Luận văn Phân tích đa dạng di truyền nguồn tài nguyên một số loài cây dược liệu ở Việt Nam bằng chỉ thị ADN

thụt, nhẵn, chỉ nhị rộng mập, trung đới dày. Hoa hồi thuộc loại hoa lưỡng tính [28]. Quả cấu tạo bởi 8 đại đều và rời nhau. Các đại hình thoi xếp tỏa tròn thành hình sao hay hình nan hoa xung quanh một trục, khi non màu xanh lục sau chuyển màu nâu sẫm, phần đính cuống rộng bản và dẹt, đầu có mũi nhọn ngắn, thẳng, khi chín nứt ở mặt trên. Mỗi một đại mang một hạt. Hạt hồi thường có hình trứng nhẵn bóng, màu nâu hoặc đỏ nhạt [2, 28]. a b c d Ch
ng 2. Vt liu - Ph
ng pháp NCD LUẬN VĂN THẠC SĨ 27 Hồi núi Theo Đỗ Huy Bích và cộng sự (2003), Hồi núi ở Việt Nam là những cây thân gỗ nhỡ hoặc to, cao trung bình từ 7 - 14 m, tán lá tròn. Cây Hồi núi có cành non mềm có vỉ màu lục nhạt cành khi già có màu xám tro. Hoa Hồi núi thường mọc đơn độc ở kẽ lá, màu hồng đỏ như I. griffithii [2], hay vàng nhạt như I. anasitum, có cuống thường dài hơn cuống lá. Quả Hồi núi thường có nhiều cánh khoảng từ 10 đến 13 cánh mọc tỏa tròn, thường mỏng và không đều nhau. Lá Hồi núi thường mọc so le, thường tụ tập 4 - 5 cái, hình mác, dai và nhẵn, đầu nhọn. Hình 2. a-b) Hình thái lá và quả cây Hồi hương (Illicium verum Hook.f); c-d) Hình thái lá và quả của cây Hồi núi (I. anasitum). 2.1.3. Chi Morinda Cây Ba kích có đặc điểm hình thái cơ bản như sau (Đỗ Huy Bích và cs, 2003): dạng cây thảo, sống lâu năm, thân leo dài hàng mét, đường kính thân từ 3 - 5 mm và có nhiều lóng. Lá mọc đối hình mác hoặc bầu dục, thuôn nhọn, dày và cứng, dài 6 - 14 cm, rộng 2,5 - 6 cm, cuống ngắn, lúc non có lông dày ở mặt dưới, thường tập trung ở các gân lá và mép lá, mầu xanh lục, sau già ít lông hơn mầu trắng mốc; lá kèm mỏng, ôm sát vào thân. Tập hợp mẫu cây Ba kích được thu thập tại các tỉnh Phú Thọ, Thái Nguyên, Hòa Bình và được phân loại dựa trên 2 đặc điểm hình thái chính (hình thái thân có lông và thân không có lông; hình thái ba kích quả tụ và quả rời) do các chuyên gia của Viện Dược Liệu xác định. Kí hiệu các mẫu bao gồm hai chữ cái thể hiện hai đặc điểm hình thái thân có (không có) lông (L hoặc K) và quả tụ (rời) (T hoặc R) kèm theo số thứ tự của mẫu (kí hiệu cụ thể ở Bảng 4). Trong số các mẫu thu thập được có những mẫu có cả đặc điểm hình thái quả tụ và quả rời trên cùng một chùm quả. Để tiện theo dõi, chúng tôi kí hiệu là L và K (Bảng 4). a b c d Ch
ng 2. Vt liu - Ph
ng pháp NCD LUẬN VĂN THẠC SĨ 28 Hình 3. Hình thái các loại kiểu hình của cây ba kích sử dụng trong nghiên cứu: a) quả tụ; b) quả rời; c) thân có lông; d) thân không có lông. 2.1.4. Chi Panax Tổng cộng 34 mẫu thực vật đã được thu thập hoặc từ các điểm trồng bảo tồn hoặc mọc tự nhiên ở vùng Sapa thuộc tỉnh Lào Cai và Ngọc Linh thuộc địa phận hai tỉnh Quảng Nam và Kon tum (Bảng 4). Đặc biệt, trong số các mẫu cây thuốc thu thập được có một số cây có kiểu hình lá xẻ nông, hiện tại về mặt hình thái chưa thống nhất xếp vào loài Sâm Vũ Diệp (có kiểu hình thái lá xẻ sâu điển hình) hay loài Tam thất hoang (có kiểu hình thái lá không xẻ). Trong nghiên cứu này, chúng tôi tạm gọi những