Luận văn Phân tích di truyền gen sửa chữa bắt cặp sai MSH2 từ bệnh nhân ung thư đại trực tràng

3p21) với 19 exon có kích thước khoảng 57,36 kb [37]. Hiện nay đã phát hiện được trên 250 đột biến tại gen này. Các đột biến trên MLH1 chiếm 50% các trường hợp đột biến ở HNPCC và gây ra hội chứng HNPCC điển hình. Phân tích di truyền các gen MMR ở người cho thấy rằng trên 90% bệnh nhân mắc HNPCC là do đột biến gen ở hai gen MLH1 và MSH2. Riêng MLH1 có tần số đạt đến 1/400 và MSH2 là 1/500 ở nhiều quần thể [25]. Gen MSH2 nằm ở vai ngắn của NST số 2 (2p21) với 16 exon kích thước khoảng 80,10 kb [37]. Hiện nay đã phát hiện được trên 170 đột biến ở gen này. Các đột biến trên MSH2 chiếm khoảng trên 40% các trường hợp đột biến trong hệ thống MMR và gây ra hội chứng ung thư đại trực tràng dạng HNPCC điển hình. Các đột biến MSH2 liên kết mạnh với các dạng ung thư ngoài ruột kết hơn so với các đột biến ở MLH1[35]. Gen MSH6 nằm trên vai ngắn của NST số 2 (2p15) kích thước khoảng 9,4 kb với 10 exon [37]. Đột biến trong MSH6 có khoảng 7% đến 10% các gia đình có HNPCC. Đột biến dòng mầm của gen MSH6 gây nên một dạng HNPCC không điển hình, đặc trưng bởi độ tuổi được chẩn đoán ung thư và khả năng mắc ung thư nội mạc tử cung cao hơn đột biến ở gen MLH1 và MSH2 [13]. Gen PMS2 nằm trên vai ngắn của NST số 7 (7p22) kích thước khoảng 16 kb với 15 exon [37]. Đột biến ở gen này chiếm khoảng 3% các trường hợp mắc HNPCC, hơn nữa còn liên quan đến sự hình thành hội chứng Turcot - một hội chứng mà các bệnh nhân có nguy cơ cao mắc ung thư não và ung thư trực tràng khi còn khá trẻ [4]. Tất cả các gen trên đều thuộc nhóm gen có khả năng gây đột biến khi xảy ra sai hỏng. Đột biến ở những gen này đều có xu hướng dẫn đến sự tích lũy các sai sót trong sao chép ADN và làm tăng tần số đột biến trong các tế bào (đặc biệt là trong các tế bào sôma) một cách nhanh chóng. Ở nấm men, đột biến về các gen thuộc nhóm MSH có thể được làm tăng từ 100 đến 700 lần so với tốc độ đột biến ở các đoạn lặp 2 nucleotide. Ở người, đột biến gen MSH2 làm tăng tần số sai hỏng trong sao chép ADN khoảng 10 lần [3]. Bảng 4: Tỷ lệ các đột biến thường gặp trong hai gen MLH1 và MSH2 (De la Chapelle A, 2004) [11] Gen Tỷ lệ đột biến thường gặp Tỷ lệ gặp phải trong CRC Các đột biến thay thế nucleotide Các đột biến sắp xếp lại hoặc mất nucleotide MLH1 ~ 50% 90% - 95% 5% - 10% MSH2 ~ 40% 50% - 80% 17% - 50% Không giống như các sai hỏng do các gen điều hòa gây ra hội chứng FAP, sự sai hỏng của các gen gây ra ung thư đai trực tràng không ảnh hưởng trực tiếp đến sự tăng sinh tế bào. Thay vào đó, sự bất hoạt gen MMR gây nên sai hỏng trong sửa chữa ADN, một dạng của tính bất ổn di truyền. Các tế bào mang sai hỏng MMR có tần số đột biến cao hơn các tế bào bình thường và do vậy có khả năng mang các đột biến gây ung thư cao hơn. Các đột biến gen ở hội chứng ung thư đại trực tràng, gây đột biến liên quan đến sửa chữa ADN, qua đó mới gây ra những sai hỏng ở các gen khác. Do vậy, các bệnh nhân mắc ung thư đại trực tràng dạng HNPCC hình thành các polyp lành tính với tỷ lệ tương tự như quần thể bình thường. Tuy nhiên, tỷ lệ đột biến tăng lên do MMR