Luận văn Sàng lọc đột biến gen sửa chữa bắt cặp sai mlh 1 liên quan đến ung thư ruột kết không polyp di truyền ở người Việt Nam

n đoán và tìm hướng điều trị HNPCC. Nhìn chung, các công trình nghiên cứu đó đều được thực hiện bằng những kỹ thuật di truyền dựa trên cơ sở nhân bản ADN bằng kỹ thuật PCR. Những phương pháp thường được dùng có thể kể đến như RT-PCR (Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction), RAPD-PCR (Random Amplified Polymorphic DNA), SSR (Simple Sequence Repeat), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), PCR-RFLP (Restricted Fragment Length Polymorphism), PCR-SSCP (Single Strand Conformation Polymorphisms)... 1.5.1. Kỹ thuật PCR Kỹ thuật PCR được Kary Mullis và các cộng sự phát minh (1985), được sử dụng để khuếch đại một đoạn ADN bất kì khi biết trình tự nucleotit ở hai đầu ADN. Dựa vào trình tự đó, các cặp oligonucleotit được tổng hợp nhân tạo, mỗi oligo tạo liên kết bổ sung với từng sợi đơn. Chúng được sử dụng dùng làm mồi để tổng hợp ADN in vitro nhờ enzym ADN polymeraza [4] Một phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ. Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn: (1) Giai doạn biến tính ADN thành dạng sợi đơn bằng cách nâng nhiệt độ lên 94-950C trong khoảng thời gian ngắn. (2) Giai đoạn bắt cặp: hai đoạn mồi chuyên biệt sẽ gắn với ADN tương đồng ở hai đầu đoạn ADN cần nhân bản theo nguyên tắc bổ sung khi hạ nhiệt độ xuống dưới nhiệt độ Tm tương ứng của các mồi (khoảng 37-650C); (3) Giai đoạn kéo dài chuỗi: phản ứng tổng hợp phân tử ADN kéo dài từ đoạn mồi, thực hiện ở 720C nhằm tránh hiện tượng bắt cặp không đặc hiệu. 1.5.2. Kỹ thuật PCR phiên mã ngược (RT-PCR: Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction) Nguyên tắc của kỹ thuật này giống với kỹ thuật PCR thông thường, tuy nhiên khuôn được sử dụng trong phản ứng là mARN. Và enzym tham gia phản ứng là enzym reverse transcriptaza. Thực chất kỹ thuật PCR ngược gồm hai giai đoạn: giai đoạn một sử dụng enzym phiên mã ngược tạo nên các đoạn cADN mạch kép từ mạch khuôn ARN và giai đoạn hai thực hiện phản ứng PCR chuẩn để nhân đoạn cADN, tạo nên số lượng bản sao ADN cần thiết [4]. Ưu điểm: có thể đánh giá được mức độ hoạt động của hệ gen, phát hiện được các đột biến trong HNPCC. Nhược điểm: thực hiện khá tốn kém, thời gian tồn tại của các mARN thường ngắn, các mARN dễ bị sai hỏng bởi các tác nhân hóa học hoặc nhiệt độ. Các đoạn được nhân dòng là các cADN không chứa intron gây một số hạn chế trong việc nghiên cứu. 1.5.3. Kỹ thuật phân tích các trình tự lăp lại đơn giản (SSR - Simple Sequence Repeat) Kỹ thuật SSR dựa trên sự tồn tại của các vi vệ tinh (microsatellite) là các đoạn ADN lặp lại trong hệ gen, gồm những đơn vị lặp lại từ 2-6 nucleotit, điển hình là những đoạn trình tự gồm 2-3 nucleotit được lặp lại từ 9 đến 30 lần [1]. Các vi vệ tinh là những đoạn lặp lại ngẫu nhiên, ngắn, chúng có thể lặp lại hoàn toàn, lặp lại không hoàn toàn, hoặc lặp lại phức tạp. Các vi vệ tinh nằm rải rác trong toàn bộ hệ gen người. Đặc biệt đối với những người mắc HNPCC thì mật độ các vi vệ tinh thường tăng cao (tính bất ổn vi vệ tinh – MSI). Do đó, kỹ thuật SSR là một trong những phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu HNPCC. Ưu điểm: Kỹ thuật SSR tương đối đơn giản, dễ thực hiện, ít tốn kém và hữu hiệu trong việc phát hiện đa hình di truyền. Nhược điểm: các vi vệ tinh thường nằm ngoài gen nên khó nghiên cứu các đột biến trong gen, kỹ thuật này cần khá nhiều bước tiến hành, cần thiết kế cặp mồi chính xác tương ứng với vùng sườn để nhân các SSR rải rác trong hệ gen [1]. 