mẫu thực vật đó là Dạng trung gian (TG) Sâm Vũ Diệp – Tam thất hoang. Sâm Việt Nam (Sâm Ngọc Linh, Panax vietnamensis Ha et Grushv.) Về mặt hình thái, Sâm Việt Nam là loài cây thân thảo, cao từ 40 đến 80 cm, có thân rễ nạc mọc bò ngang. Thân rễ phân thành nhiều đốt nhưng không phân nhánh, dài chừng 30 đến 40 cm, trên bề mặt có nhiều vết sẹo do thân khí sinh lụi hàng năm để lại, mặt ngoài màu nâu nhạt, ruột trắng ngà, phía cuối đôi khi có củ hình cầu. Thân khí sinh của cây Sâm Việt Nam mảnh, mọc thẳng, lụi hàng năm, mang từ 2 đến 4 lá kép chân vịt mọc vòng. Mỗi lá kép có 5 lá chét hình mác với mép có khía răng nhỏ, dài khoảng 10 đến 14 cm, rộng từ 3 đến 5 cm. Ngọn thân có cụm hoa mọc thành tán đơn, cuống dài màu lục vàng. Quả Sâm Việt Nam hình trứng, màu đỏ sau đen, hạt màu trắng hình thận, có vân (Đỗ Huy Bích, 2003). Sâm Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Về hình thái, Sâm Vũ Diệp là cây thân thảo, cao từ 30 đến 50 cm, có thân rễ dài và vặn vẹo, phân nhiều đốt, đầu rễ có hình con quay. Thân khí sinh mảnh, có a b c d Ch
ng 2. Vt liu - Ph
ng pháp NCD LUẬN VĂN THẠC SĨ 29 vạch dọc, thường đơn độc, mọc thẳng và rỗng giữa. Lá kép chân vịt gồm 2 đến 3 lá mọc vòng. Lá chét từ 5 đến 7, thuôn, dài từ 2,5 đến 14 cm, rộng từ 1,5 đến 4 cm, mặt trên có lông. Lá chét xẻ thùy hình lông chim rõ rệt, mép khía răng. Cụm hoa mọc ở ngọn thân thành tán đơn, hoa màu trắng lục có 5 cánh, 5 nhị, bầu 2 đến 3 ô. Quả mọng, hình cầu hơi dẹt, màu đỏ, có chấm đen ở đầu, chứa từ 2 đến 3 hạt hình cầu. Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T. Tsai et K.M. Feng) Về đặc điểm hình thái, Tam thất hoang là cây thân thảo, cao từ 25 đến 75 cm. Thân rễ mập, nằm ngang, ít khi phân nhánh, đường kính từ 1,5 đến 3 cm, có nhiều u lồi dính kết nhau. Bề mặt thân rễ có nhiều sẹo lõm do các vết thân lụi để lại. Thân khí sinh mọc thẳng, nhẵn, mang từ 1 đến 3 lá kép chân vịt mọc vòng ở ngọn, cuống lá từ 5 đến 10 cm. Lá chét có 5 cái, cuống ngắn, gốc cuống đôi khi có phần phụ hình tai hoặc hình chỉ, phiến lá chét hình thuôn hay mác, không xẻ thuỳ, dài từ 5 đến 13 cm, rộng từ 2 đến 4 cm. Mép lá chét có răng cưa, thường có lông ở gân lá mặt trên. Một số cây non có thể có lá chét xẻ thuỳ nông hình lông chim. Cụm hoa là tán đơn, mọc ở ngọn, hoa màu vàng xanh, 5 lá đài, 5 cánh hoa, 5 nhị, bầu 2 ô. Quả mọng, hình cầu dẹt, đường kính từ 0,6 đến 1,2 cm, khi chín có màu đỏ. Hạt lớn, dài từ 5 đến 6 mm, hình gần giống hạt đậu tròn, màu xám trắng, vỏ cứng, có rốn hạt (Nguyễn Tập, 2005). Hình 4. Các loài thực vật thuộc chi Panax trong nghiên cứu: a) Sâm Việt Nam (P. vietnamensis); b) Sâm Vũ Diệp (P. bipinnatididus); c) dạng trung gian giữa Sâm Vũ Diệp-Tam thất hoang; d) Tam thất hoang (P.stipulenatus). a b c d Ch
ng 2. Vt liu - Ph