sai hỏng khiến cho một tỷ lệ cao các polyp lành tính này phát triển thành ung thư [4]. HNPCC cho thấy một vai trò rõ rệt đối với việc mất tính ổn định di truyền trong quá trình phát sinh khối u. Sự bất ổn di truyền do thiếu hụt MMR thúc đẩy tốc độ các khối u phát triển thành ung thư. Điều này cũng giải thích tại sao các cá thể bị ảnh hưởng bởi HNPCC bị ung thư từ khi tuổi đời còn khá trẻ. Bảng thống kê dưới đây sẽ cho ta một cái nhìn tổng quát về khả năng mắc một số bệnh ung thư ở người có đột biến gen MMR liên quan đến hội chứng ung thư đại trực tràng đặc biệt là dạng HNPCC. Bảng 5: Nguy cơ mắc một số bệnh ung thư ở người có đột biến gen liên quan đến ung thư đại trực tràng dạng HNPCC so với các cá thể bình thường (Aarnio M 1999) [8] Ung thư Tỷ lệ mắc bệnh của cá thể bình thường Cá thể có liên quan tới HNPCC Tỷ lệ mắc bệnh Độ tuổi trung bình bắt đầu mắc bệnh Đại trực tràng 5.5% 80% 44 Nội mạc tử cung 2.7% 20% - 60% 46 Dạ dày <1% 11% - 19% 56 Buồng trứng 1.6% 9% - 12% 42.5 Tuyến mật <1% 2% - 7% Chưa có báo cáo Đường tiết niệu <1% 4% - 5% ~ 55 Ruột non <1% 1% - 4% 49 Não <1% 1% - 3% ~ 50 Ung thư đại trực tràng dạng HNPCC được nhận biết bằng việc xác định một số lượng lớn thành viên trong gia đình bị ảnh hưởng hoặc dựa vào những sàng lọc di truyền. Tuy nhiên, xét nghiệm di truyền cho thấy rằng, các đột biến gen MMR có độ thâm nhập khá cao trong các cá thể mang ung thư nội mạc tử cung và ung thư đại trực tràng di truyền, hầu hết trong số đó không phải là thành viên của các gia đình có HNPCC. Trong số các bệnh nhân ung thư ở độ tuổi 50 hay trẻ hơn, ít nhất có một người họ hàng bị ung thư, có khoảng 25% là mang các đột biến dòng mầm ở một trong các gen MMR bị đột biến cao, MSH2 hoặc MLH1[26]. 1.3.2. Gen MSH2 và đột biến gây ung thư đại trực tràng Gen MSH2 có vị trí phân tử nằm tại vị trí 21 trên vai ngắn NST số 2 (2p21) (Hình 4) [40]. Nó có kích thước khoảng 80,10 kb. Gen này nằm giữa 2 gen EPCAM và RP11-436K12 (Hình 5) [45]. Toàn bộ cấu trúc gen bao gồm 16 exon với kích thước khác nhau (Hình 6-A) và phân bố không đồng đều trên gen về khoảng cách (Hình 6-B) [38]. Đây cũng là gen quy định tổng hợp một loại protein đóng vai trò quan trọng trong quá trình sửa chữa ADN. Cấu trúc gen gồm 3 domain mã hóa cho 3 phần protein với chức năng các phần khác nhau. Khi ADN sao chép để chuẩn bị cho tế bào phân chia, domain bám ADN (từ exon 1 đến exon 6) của gen MSH2 sẽ quy định tổng hợp một phần protein có chức năng bám vào vị trí bắt cặp nhầm của các đơn nucleotide. Riêng domain tương tác với gen MSH3/MSH6 (từ exon 7 đến exon 12) mã hóa phần protein có vai trò kết hợp với một trong hai loại protein do gen MSH3 và MSH6 để tạo nên một phức hợp protein hoạt động là mutSα (MSH2 – MSH6) hoặc mutSβ (MSH2 – MSH3). Dạng protein phức hợp này sẽ xác định chính xác vị trí xảy ra những sai hỏng trong quá trình sao chép ADN. Cuối cùng, domain tương tác với dạng tương đồng mut L (từ exon 13 đến exon 16) mã hóa phần protein có nhiệm vụ tương tác với dạng tương đồng mutL (Hình 7). Và việc sửa chữa những lỗi sai hỏng sẽ chỉ diễn ra khi có sự tham gia của phức hợp protein MLH1 – PMS2. Vì thế, gen MSH2 