đất trồng cà phê khu vực Tây Nguyên có khả năng chịu mặn đến nồng độ muối 10%, hoạt tính phân giải phosphate cao nhất khi nồng độ muối 1% là 145,55 mg/l. Hình 3.5. So sánh khả năng phân giải phosphate của các chủng phân lập Từ 36 chủng vi sinh vật cố định đạm tiếp tục tiến hành thí nghiệm sàng lọc khả năng sinh IAA. Ba mươi sáu chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường King B. Kết quả thể hiện trong hình 3.6, thu được 33 chủng có khả năng sinh IAA trong đó chủng N4.1 cho lượng IAA sinh là nhiều nhất đạt 33.49±0,33 mg/l. Các chủng vi khuẩn trong báo cáo này có khả năng sinh 36 IAA tương đối giống với các chủng được phân lập bởi Nguyễn Thị Thu Hà (2009) [24]. Tác giả này đã phân lập được vi sinh vật có khả năng tổng hợp IAA 5,84 đến 39,64 mg/l, trong đó chủng H4 sinh IAA đạt 39,64 mg/l. Cao Ngọc Diệp (2015)[33] phân lập các chủng vi sinh vật khả năng tổng hợp IAA từ 2,352μg/ml đến 5,741μg/ml. Nồng độ cao nhất là KL39a với nồng độ IAA là 5,741 mg /l. Nguyễn Anh Huy và Nguyễn Hữu Tiệp (2018)[31] đã được phân lập các chủng vi khuẩn trên môi trường Burk bổ sung 1% muối. Tất cả 116 chủng vi khuẩn trong nghiên cứu này có khả năng tổng hợp ammonium và axit axetic indole tổng hợp (IAA). Các dòng PL2 và PL9 có cả cố định nitơ và tổng hợp IAA cao: IAA tổng hợp PL2 đạt 45,31mg/mL; PL9 tổng hợp IAA đạt 46,46 mg/l, giống với các chủng trong nghiên cứu này [9]. Nguyễn Thị Thanh Mai và cộng sự (2017) [41] đã phân lập được chủng CF9 từ đất trồng cà phê khu vực Tây Nguyên có khả năng chịu mặn đến nồng độ muối 10% và sinh IAA đạt 68,79 mg/l. Hình 3.6.So sánh khả năng sinh IAA của 36 chủng vi khuẩn. Từ 3 thí nghiệm trên với các số liệu được kiểm tra đánh giá độ tin cậy cao với giá trị LSD đạt trong khoảng 0,31 đến 1,08 là khoảng giá trị đáng tin cậy, chúng tôi đã tuyển chọn được 2 chủng vi sinh vật là N4.1 và STT3 3.1 có các hoạt tính cố định đạm, phân giải phosphate và khả năng sinh IAA cao để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 37 3.3 GIẢI TRÌNH TỰ GEN 16S rRNA CỦA HAI CHỦNG CHỌN LỌC N4.1 VÀ STT 3 3.1 DNA tổng số của 2 chủng vi khuẩn được tách chiết bằng kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Gen 16S rRNA được khuếch đại và giải trình tự bằng cặp mồi phổ thông 27F và 1492R. Trình tự 16S rRNA của hai chủng vi khuẩn được xác định trên hệ thống máy giải trình tự tự động ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystem). Các đoạn trình tự thu được được sắp xếp thẳng hàng với nhau bằng công cụ Seqman trong phần mềm DNASTAR để đạt được trình tự gen 16S rRNA hoàn chỉnh. Những trình tự 16S rRNA hoàn chỉnh được so sánh với các trình tự 16S rRNA đã được công bố trên ngân hàng dữ liệu GenBank để xác định tỷ lệ tương đồng. Kết quả so sánh 16S rRNA được trình bày trong bảng 3.5 Bảng 3.2. Kết quả giải trình tự gen 16S rRNA của chủng N 4.1 và STT3 3.1 TT Chủng Loài gần nhất Kí hiệu chủng Tương đồng (%) 1 N 4.1 Bacillus aryabhattai MH261073 99 2 STT3 3.1 B