ng pháp NCD LUẬN VĂN THẠC SĨ 30 Hình 5. Bản đồ các địa phương thu mẫu dược liệu trong nghiên cứu (theo điều tra của các cán bộ Phòng tài nguyên, Viện Dược liệu, Bộ Y tế). Trà Linh, Trà My,Quảng Nam Ngok Lây, Tumorong, Kon Tum Bản Khoang, Sapa, Lào Cai Thị trấn Sapa, Lào Cai Thạch An, Cao Bằng Tràng Định, Lạng Sơn Văn Lãng, Lạng Sơn Bát Xát, Lào Cai Hoàng Liên Sơn, Lào Cai Na Rì, Bắc Cạn Văn Quan, Lạng Sơn Bình Liêu, Quảng Ninh Tân Lạc, Hòa Bình Đoan Hùng, Phú Thọ Đại Từ, Thái Nguyên SƠ ĐỒ THU MẪU Địa điểm thu mẫu chi Acanthopanax Địa điểm thu mẫu chi Illicium Địa điểm thu mẫu chi Morinda Địa điểm thu mẫu chi Panax Thái Nguyên Phú Thọ Hòa Bình Quảng Nam Kon Tum Cao Bằng Bắc Cạn Lạng Sơn Quảng Ninh HÀ NỘI Lào Cai Ch
ng 2. Vt liu - Ph
ng pháp NCD LUẬN VĂN THẠC SĨ 31 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Tách chiết ADN tổng số bằng phương pháp mini-CTAB cải tiến Để thu ADN tổng số (ADNts), chúng tôi đã tiến hành tách chiết ADNts từ các mẫu thực vật theo phương pháp mini-CTAB (do Saghai-Maroof và cộng sự đưa ra năm 1984) có cải tiến. Cơ sở lý thuyết Phương pháp này sử dụng CTAB (Hexadecyltrimethylammoniumbromid) – một chất tẩy cation hình thành phức hợp với những polysaccharide, protein, polyphenol, Phức hợp này sau đó được tách ra khỏi dung dịch tách chiết bằng hỗn hợp chloroform – isoamyl alcohol, bằng cách hình thành 2 pha: pha thứ nhất là dung dịch sạch ở phía trên có chứa ADN, pha thứ hai đặc hơn ở dưới chứa chloroform và tất cả những thành phần cần loại bỏ khác (polysaccharide, protein,). Sau khi ly tâm, thu được ADN. Thông thường quy trình ly trích ADN ở thực vật gồm 3 giai đoạn: • Giai đoạn 1: Phá vỡ màng tế bào và màng nhân. Tế bào lá được nghiền với dịch trích EB (extraction buffer) để phá vỡ màng tế bào, giải phóng các thành phần có trong tế bào ra ngoài môi trường dịch trích. • Giai đoạn 2: Làm biến tính protein, loại bỏ protein và các thành phần hữu cơ khác (polysaccharide, polyphenol, lipid,). • Giai đoạn 3: Tủa ADN bằng isopropanol hay ethanol 100 %, thường tủa bằng isopropanol lạnh trước, sau đó tiếp tục tủa bằng ethanol 100 % kết hợp với muối. Quy trình thực hiện Quy trình tách chiết được mô tả ngắn gọn như sau: 1. Cân 200 mg mẫu đã nghiền thành dạng bột mịn trong nitơ lỏng vào ống Eppendorf 1,5 ml 2. Bổ sung 900 µl dung dịch CTAB 2%, trộn đều bằng cách đảo ống nhẹ nhàng và ủ ở 65оC trong 90 phút 3. Làm nguội về nhiệt độ phòng, bổ sung 450 µl chloroform/isoamylalcohol (tỷ Ch
ng 2. Vt liu - Ph
ng pháp NCD LUẬN VĂN THẠC SĨ 32 lệ 24:1 v/v), đảo nhẹ hai đầu ống để trộn đều và để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút 4. Ly tâm ở 4оC trong 10 phút với tốc độ 13.000 – 14.000 vòng/phút 5. Dùng pipet hút phần dịch nổi bên trên chuyển sang một ống Eppendorf sạch 6. Bổ sung 600 µl iso-propanol, trộn đều bằng cách đảo đầu ống nhẹ nhàng, ủ trong tủ lạnh từ 3 - 12 giờ. 7. Ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 10 phút với tốc độ 13.000 - 14.000 vòng/phút 8. Đổ bỏ phần dịch phía trên và rửa ADN tủa bằng 800 µl dung dịch Wash I trong 5 phút 9. Ly tâm thu lại tủa ở 13.000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng 10. Rửa ADN tủa bằng 100 µl dung dịch Wash II (ethanol 70%) trong 5 phút 11. Ly tâm thu lại tủa ở 10.000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, để tủa khô tự nhiên 12. Hoà tan ADN kết tủa trong 100 µl đệm TE, bảo quản ở 4оC