được xem là thành phần của tập hợp các gen sửa chữa bắt cặp sai MMR [40]. Khoảng 40% các trường hợp bị hội chứng Lynch với một đột biến được xác định có liên quan đến đột biến gen MSH2. Các dạng đột biến chủ yếu gồm thay thế nucleotide (50 – 80%), mất hoặc sắp xếp lại trình tự các nucleotide (17 – 50%) (Hình 8). Hàng trăm đột biến gen này có khả năng dẫn đến làm cho con người bị ung thư đại trực tràng và các loại ung thư khác liên quan đến HNPCC. Những đột biến này có thể gây ra việc sản xuất một loại protein bất thường hoặc làm cho gen MSH2 bị bất hoạt và không thể thực hiện chức năng bình thường của nó. Khi các protein do gen MSH2 tổng hợp bị thiếu hụt hoặc hoạt động không hiệu quả sẽ dẫn đến những sai hỏng tăng lên đáng kể trong quá trình phân chia tế bào mà không được sửa chữa. Nếu các tế bào này tiếp tục phân chia, các lỗi được tích lũy trong ADN ngày càng nhiều sẽ làm cho các tế bào không thể hoạt động hiệu quả và có thể tạo thành khối u trong ruột kết hoặc một khối u nào đó trong cơ thể [40]. Những người bị đột biến ở gen MSH2 có khả năng làm gia tăng một số khối u hiếm gặp trên da ngoài bệnh ung thư đại trực tràng. Đây là một sự kết hợp gọi là hội chứng Muir – Torre. Những khối u da hiếm gặp này bao gồm u tuyến bã nhờn và ung thư da. Nguyên nhân là do tại các tuyến da (tuyến bã nhờn) sản xuất một chất nhờn gọi là sebum. Chính dạng chất nhờn này đã gây nên các khối u trên da. Các khối u này có thể phát triển nhanh chóng gây ra hiện tượng gai bướu sừng khi tiếp xúc trực tiếp với ánh nắng mặt trời [40]. 1.4. MỘT SỐ KỸ THUẬT DI TRUYỀN SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG Trong nghiên cứu ung thư đại trực tràng, đặc biệt là trong những nghiên cứu đột biến gen MMR cần có sự hỗ trợ của các phương pháp nghiên cứu hiện đại. Tuy nhiên, dù tiến hành theo phương pháp nào cũng đều dựa trên cơ sở nhân bản ADN bằng kỹ thuật PCR. Chính vì thế, việc Kary Mullis phát minh ra kỹ thuật PCR (năm 1985) không những gây được tiếng vang lớn trong lĩnh vực hóa sinh học mà còn “châm ngòi” cho sự bùng nổ của sinh học phân tử đặc biệt là trong mấy thập niên trở lại đây. Việc kết hợp giữa PCR với các kỹ thuật di truyền hiện đại khiến hàng loạt tật bệnh di truyền được phát hiện cũng như phục vụ ngày càng hiệu quả cho từng mục đích nghiên cứu. Chúng tôi xin giới thiệu một số kỹ thuật di truyền thường được sử dụng trong nghiên cứu ung thư đại trực tràng cũng như nghiên cứu một số tật bệnh di truyền khác. 1.4.1. Kỹ thuật phân tích các trình tự lặp lại đơn giản SSR SSR là kỹ thuật dựa trên sự tồn tại của các vi vệ tinh (microsatellite), đó là các trình tự ADN lặp lại trong hệ gen có kích thước rất nhỏ từ 2 đến 6 nucleotide, điển hình là những trình tự chỉ gồm 2 đến 3 nucleotide. Các trình tự này được lặp lại từ 9 đến 30 lần [1]. Sự lặp lại của các vi vệ tinh là ngẫu nhiên, chúng có thể lặp lại hoàn toàn, không hoàn toàn hoặc lặp lại phức tạp. Bên cạnh đó, các vi vệ tinh phân bố một cách rải rác trong hệ gen người, đặc biệt mật độ các vi vệ tinh thường có xu hướng tăng cao đối với những người mắc hội chứng ung thư đại trực tràng di truyền dạng HNPCC. Ở trạng thái này, các