1.5.4. Kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism) Kỹ thuật RFLP là một kỹ thuật phổ biến được sử dụng trong sinh học phân tử. Sản phẩm PCR sau khi được nhân lên sẽ được tiến hành cắt bằng enzym giới hạn phù hợp thành các đoạn ngắn hơn, dựa vào số lượng và kích thước của các đoạn ADN thu được mà có thể phát hiện ra những sai khác di truyền xuất hiện trong đoạn gen đó. Mỗi một enzym giới hạn có một trình tự nhận biết các bazơ khác nhau, thường là nhận biết 4 hoặc 6 bazơ. Nếu đột biến xảy ra trong đoạn ADN cần nghiên cứu tại vị trí cắt của enzym giới hạn, có thể làm tăng thêm hoặc giảm đi các vị trí cắt, do đó làm thay đổi số lượng cũng như kích thước của các đoạn ADN thu được. Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản, dễ tiến hành, độ chính xác cao, thường được sử dụng trong nghiên cứu sự khác biệt trong cấu trúc bộ gen của các cá thể, các loài sinh vật, nhằm so sánh sự khác nhau giữa các mẫu nghiên cứu, xác định nguồn gốc hoặc kiểm tra mức độ tiến hóa của các loài sinh vật [4]. Nhược điểm lớn nhất của phương pháp là việc tìm kiếm các enzym giới hạn tương ứng với đoạn ADN cần nghiên cứu. Không phải đoạn ADN nào cũng có các vị trí nhận biết của enzym giới hạn. Hoặc nếu có vị trí nhận biết đó, thì chưa chắc các đột biến cần phát hiện đã nằm trong vị trí cắt của enzym. Vì vậy, dù tiến hành cắt bằng enzym thì cũng không dễ phát hiện được các đột biến có trong đoạn ADN đó. Để làm được việc này phải tiến hành cắt với nhiều enzym khác nhau. 1.5.5. Kỹ thuật phân tích đa hình sợi đơn (SSCP: Single Strand Conformation Polymorphism) Kỹ thuật phân tích đa hình sợi đơn do Orita và cộng sự phát minh được giới thiệu lần đầu tiên vào năm 1989 như một phương pháp mới để phát hiện sự đa hình ADN, hoặc sự biến đổi trong trình tự ADN [48]. Kỹ thuật này cho phép phân tích tính đa hình của cấu hình sợi đơn axit nucleic. Đây là một trong những kỹ thuật đơn giản và hiệu quả để phát hiện ra bất cứ một sự thay đổi nhỏ nào trong sản phẩm PCR. Nguyên tắc: Trong điều kiện điện di không biến tính, các mạch đơn ADN sẽ có một cấu hình nhất định tùy theo trình tự của nó. Cấu hình này được xác định bởi các liên kết nội phân tử. Các cấu hình sẽ khác ngay cả khi chỉ khác một nucleotit. Sự khác biệt này dẫn đến sự khác về khả năng di chuyển trong gel polyacrylamide. Gel polyacrylamide được sử dụng để phân tích ADN với hệ thống đệm đặc biệt và không chứa ure. Trong môi trường điện di không biến tính, các thành phần được sử dụng để tổng hợp gel là các đơn phân acylamide, N,N-methylene bisacrylamide (Bis), ammonium persulphate (APS) và N,N,N,N-tetramethylenediamine (TEMED). Sau khi biến tính ADN sợi kép, do tính chất tương đối không ổn định của sợi đơn khi vắng mặt của một sợi bổ sung, các nucleotit trên sợi đơn ADN có thể bắt