Kiểm tra chất lượng ADNts bằng phương pháp điện di và quang phổ Vật liệu để tách chiết ADNts là thân, rễ và lá của các mẫu đã được nghiền mịn. Chúng tôi đã tiến hành tách chiết riêng rẽ các phần của mẫu thực vật và so sánh hàm lượng ADN thu được bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8% (0,8 g agarose + 100 ml TBE 1X) ở 60 - 80 V trong 30 phút để xác định bộ phận cho hiệu suất thu ADN cao nhất sử dụng cho các thí nghiệm tách chiết tiếp theo. Nồng độ và kích thước tương đối của sản phẩm ADNts được xác định bằng cách so sánh với marker Lambda/HindIII. Tiếp đó, sản phẩm ADNts được pha loãng 100 lần (10 µl ADNts + 990 µl ddH2O) cho thí nghiệm đo mật độ quang phổ (OD – Optical Density) bằng máy đo quang phổ Biomate ở các bước sóng 260 và 280 nm. Mức tinh sạch của sản phẩm (mức độ lẫn ARN và protein) được xác định bằng tỷ số quang phổ hấp thụ OD260/OD280. Nồng độ ADN của dung dịch gốc được tính theo công thức 1,0 OD260 = 50 ng/µl. Ch
ng 2. Vt liu - Ph
ng pháp NCD LUẬN VĂN THẠC SĨ 33 2.2.2. Phân tích di truyền bằng kỹ thuật RAPD-PCR Cơ sở lý thuyết PCR (Polymerase chain reaction) là phương pháp tổng hợp lượng lớn ADN in vitro trên cơ sở mẫu khuôn. Quá trình tổng hợp ADN kéo dài mồi dựa trên nguyên tắc bắt cặp đặc hiệu của các đoạn ADN có trình tự bổ sung và khả năng kéo dài chuỗi của enzym bền nhiệt (phổ biến là Taq polymerase - phân lập từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus). PCR gồm một chuỗi nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ có ba bước: biến tính, gắn mồi và kéo dài chuỗi. Kết quả, sau khoảng 2 - 3 giờ, lượng ADN sẽ được nhân bản lên khoảng 200 - 500 lần. Kỹ thuật RAPD-PCR ra đời ngay sau khi phản ứng PCR được phát triển, là kỹ thuật nhân bản ADN hệ gen sử dụng các mồi tổng hợp ngắn (phổ biến nhất là 10 nucleotide) có trình tự ngẫu nhiên trong điều kiện nhiệt độ gắn mồi thấp. Điểm khác biệt rõ nét nhất của kỹ thuật RAPD-PCR so với các kỹ thuật PCR truyền thống là chỉ có một trình tự oligonucleotide được sử dụng làm mồi trong một phản ứng, và những hiểu biết về các đoạn gen được nhân lên là không cần thiết. Với nhiệt độ gắn mồi phù hợp, các mồi oligonucleotide trình tự ngẫu nhiên sẽ gắn vào một vài vị trí có trình tự bổ sung trên sợi khuôn ADN và cho sản phẩm nhân bản nếu các vị trí gắn mồi nằm trong phạm vi có thể nhân bản được. Sự khác biệt về trình tự nucleotide của các khuôn ADN khác nhau được thể hiện ở sự có mặt hay vắng mặt của các băng nhân bản. Quy trình thực hiện Phản ứng RAPD-PCR được tiến hành trên tất cả các mẫu với tổng cộng 40 mồi ngẫu nhiêu 10 nucleotide (Operon Technologies, Mỹ) bao gồm OPA-1 đến OPA-20; OPC-1 đến OPC-20. Thành phần và quy trình nhiệt của phản ứng RAPD- PCR được trình bày trong Bảng 5. Ch
ng 2. Vt liu - Ph