vi vệ tinh thể hiện tính bất ổn rõ rệt. Chính sự bất ổn này đã khiến SSR được xem là một trong những phương pháp quan trọng được sử dụng trong nghiên cứu HNPCC. Ưu điểm của kỹ thuật SSR là chính xác và cho hiệu quả cao trong phát hiện đa hình di truyền. Đây cũng là kỹ thuật tương đối đơn giản, dễ thực hiện và ít tốn kém. Tuy nhiên, kỹ thuật này khó nghiên cứu các đột biến gen do các vi vệ tinh thường nằm ngoài gen. Mặt khác, kỹ thuật này có khá nhiều bước tiến hành, cặp mồi sử dụng trong SSR phải được thiết kế đặc hiệu, tương ứng với vùng sườn để có thể nhân các SSR nằm rải rác trong hệ gen [1]. 1.4.2. Kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn RFLP Trong nghiên cứu ung thư đại trực tràng, việc phát hiện ra những sai hỏng của hệ thống các gen MMR là một vấn đề rất quan trọng trong chẩn đoán và điều trị hội chứng này. Chính vì thế, RFLP được sử dụng như một phương pháp nhằm xác định có hiệu quả những biến đổi của phân tử ADN mà cụ thể là những đột biến xảy ra với hệ thống gen MMR. Đây là phương pháp sử dụng một nhóm enzym đặc hiệu gọi là enzym giới hạn. Những enzym này được tổng hợp bởi các loại vi sinh vật khác nhau. Chúng có khả năng nhận biết các vị trí “đích” hay còn gọi là những vị trí giới hạn chứa một trật tự nucleotide đặc thù trong ADN và cắt ADN tại trật tự đó. Kết quả là, một phân tử ADN ban đầu có kích thước lớn sau khi được xử lí bởi enzym giới hạn sẽ bị cắt thành nhiều đoạn nhỏ có kích thước khác nhau. Số lượng và kích thước các đoạn cắt phản ánh sự phân bố của các vị trí bị cắt trong phân tử ADN. Sự hiện diện của những đoạn cắt này mang tính đặc trưng cho từng tổ hợp ADN/enzym giới hạn. Cũng chính sự khác nhau về kích thước bởi các đoạn được tạo ra do xử lí enzym giới hạn đối với các phân tử ADN trong nhân hoặc trong các cơ quan tử khác nhau được gọi là tính đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn [6]. Ưu điểm của phương pháp này là cho độ chính xác cao, đánh giá được tính đa hình di truyền của gen cần nghiên cứu đồng thời xác định được sự có mặt của các đột biến xảy ra trong hệ thống gen MMR gây ung thư đại trực tràng. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp là khó khăn trong việc tìm ra enzym giới hạn đặc hiệu với vị trí cắt và cần phải biết trước trình tự đoạn gen nghiên cứu để xác định vị trí cắt của enzym giới hạn. 1.4.3. Kỹ thuật phân tích đa hình sợi đơn SSCP Năm 1989, Orita và cộng sự đã công bố một phát hiện mới về kỹ thuật phân tích đa hình sợi đơn [24]. Kể từ đó tới nay, kỹ thuật này được xem như một phương pháp hiệu quả trong việc phát hiện tính đa hình sợi đơn của phân tử ADN hay các đột biến có liên quan đến trình tự của phân tử ADN. SSCP ra đời nhanh chóng trở nên phổ biến và được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu thuộc lĩnh vực y học. Kỹ thuật này cho phép phát hiện những sai khác dựa trên khả năng di chuyển khác nhau của các đoạn ADN sợi đơn có cùng kích thước nhưng khác nhau về trình tự. Vì sự chuyển động của ADN trong gel điện di phụ thuộc vào kích thước và cấu hình không gian của chúng. Tuy nhiên, sự chuyển động của các sợi đơn lại bị ảnh hưởng bởi những thay đổi