gặp các trình tự nucleotit bổ sung ngay trên sợi ADN đó. Kết quả là chúng bắt cặp với nhau, tạo ra những vòng hoặc những nếp gấp, tạo nên các cấu hình không gian ba chiều đặc thù [64]. Do cấu hình không gian của sợi đơn và sợi đôi khác nhau nên tốc độ di chuyển của chúng trên gel polyacrylamide không biến tính rất khác nhau. Sợi đơn thường chạy chậm hơn rất nhiều so với sợi đôi (Hình 11). Hơn nữa, sự khác biệt nhau về hình dạng giữa hai sợi đơn với trình tự khác nhau sẽ làm cho chúng di chuyển khác nhau trên cùng một bản gel điện di, mặc dù số lượng nucleotit của chúng như nhau [62, 66]. Hình 11. Kết quả phân tích SSCP exon 5 của gen AR [66] M: marker. 1-6: Sản phẩm PCR exon 5 (285bp). Mũi tên chỉ vị trí đột biến Giống như kỹ thuật phân tích sự đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP), kỹ thuật SSCP cũng phân tích sự thay đổi alen được di truyền, các đặc tính di truyền mà có thể được sử dụng như các dấu chuẩn di truyền. Tuy nhiên, không giống phân tích RFLP, kỹ thuật SSCP có thể phát hiện được sự đa hình ADN và các đột biến ở nhiều vị trí trên đoạn ADN [40]. Như một kỹ thuật rà soát đột biến, tuy nhiên, SSCP thường được sử dụng nhiều hơn để phân tích sự đa hình ở một vị trí đơn, đặc biệt được sử dụng nhiều cho chẩn đoán y khoa [48]. SSCP là một kỹ thuật đơn giản, dễ làm, ít tốn kém, khá chính xác; tuy nhiên, tốn khá nhiều thời gian và đòi hỏi sự khéo léo. Theo Wagner và cộng sự (2002), kích thước của sản phẩm PCR ảnh hưởng đến kết quả phân tích SSCP. Kỹ thuật SSCP cho kết quả tốt nhất khi kích thước ADN nằm trong khoảng 150 – 300 bp (97-99% đột biến được phát hiện), kích thước của sản phẩm PCR càng dài thì thời gian điện di càng lâu và tỷ lệ đột biến được phát hiện càng thấp (67-89% đột biến được phát hiện với sản phẩm ADN > 300bp). Trong khuôn khổ đề tài và điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật RFLP và kỹ thuật SSCP. Đây cũng là hai phương pháp được rất nhiều nhà khoa học trên thế giới sử dụng như: P.V. Cecily và cộng sự (2008), Shin và cộng sự (2004), Han và cộng sự (1995), Han và cộng sự (1998), K. S. Young và cộng sự (2004), H. Zhang và cộng sự (2008) để nghiên cứu đột biến trên gen MLH1 gây ung thư ruột kết không polyp di truyền ở người với kết quả phát hiện đột biến cao; Đặc biệt, kỹ thuật SSCP đòi hỏi chi phí thấp hơn hẳn các kỹ thuật khác rất phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm của chúng tôi nói riêng cũng như điều kiện nghiên cứu tại Việt Nam nói chung. 1.5.6. Phương pháp giải trình tự ADN Giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác định vị trí sắp xếp các nucleotit trong phân tử ADN. Từ những năm 1977, các phương pháp giải trình tự gen đã được phát minh: giải trình tự gen theo phương pháp hóa học (Alan Maxam và Walter Gilbert); Xác định trình tự gen theo phương pháp dideoxy, dựa trên cơ chế tổng hợp ADN trong cơ thể (Frederick Sanger); Giải trình tự gen bằng máy tự động (Automatic DNA sequencer) được thiết kế trên nguyên tắc sử dụng ddNTP do Frederick Sanger và cộng sự phát minh [4]. Tuy nhiên, để có thể tự động hóa, ngày nay người ta dùng các ddNTP có gắn các màu phát quang khác nhau. Nguyên tắc của phương pháp dideoxy dựa