ng pháp NCD LUẬN VĂN THẠC SĨ 34 Bảng 5. Thành phần (Bảng bên trái) và quy trình nhiệt (Bảng bên phải) của phản ứng RAPD- PCR 2.2.3. Điện di ADN trên gel agarose Sản phẩm nhân bản được phân tích trên gel điện di agarose 1 – 1,5% chạy ở hiệu điện thế 60 – 80 V trong 45 phút bằng phương pháp nhuộm hiện hình với ethidium bromide. Kích thước tương đối của các băng nhân bản được so sánh với marker 1 kb (Fermentas, 1 kb ADN Ladder). Cơ sở lý thuyết Trong môi trường có pH trung tính, ADN mang điện tích âm. Do đó, khi được đặt trong một điện trường đều, ADN sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương. Trên môi trường chất giá agarose, các đoạn ADN có kích thước khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau (đoạn ADN có kích thước lớn hơn sẽ di chuyển chậm hơn đoạn ADN có kích thước nhỏ hơn) và sẽ tách biệt nhau trong quá trình chạy. Quy trình Chuẩn bị gel agarose - Cân bột agarose rồi hoà tan vào đệm TBE 1X sao cho được nồng độ 0,8%. - Đun sôi dịch agarose cho đến khi tan hết và để dịch nguội đến khoảng 50oC thì đổ vào khuôn có cài sẵn răng lược. - Gel sẽ đông và ổn định hoàn toàn trong khoảng 30 phút. - Rút lược nhẹ nhàng ra khỏi khuôn, đặt gel vào bể điện di, đổ đệm TBE 1X tới khi ngập mặt gel. Tra mẫu ADN vào giếng Thành phần phản ứng Thể tích (µl) ddH2O 16,3 ADN khuôn 1,0 10x Taq buffer 2,5 2 mM dNTPs 2,5 Mồi (10-mer Operon) 2,0 5 u/µl Taq polymerase 0,7 Tổng thể tích phản ứng: 25 µl Nhiệt độ (оC) Thời gian Số chu kỳ 94 4’ 1 94 1’ 40 37 1’ 72 2’ 72 7’ 1 4 ∞ 1 Ch
ng 2. Vt liu - Ph
ng pháp NCD LUẬN VĂN THẠC SĨ 35 - Tùy thuộc vào mục đích điện di khác nhau mà ta có thể sử dụng nồng độ ADN cao hoặc thấp. - Tra mẫu sau khi đã đổ đệm TBE 1X vào khuôn điện di cho ngập gel. Mẫu được trộn với loading dye 6X với tỷ lệ mẫu: loading dye là 5:1 và được đưa vào giếng. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với hiệu điện thế 75 V trong khoảng 45 phút. - Trong quá trình chạy, cần quan sát sự di chuyển của bromophenol để biết lúc nào cần dừng điện di. Nhuộm ADN bằng ethidium bromide: Quá trình điện di kết thúc khi băng màu bromopenol chạy được 2/3 bản gel agarose, bản gel được lấy ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch ethidium bromide nồng độ 0,5 µg/ml trong khoảng 15 phút rồi rửa lại bằng nước. Quan sát và chụp ảnh: Bản gel sau khi nhuộm ethidium bromide được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại với bước sóng λ = 302 nm. 2.2.4. Dựng cây quan hệ di truyền bằng phần mềm NTSYSpc 2.02h Với sự phát triển của sinh học phân tử, người ta có xu hướng phân nhóm đa dạng di truyền ở mức độ phân tử. Như vậy, sự chính xác sẽ cao hơn rất nhiều so với phương pháp truyền thống dựa trên tính trạng hình thái học. Người ta khai thác những khả năng phân tích rất nhanh nhạy của máy tính (computer) với nhiều phần mềm chuyên dùng, trong đó NTSYS là phần mềm tương đối phổ biến. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phiên bản phần mềm NTSYSpc 2.02h (Numerical Taxonomy System Applied Biotstatistics, Setauket, New York). Các kết quả điện di sản phẩm RAPD-PCR được chuyển thành dạng ma trận nhị phân. Từ ma trận nhị phân nói trên, sử dụng hệ số tương quan DICE (SD), ma trận tương đồng theo từng cặp được xây dựng. Hệ số SD được tính bằng hai lần số băng chung của hai mẫu chia cho tổng số băng thu được của hai mẫu đó (S = 2NAB / (NA + NB)). Như vậy, hệ số thu được là 1 có nghĩa là hai mẫu hoàn toàn giống nhau, trong khi 0 có nghĩa là hai mẫu không có điểm chung nào. Cuối cùng, cây quan hệ Ch