dù là rất nhỏ trong trình tự của chúng mà sự thay đổi này có thể chỉ gồm một nucleotide trong hàng trăm nucleotide có trong sợi đơn đó. Mặt khác, phân tử ADN sợi kép sau khi bị biến tính (tách thành các sợi đơn) sẽ thể hiện tính ổn định không bền. Điều này có nghĩa là giữa các sợi đơn có thể xảy ra phản ứng hồi tính khi gặp sợi bổ sung với nó để hình thành dạng sợi kép như ban đầu. Hoặc cũng có khi trên cùng một sợi đơn cũng xảy ra hiện tượng bắt cặp giữa các trình tự bổ sung với nhau. Kết quả là, chúng bắt cặp với nhau tạo nên các cấu trúc vòng hoặc nếp gấp làm thay đổi hoàn toàn cấu hình không gian của chúng. Chính sự khác biệt về cấu hình không gian và sự khác nhau về trình tự các nucleotide giữa hai sợi đơn sẽ làm chúng di chuyển với tốc độ khác nhau trên cùng một bản gel điện di mặc dù kích thước (số lượng nucleotide) của hai sợi đơn này là như nhau. Ngoài ra, SSCP sử dụng gel điện di là gel polyacrylamide cho nên cho phép phân tách được các băng có sai khác nhỏ chỉ 1 nucleotide. Vì thế, những đột biến dạng thêm, mất 1 nucleotide cũng được phát hiện. Ưu điểm của kỹ thuật này là ít tốn kém về tiền bạc, tiện lợi, dễ tiến hành và cho độ nhạy khá cao trong xác định các đột biến gen. Đặc biệt, khi tiến hành kỹ thuật này với những điều kiện tối ưu, có tới 80 – 90% các đột biến được phát hiện. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là tốn khá nhiều thời gian và các đột biến chỉ được phát hiện tại các gen đơn locus. 1.4.4. Kỹ thuật phân tích sợi đôi dị hợp HET Đây là phương pháp phát hiện đột biến tương đối hiệu quả dựa vào sự sai khác trong độ dịch chuyển của các sợi kép dị hợp so với các sợi kép đồng hợp. Trong phương pháp này, các sợi kép dị hợp được tạo ra bằng cách biến tính hỗn hợp mẫu (bao gồm ADN của người bình thường và ADN của người bị bệnh) rồi để hỗn hợp hồi tính. Tiếp theo, hỗn hợp được nạp lên các giếng đã được tạo sẵn trên bản gel polyacrylamide không biến tính để điện di kiểm tra. Các sợi kép dị hợp sẽ có cấu hình di chuyển khác hoàn toàn với các sợi kép đồng hợp (chúng nằm ở phía trên và tách biệt với các sợi kép đồng hợp ở phía dưới) [42]. Ưu điểm của phương pháp này là chi phí thấp và khá đơn giản về mặt kỹ thuật nhưng hiệu quả phát hiện đột biến thấp hơn SSCP (<80%). 1.4.5. Kỹ thuật điện di gel gradient biến tính DGGE Điện di gel gradient biến tính là phương pháp được mô tả lần đầu tiên bởi Myers và cộng sự (1987) [22]. Trong phương pháp này, người ta sử dụng các điều kiện biến tính như nhiệt độ, hóa chất gây biến tính không hoàn toàn phân tử ADN. Sự gia tăng các điều kiện nhiệt độ hay nồng độ hóa chất xung quanh phân tử ADN không chỉ khiến các phân tử ADN biến tính không hoàn toàn mà còn làm giảm độ di động của chúng trên gel. Kết quả là, chúng dịch chuyển đến các vị trí khác nhau trên bản gel. Tùy thuộc vào kích thước của đoạn ADN điện di (thông thường từ 25 đến vài trăm nucleotide) mà chúng được biến tính ở các điều kiện khác nhau. Ưu điểm của phương pháp này là chi phí thấp, tỷ lệ phát hiện đột biến khoảng 50 – 100%. Tuy nhiên, kỹ thuật này đòi hỏi về máy móc, trang thiết bị, các thao tác phức tạp và tốn khá nhiều thời gian. 