trên việc bổ sung các dẫn xuất tương ứng của các dNTP là 2’, 3’ – dideoxynucleotit (viết tắt là ddNTP) vào thành phần phản ứng tổng hợp ADN trong ống nghiệm. Do ddNTP thiếu nhóm C3’- OH nên một khi nó được gắn vào mạch ADN đang tổng hợp thì quá trình tổng hợp sẽ dừng lại. Do đó, thu được một hỗn hợp nhiều phân tử ADN được sao chép không hoàn chỉnh giống nhau ở đầu 5’ được đánh dấu và khác nhau ở đầu 3’ về chiều dài và loại nucleotit kết thúc chuỗi. Sau đó, các sản phẩm này được phân tách trên bản điện di. Phương pháp giải trình tự gen do F. Sanger và cộng sự phát minh có độ chính xác tương đối cao, là cơ sở của các máy giải trình tự gen tự động [4]. 1.6. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài 1.6.1. Mục tiêu nghiên cứu Sàng lọc các đột biến ở một số exon trên gen MLH1 bằng các kĩ thuật PCR-RFLP và PCR-SSCP, góp phần cung cấp dữ liệu về đột biến ở gen này và mở ra hướng nghiên cứu tiếp theo cho các gen MMR khác nhằm ứng dụng trong chẩn đoán sớm ung thư đại trực tràng không polyp di truyền tại Việt Nam. 1.6.2. Nội dung nghiên cứu của đề tài Các nội dung nghiên cứu của đề tài bao gồm: 1. Thu thập các mẫu bệnh phẩm (máu và mô) của các bệnh nhân đã được xác định ung thư đại trực tràng và dạ dày. 2. Nhân bản một số exon quan tâm của gen MLH1 bằng kỹ thuật PCR. 3. Phân tích và xác định các đột biến ở một số exon nghiên cứu bằng SSCP và RFLP. 4. Giải trình tự ADN một số mẫu đã được xác định đột biến bằng sàng lọc ở bước trên. Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng và địa điểm nghiên cứu Mẫu mô và mẫu máu được thu thập từ các bệnh nhân ung thư đại trực tràng, dạ dày đến khám và điều trị tại Bệnh viện K và Bệnh viện Đại học Y Hà Nội. Mẫu đối chứng được lấy từ người không mắc bệnh được cung cấp bởi Bệnh viện Đại học Y Hà Nội. Mẫu máu được chống đông bằng EDTA. Các mẫu được bảo quản trong điều kiện lạnh -200C. Đề tài được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Phân tích di truyền (Trung tâm khoa học Sự sống, Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội) và phòng Sinh học thụ thể và phát triển thuốc (phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein). 2.1.2. Hóa chất Các hóa chất chính được sử dụng trong nghiên cứu gồm: Nhóm hóa chất dùng cho tách ADN tổng số : PBS, proteinase K, phenol, chloroform, isoamyl alcohol, đệm Lysis tách máu, đệm Lysis tách mô; dung dịch NaCH3COO 3M pH 5,2 và pH 4; đệm TE; ethanol 100%, ethanol 70%; RNase. Nhóm hóa chất dùng cho PCR: Taq ADN polymerase, Taq buffer, dNTP, mồi đặc hiệu. Nhóm enzym giới hạn dùng cho phản ứng cắt: MspI, CviQI. Nhóm hóa chất dùng cho điện di gel agarose: agarose, đệm TAE, dye, ethydium bromide. Nhóm hóa chất SSCP: Acrylamide, Bis-Acrylamide, formaldehyde, TEMED, APS. Nhóm hóa chất nhuộm và một số hóa chất khác: AgNO3, ADN loading dye 6X, Na2CO3, CH3COOH , EDTA, NaOH, Ethanol ... Các hóa chất đảm bảo độ tinh sạch sử dụng trong sinh học phân tử và được cung cấp bởi các hãng có uy tín trên thế giới: Fermentas (Lithuania); Promega (Mỹ), Sigma (Mỹ)... 