ng 2. Vt liu - Ph
ng pháp NCD LUẬN VĂN THẠC SĨ 36 di truyền giữa các mẫu được xây dựng theo phương pháp UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical Averages). Theo nội dung này, chúng ta cho điểm 1 khi có băng thể hiện, và điểm 0 khi băng không thể hiện trong điện di. Phân tích ma trận tương đồng, ma trận khoảng cách (similarity / distance matrix) Các giá trị tương đồng và khoảng cách là những giá trị ước đoán về mặt số lượng nhằm mô tả sự gần gũi và khoảng cách di truyền giữa hai cặp đơn vị mục tiêu. Giá trị tương đồng biến thiên từ 0 đến 1. Khoảng cách giảm khi giá trị tương đồng tăng. Khoảng cách (distances) còn được dùng với thuật ngữ “dissimilarities” Sokal và Sneath (1963) mô tả nhiều cách tính toán khoảng cách và mức độ giống nhau giữa hai đơn vị mục tiêu. Khi giá trị ở dạng nhị phân (binary), nghĩa là 1 (có) và 0 (không có), chúng ta đưa chúng về Bảng hai chiều như sau với 2 đơn vị mục tiêu là i và j. Đơn vị mục tiêu i 1 0 Đơn vị mục tiêu j 1 a b m = a + d u = b+ c n = m + u 0 c d Trong đó, m là số dữ liệu tương ứng, u là số dữ liệu không tương ứng, n là tổng số băng ghi nhận được. Giá trị khoảng cách Giá trị khoảng cách là độ lệch của những chỉ số biểu thị mức độ giống nhau. Chỉ số tương đồng S (similarity) biến thiên từ 0 đến 1 có thể được chuyển đổi thành giá trị d (distance) theo công thức d = 1 - S Chúng ta có thể tính toán bằng tay để chuyển đổi chỉ số Dice thành chỉ số khoảng cách, nhưng với phần mềm chuyên dùng NTSYSpc 2.02h, chúng ta sẽ dễ dàng hơn rất nhiều để có kết quả với nhiều cặp đơn vị mục tiêu. Ch
ng 2. Vt liu - Ph
ng pháp NCD LUẬN VĂN THẠC SĨ 37 Xếp nhóm bằng phương pháp UPGMA Phân tích nhóm (cluster analysis) thực sự là phương pháp sắp xếp các giống thành những cụm nhóm khác nhau trên cơ sở mức độ giống nhau theo qui ước (người ta còn gọi với thuật ngữ agglomerative clustering). Nó được thực hiện theo qui trình tiêu chuẩn, nên người ta còn gọi đó là “greedy algorithm”. Qui trình theo các bước tiến hành như sau: • Tìm các cặp (i, j) có giá trị khoảng cách nhỏ nhất (hoặc giống nhau nhất) • Nhập các cặp này lại thành một nhóm (cluster) • Tạo ra nhóm lớn hơn tương ứng với nhóm mới sao cho các cặp (i, j) mới tương thích với giá trị mức độ giống nhau • Lập lại qui trình Một trong những phương pháp đơn giản nhất là phương pháp tính khoảng cách trung bình với giá trị số đại số UPGMA (được viết tắt từ chữ unweighted pair- group method with arithmetic mean) Cách tính bằng tay • Tìm giá trị khoảng cách nhỏ nhất trong ma trận khoảng cách • Xếp nhóm 2 đơn vị mục tiêu (isolate) này lại với nhau, theo giá trị khoảng cách cụ thể, ghi giữa hai điểm • Xây dựng ma trận khoảng cách mới phối hợp giữa hai isolate gần nhất trong một nhóm riêng. Khoảng cách giữa hai nhóm mới này và một isolate khác sẽ được ghi nhận với giá trị khoảng cách trung bình của isolate mới với những isolate trong cluster • Lập lại qui trình cho đến hết. Ch