1.4.6. Các phương pháp giải trình tự ADN Từ cuối những năm 1970, trình tự các nuleotide trên phân tử ADN được xác định một cách đơn giản và nhanh chóng nhờ sự ra đời của hai phương pháp khác nhau bao gồm phương pháp hóa học và phương pháp enzym. Tuy nhiên, từ những năm cuối của thập kỷ 20 thế kỷ XX, trình tự các nucleotide được xác định trên máy đọc tự động ngày càng phổ biến. Ưu điểm của phương pháp này là giảm thiểu các thao tác, tiết kiệm các hóa chất và trình tự đọc được dài hơn hẳn so với các phương pháp trước đó [2]. Các phương pháp xác định trình tự đều liên quan đến kỹ thuật điện di các đoạn ADN dạng sợi đơn trên gel polyacrylamide. Đặc điểm của những đoạn ADN là có kích thước sai khác nhau chỉ 1 nucleotide. Trên các máy xác định trình tự hiện đại, gel polyacrylamide được nhồi trong các mao quản và các thông số của quá trình điện di như điện thế, nhiệt độ, thời gian cũng như lưu cất dữ liệuđược kiểm soát một cách tự động [2]. 1.5. MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 1.5.1. Mục tiêu nghiên cứu Sử dụng một số kỹ thuật sinh học phân tử (PCR-SSCP và giải trình tự ADN) để phân tích một số trình tự mã hóa (exon) của gen MSH2 từ các bệnh nhân ung thư đại trực tràng. 1.5.2. Nội dung nghiên cứu Đề tài được thực hiện với các nội dung chính bao gồm: 1. Thu thập và bảo quản các mẫu bệnh phẩm (mô ung thư) của 42 bệnh nhân người Việt Nam bị mắc ung thư đại trực tràng và dạ dày cùng 5 mẫu đối chứng. 2. Tách chiết ADN tổng số từ các mẫu sinh phẩm thu được. 3. Nhân bản 09 exon cần quan tâm (gồm các exon 2, 3, 6, 7, 8, 12, 13, 14, 15) bằng các cặp mồi đặc hiệu. 4. Sử dụng kỹ thuật PCR – SSCP để phân tích và xác định đột biến ở các exon nghiên cứu. 5. Giải trình tự một số exon gen MSH2 từ một số mẫu bệnh phẩm. Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM, HÓA CHẤT VÀ THẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu Vật liệu nghiên cứu gồm 42 mẫu mô của 42 bệnh nhân mắc bệnh ung thư đại trực tràng và dạ dày đang được điều trị tại Khoa U bướu Bệnh viện Đại học Y Hà Nội. Riêng 5 mẫu đối chứng được lấy từ người khỏe mạnh, không bị mắc bệnh ung thư và ở độ tuổi trên 50 nhằm đảm bảo yêu cầu khách quan của mẫu đối chứng. 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Di truyền học và phòng Phân tích di truyền thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học Sự sống, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội. 2.1.3. Hóa chất và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu a. Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: - Nhóm hóa chất trong phản ứng PCR: đệm Buffer 10X (+Mg2+), dNTPs, Taq – polymerase, mồi đặc hiệu tương ứng với mỗi exon nghiên cứu. - Nhóm hóa chất điện di: agarose, đệm TAE, ethidium bromide, thang chuẩn ADN. - Nhóm hóa chất SSCP: acrylamide, Bis – acrylamide, formalmide, TEMED, APS. - Nhóm hóa chất nhuộm và một số hóa chất khác: Ethidium bromide, AgNO3, ADN loading dye 6x, Na2CO3, CH3COOH, EDTA, NaOH, ethanol, HNO3 ... Các hóa chất thí nghiệm nêu trên đảm bảo đạt tiêu chuẩn về thời hạn sử dụng cũng như nguồn gốc xuất xứ và chế độ bảo quản theo khuyến cáo của nhà sản xuất. Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: Máy ly tâm lạnh Microfuge®22R, máy Vortex, máy Spin down Bio – rad , máy PCR Gene Amp®PCR System 9700, máy chuẩn pH HORIBA, máy đo OD Thermo Scientific, bể ổn nhiệt Thermomix, cân điện tử Precisa XB220A, tủ lạnh LG, tủ lạnh sâu Sannyo Biomedical Freezer, máy làm đá Fiocchetti Scientific refrigerators, lò vi sóng Samsung, bộ điện di nằm ngang Bio – rad, bộ điện di đứng Bio - rad, máy soi gel UVP, máy chụp ảnh gel Alphal mager MINI, máy khử trùng ALP của Nhật Bản, máy rửa siêu âm Branson 3510, máy sấy Memmert, máy cất nước tự động Sartorius, 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Thu thập và bảo quản mẫu Mẫu mô của 42 bệnh nhân mắc ung thư đại trực tràng, dạ dày và 5 mẫu đối chứng được thu thập, bảo quản trong các ống chuyên dụng ở điều kiện -200C, có đánh số thứ tự và ghi lý lịch mẫu rõ ràng. 2.2.2. Tách ADN tổng số ADN tổng số từ 42 mẫu mô bệnh phẩm và 5 mẫu đối chứng được tách chiết theo quy trình hướng dẫn kèm theo trong bộ Kit tinh sạch ADN tổng số của hãng JMC R & D - Hàn Quốc. 2.2.3. Xác định độ tinh sạch và hàm lượng ADN tổng số Điện di trên gel agarose 0,8% ADN tổng số được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8% pha trong đệm TAE 1X và chạy ở hiệu điện thế 80V. Thang chuẩn ADN được sử dụng là λ/HindIII. Nếu trên bản gel điện di chỉ thấy xuất hiện 1 băng sáng duy nhất có kích thước tương ứng với băng lớn nhất của marker chứng tỏ ADN tổng số đã được tách chiết thành công. Đo mật độ quang phổ hấp thụ Để xác định độ tinh sạch và hàm lượng ADN tổng số thu được, chúng tôi tiến hành đo mật độ quang phổ hấp thụ ở 2 điểm có bước sóng 260nm và 280nm. Nếu tỷ số OD260/280 nằm trong khoảng 1,8 – 2 chứng tỏ ADN là sạch và đủ tiêu chuẩn làm nguyên liệu tiến hành phản ứng PCR. Các mẫu ADN tổng số đạt tiêu chuẩn về độ tinh sạch là các mẫu có giá trị OD260/280 nằm trong khoảng 1,8 – 2. Pha loãng các mẫu ADN với nước khử ion tới nồng độ 100 μg/ml và bảo quản cẩn thận trong tủ lạnh ở nhiệt độ - 200C để phục vụ cho các bước thí nghiệm tiếp theo. 2.2.4. Nhân bản các exon nhờ phản ứng PCR 2.2.4.1. Thiết kế mồi Các cặp mồi đặc hiệu sử dụng trong nhân bản các exon được thiết kế bởi công cụ “Primer blast” của NCBI ( Các exon được nhân bản bao gồm toàn bộ exon và một phần trình tự intron chặn 2 đầu. Chi tiết các cặp mồi thiết kế được trình bày cụ thể trong Bảng 6. Bảng 6: Trình tự các cặp mồi dùng để nhân bản 09 exon quan tâm Tên exon và kích thước (bp) Trình tự mồi (F: Forward – mồi xuôi; R: Reverse – mồi ngược) Sản phẩm PCR (bp) Exon 2 (155) F-5’TGAAGTCCAGCTAATACAGTGC-3’ 345 R-5’GTGTCTCAAACCATTCTACTATCA-3’ Exon 3 (279) F-5’CTTAGGCTTCTCCTGGCAATCTCTC-3’ 281 R-5’TCTCAGTTTCCCCATGTCTCCAGCA-3’ Exon 6 (150) F-5’TGTTCCTCTGTTTTTCATGGCG-3’ 279 R-5’TGGTATAATCATGTGGGTAACTGC-3’ Exon 7 (200) F-5’GTTGAGACTTACGTGCTTAGTTGAT-3’ 351 R-5’TGAGGACAGCACATTGCCAAG-3’ Exon 8 (110) F-5’GTAACTTTGGAGACCTGCTGTACT-3’ 365 R-5’CATCCACTGTCCACAAAGGTGCT-3’ Exon 12 (246) F-5’GGGGGATTAAATGTATTTTTACGGC-3’ 369 R-5’AACGTTACCCCCACAAAGCC-3’ Exon 13 (205) F-5’ATATAATTTGTTTTGTAGGCCCCA-3’ 244 R-5’GGGACTAGGAGATGCACTTACC-3’ Exon 14 (248) F-5’TGTAATTATGTGCTTCAGGTCTGC-3’ 