ng 3. Kt qu - Tho lun NCD LUẬN VĂN THẠC SĨ 38 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ ADN tổng số được tách chiết theo phương pháp mini-CTAB có xử lý với RNAse để loại bỏ ARN theo quy trình của Saghai-Maroof và cs (1997) có cải tiến. Để tiến hành các phản ứng phân tích tính đa dạng di truyền giữa các quần thể mẫu nghiên cứu, mức độ nguyên vẹn của ADN khuôn dùng cho phản ứng nhân bản có vai trò quan trọng. Sự đứt, gãy ADN khuôn có thể gây ra hiện tượng đa hình giả, dẫn đến sự sai lệch trong kết quả phân tích đa hình. Do vậy, tất cả các mẫu ADNts đều được kiểm tra bằng phương pháp điện di như đã mô tả trong phần Phương pháp nghiên cứu ở trên. Để kiểm tra độ tinh sạch của các mẫu ADN thu được, chúng tôi đã tiến hành đo mật độ quang phổ (OD) của tất cả các mẫu. Hai bước sóng được lựa chọn là 260 nm và 280 nm, tương ứng với hai vùng hấp thụ cực đại của ADN sợi đôi và ARN hoặc protein. 3.1.1. Kết quả tách chiết ADNts từ các mẫu thực vật thuộc chi Acanthopanax Từ các mô lá non của tập hợp mẫu thực vật thuộc chi Acanthopanax (gồm 2 loài: Ngũ gia bì gai và Ngũ già bì hương), chúng tôi đã tách chiết thành công ADN tổng số. ADNts đã thu được từ 26 mẫu thực vật này (trong đó 14 mẫu thuộc loài A. trifoliatus và 12 mẫu thuộc loài A. gracilistylus) đều đảm bảo mức độ nguyên vẹn và tinh sạch, đáp ứng được các yêu cầu dành cho việc phân tích tính đa hình di truyền trong những thí nghiệm tiếp theo. 3.1.2. Kết quả tách chiết ADNts từ các mẫu thực vật thuộc chi Illicium Từ tập hợp đầy đủ nhất các mẫu Hồi hương hiện có ở Việt Nam hiện cùng các mẫu Hồi núi thu thập trong nghiên cứu, chúng tôi tiến hành tách chiết ADNts của các mẫu thực vật thuộc chi Illicium từ các bộ phận lá, thân, quả, hạt và chồi non theo phương pháp mini-CTAB có cải tiến. Kết quả chúng tôi thu được ADNts duy nhất từ các chồi non (Hình 6). Các thí nghiệm tách chiết ADNts từ các bộ phận khác của cây đều không đạt yêu cầu do gặp phải khó khăn trong quá trình loại bỏ các tạp Ch
ng 3. Kt qu - Tho lun NCD LUẬN VĂN THẠC SĨ 39 chất. Nhìn chung, dịch chiết ADN mẫu Hồi hương từ các phần mô khác thường có độ nhớt cao. Trong tổng số 56 mẫu thực vật thuộc chi hồi thu thập được chỉ có 50 mẫu cho sản phẩm ADNts đủ độ tinh sạch (đạt tỉ lệ 89,29%) trong đó có 39 mẫu thuộc loài Hồi hương (trừ mẫu IB1) và 11 mẫu thuộc loài Hồi núi (trừ các mẫu N-7, -8, -9, - 13, và -15). 50 mẫu đã tách chiết thành công ADNts kể trên được sử dụng trong những thí nghiệm tiếp theo. 3.1.3. Kết quả tách chiết ADNts từ cây Ba kích (Morinda officinalis How) Khi sử dụng phương pháp mini-CTAB trên mẫu rễ củ và các rễ nhỏ của cây Ba kích, chúng tôi nhận thấy rằng không còn hiện tượng lẫn chất nhầy trong quá trình tách chiết. Chúng tôi quyết định sử dụng phương pháp mini-CTAB có cải tiến trên mẫu vật là rễ nhỏ và rễ củ của cây Ba kích. Kết quả chúng tôi đã thu được ADN tổng số ở 25 mẫu ADN thu thập được với hàm lượng ADN đạt độ tinh sạch cho các nghiên cứu tiếp theo. Khi tách chiết ADN ở các phần mô khác nhau của mẫu rễ, hàm lượng ADN thu được ở các mẫu rễ củ thấp hơn và chỉ đạt được khoảng bằng 1/10 so với hàm lượng ADN từ mẫu rễ nhỏ. Song do số lượng các rễ nhỏ thu nhận được ở các mẫu ít (có mẫu không có) nên chúng tôi sử dụng cả hai phần rễ nhỏ và rễ củ để thu ADN tổng số. Đối với các mẫu rễ củ, chúng tôi tiến hành tách chiết nhiều lần sau đó gộp chung lại để thu được hàm lượng ADN cao hơn đủ cho các phân tích tiếp theo. 3.1.4. Kết quả tách chiết ADNts các mẫu thực vật thuộc chi Panax Chúng tôi đã tách chiết thành công ADNts từ tất cả 34 mẫu thu thập được của ba loài Sâm Việt Nam, Sâm Vũ Diệp và Tam thất hoang. Trong thí nghiệm xác định phần mô tốt nhất để tách chiết ADNts, chúng tôi thu được kết quả là so với thân hay rễ, mô lá là phần cho hiệu suất tách chiết ADN cao nhất trong khi hàm lượng ARN tăng không đáng kể (Hình 6). Do vậy, trong tất cả các thí nghiệm tách chiết ADN tiếp theo, chúng tôi đã quyết định sử dụng mô lá làm vật liệu thực vật. Dưới đây là hình ảnh minh họa ảnh điện di ADN tổng số của một số mẫu dược liệu được thu thập và phân tích trong nghiên cứu này (Hình 7). Tập hợp ADNts thu Ch
ng 3. Kt qu - Tho lun NCD LUẬN VĂN THẠC SĨ 40 được từ các bộ phận mô thích hợp của các mẫu cây dược liệu trong nghiên cứu đều thể hiện độ tinh sạch đủ đáp ứng cho các kỹ thuật phân tích đa hình di truyền tiếp theo. Hình 6. ADNts tách chiết từ các phần mô khác nhau: hình bên trái - ADNts từ các mẫu cây Hồi hương (I); hình bên phải - ADNts từ các phần mô khác nhau ở cây sâm (V). M: thang ADN chuẩn. Nguồn gốc và đặc điểm các mẫu nêu ở Bảng 4. Hình 7. Ảnh điện di ADN tổng số các mẫu dược liệu được thu thập trong nghiên cứu: a) mẫu các loài Ngũ gia bì gai (G) và Ngũ gia bì hương (H); b) mẫu các loài Hồi hương (I) và Hồi núi (N); c) mẫu các loài Ba kích (K); d) mẫu các loài Sâm Việt Nam (S), Sâm Vũ Diệp (V), Tam thất hoang (T) và dạng trung gian Sâm Vũ Diệp-Tam thất hoang (VT). M: thang ADN chuẩn. Nguồn gốc và đặc điểm các mẫu nêu ở Bảng 4. M IB2 IB4 IC1 IC4 IL1 IL4 IQ1 IQ4 N1 N2 N3 N4 N10 N12 N14 N16 M M LT1 LT2 LT3 LR1 LR2 LR3 L1 K1 KT1 KT2 KT3 KR1 KR2 KR3 KR4 M M S1 S5 S10 S14 V1 V3 V5 V7 VT1 VT4 T1 T3 T5 T7 M d c b a Ch
ng 3. Kt qu - Tho lun NCD LUẬN VĂN THẠC SĨ 41 Đã có nhiều quy trình được công bố tách chiết ADN từ thực vật (bao gồm trong đó là các loài dược liệu), tuy nhiên những quy trình này thường không được tiến hành một cách nhất quán ở các loại mô thực vật khác nhau, đó là do những bộ phận mô chứa nhiều các hợp chất thứ sinh như polysaccharide và các hợp chất phenol. Chính những chất này có thể gây ảnh hưởng trực tiếp tới chất lượng cũng như hiệu suất thu axit nucleic (bao gồm ADN và ARN) được tách chiết. Thực chất là các loài khác nhau có xu hướng chứa thành phần các hợp chất thứ cấp khác nhau nên có thể ảnh hưởng đến hiệu suất tách chiết ADN hệ gen. Từ những kết quả trên đây, chúng tôi nhận thấy rằng, quy trình mini-CTAB có cải tiến được áp dụng thành công trong việc tách chiết ADNts từ tất cả các mẫu dược liệu trong nghiên cứu này. Những kết quả thu được từ những thí nghiệm xác định phần mô tốt nhất để tách chiết ADNts ở các loài dược liệu trong nghiên cứu là những kết quả rất có ý nghĩa. Đây là nhữn