315 R-5’AGTTTCCCATTACCAAGTTCTGA-3’ Exon 15 (176) F-5’TCTCATGCTGTCCCCTCACG-3’ 235 R-5’TGAAAACAAACTGACAAACCTCTCT3’ 2.2.4.2. Tiến hành phản ứng PCR Thành phần cũng như chu trình nhiệt của một phản ứng PCR được thể hiện trong Bảng 7. Bảng 7: Thành phần và chu trình nhiệt cho một phản ứng PCR Thông số các thành phần phản ứng PCR Chu trình nhiệt Thành phần phản ứng PCR Nồng độ ban đầu Thể tích sử dụng (µl) Giai đoạn Nhiệt độ (t0C) Thời gian ADN tổng số ~100ng/µl 4 Biến tính khởi động 94 5 phút Buffer (Mg2+) 10X 4 Biến tính khuôn 94 30 giây dNTPs 2mM 4 Gắn mồi (*) 50 – 58 30 – 45 giây Mồi xuôi (F) 10µg/ml 1.5 Kéo dài chuỗi 72 30 giây Mồi ngược(R) 10µg/ml 1.5 Ổn định 72 5 phút Taq-ADN pol 1u 1.5 Bảo quản 4 ∞ H2O khử ion 33.5 Số chu kỳ 30 Tổng thể tích 50µl (*): Thông số có thể thay đổi tùy exon 2.2.5. Kỹ thuật SSCP trong phân tích đột biến gây ung thư đại trực tràng SSCP là kỹ thuật phân tích đột biến dựa vào tính đa hình trong cấu trúc sợi đơn của phân tử ADN khi chúng có sự biến đổi so với trạng thái bình thường mà chúng thể hiện (Hình 9). Phương pháp này được mô tả lần đầu bởi Orita và cộng sự năm 1989 (xem thêm Mục 1.5.3 đã đề cập ở trên). Tuy nhiên, chúng tôi đã cải tiến một vài điều kiện thí nghiệm như dung dịch biến tính, thời gian và điện thế chạy cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm nhằm nâng cao độ tin cậy cho các kết quả nghiên cứu. Mẫu ADN từ sản phẩm PCR của các exon tương ứng, lấy ra khoảng 3 – 5µl và trộn với 16 – 18µl dung dịch biến tính LIS. Đây thực chất là một loại đệm biến tính có nồng độ ion thấp, chứa 10% sucrose. Sau đó, hỗn hợp này được đem biến tính ở 950C trong khoảng 10 phút và đưa nhanh ra đá lạnh trong 5 phút với mục đích gây sốc nhiệt, tạo điều kiện thuận lợi cho sự biến tính giải phóng sợi đơn của phân tử ADN. Tiếp theo, mẫu đã biến tính được nạp lên các giếng đã được tạo sẵn trên bản gel polyacrylamide không biến tính 12% (PAGE 12%) trong hệ thống điện di và chạy trong khoảng thời gian từ 6 – 18h ở điện thế khoảng 6 – 10V/cm tùy vào kích thước mỗi exon cũng như điện thế dòng điện sử dụng. Tuy nhiên, trong đề tài này, mẫu đã biến tính được chạy điện di qua đêm ở điện thế 7V/cm và PAGE 12% pha với tỷ lệ các thành phần được thể hiện trong Bảng 8 dưới đây. Bảng 8: Tỷ lệ các thành phần của PAGE 12% trong kỹ thuật SSCP Thành phần Nồng độ Acrylamide: Bis-Acrylamide (49:1) 12% TAE 1X Glycerol 5 – 10% Nước Vừa đủ Lưu ý: Khi tiến hành kỹ thuật SSCP ở nhiệt độ phòng cần bổ sung glycerol 10% vào thành phần của gel. Nếu tiến hành trong môi trường nhiệt ổn định 40C thì không nhất thiết phải bổ sung glycerol. Sau khi điện di, cẩn thận gỡ gel ra khỏi bản kính và tiến hành ngay bước nhuộm bạc. Sản phẩm điện di được sử dụng quy trình nhuộm bạc nhanh (khoảng 15 – 20 phút) của Z. W. An và cộng sự [10] với 3 bước cơ bản và thành phần 3 dung dịch nhuộm tương ứng được mô tả trong Bảng 9. Bảng 9: Quy trình nhuộm bạc và thành phần các dung dịch nhuộm Bước 1: Tiến hành khoảng 5 đến 10 phút với dung dịch I Bước 2: Tiến hành khoảng 3 đến 5 phút với dung dịch II Bước 3: Tiến hành khoảng 3 đến 5 phút với dung dịch III Thành phần dung dịch