2.1.3. Thiết bị Các loại máy móc thiết bị, dụng cụ chính được sử dụng: ống eppendorf, các loại đầu côn, pipet. Máy li tâm thường, máy li tâm lạnh, máy vortex, máy Spin down, bể ổn nhiệt, cân phân tích, tủ lạnh -200C, tủ hút, máy làm đá, máy PCR AmpGen 9700 (Perkin – Elmet), bộ điện di nhỏ, bộ điện di đứng, máy soi gel, máy chụp ảnh. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Thu thập và bảo quản mẫu Mẫu sinh phẩm được thu thập trong các ống chuyên dụng, đảm bảo không bị nhiễm bẩn, không bị lẫn các mẫu với nhau. Các ống thu thập mẫu máu chứa sẵn EDTA có tác dụng chống đông máu. Mẫu được bảo quản trong điều kiện -200C cho đến khi được sử dụng để tách chiết và phân tích ADN. 2.2.2. Phương pháp tách chiết ADN tổng số 2.2.2.1. Tách ADN tổng số từ máu ADN tổng số được tách từ các mẫu máu theo phương pháp được mô tả bởi Sambrook và cộng sự [45] với một số cải tiến cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm. Các bước tiến hành như sau: 1. Mẫu máu được lấy ra khỏi tủ -200C, để tan trong điều kiện thường, hút bỏ dịch huyết thanh bên trên sau đó đảo trộn kỹ lượng máu còn lại. 2. Thu tế bào: Thêm vào ống eppendorf (1,5ml) 0,7ml máu, bổ sung 0,7 ml PBS 1X. Đảo trộn đều. Ly tâm 6000 v/p trong 15 phút ở nhiệt độ phòng (240C). Hút bỏ dịch pha trên, chỉ giữ lại phần cặn tế bào dưới đáy ống. Lặp lại bước này 3 lần. 3. Phá màng tế bào: Bổ sung 0,6 ml dung dịch Lysis và 6µl proteinase K, đảo đều. Ủ trong ~3h ở 560C bằng bể ổn nhiệt, cho đến khi mẫu tan hết cặn. 4. Loại protein: Bổ sung 0,6 ml phenol, vortex. Ly tâm 12000 v/p trong 15 phút ở 40C. Thu dịch pha trên. Lặp lại với phenol – chloroform – isoamyl alcohol và chloroform – isoamyl alcohol. Lúc này dịch thu được chủ yếu còn lại là ADN. 5. Tủa ADN: Bổ sung NaCH3COO với tỷ lệ 1 NaCH3COO : 10 mẫu và ethanol 100% tỷ lệ 1 mẫu : 2 ethanol, đảo trộn đều. Ủ qua đêm trong tủ -200C. Ly tâm 12000 v/p trong 5 phút ở 40C. Loại dịch pha trên, thu ADN kết tủa dưới đáy ống. 6. Rửa tủa: Bổ sung 0,5 ml ethanol 70%, búng đều lên cả thành ống, ly tâm 12000 v/p trong 5 phút ở 40C. Loại dịch, thu cặn. Lặp lại với 0,2 ml ethanol 70%. Để tủa khô hoàn toàn ở nhiệt độ phòng. 7. Hòa tan tủa: Bổ sung 50 µl đệm TE, búng đều để tủa tan hoàn toàn. Lấy 10µl mẫu, pha loãng 10 lần bằng nước khử ion vô trùng. 8. Loại ARN: Bổ sung 2 µl RNase, ủ ở 370C trong vòng 1h30 phút. Bất hoạt enzym ở 900C trong vòng 30 phút. Bảo quản mẫu trong tủ -200C. 2.2.2.2. Tách ADN từ mô ADN tổng số từ mô được tách chiết theo phương pháp cơ bản được mô tả bởi Sambrook và cộng sự (2001) [45] đã được cải tiến cho phù hợp với điều kiện tách mô. Các bước tiến hành tách chiết như sau : 1. Phá màng tế bào: Cắt nhỏ 0,1g mẫu cho vào ống eppendorf, bổ sung 0,7 ml đệm lysis và 10 µl proteinase K rồi ủ trong 8-10 giờ ở 560C, thỉnh thoảng đảo đều ống cho đến khi mẫu tan hết. 2. Loại protein: Bổ sung 0,6 ml phenol rồi lắc đều hỗn hợp bằng máy vortex. Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 12000 v/p trong 15 phút ở 40C để thu dịch pha trên. Bổ sung hỗn hợp PCI (phenol : chloroform : isoamyl alcohol tỉ lệ thể tích 25 : 24 : 1) tỉ lệ 1 : 1 với thể tích dung dịch thu được. Lắc đều hồn hợp rồi ly tâm 12000 v/p trong 15 phút ở 40C để thu dịch pha trên. Lặp lại một lần nữa với hỗn hợp CI (chloroform : isoamyl alcohol tỉ lệ thể tích 24 : 1) theo tỉ lệ 1 : 1 với thể tích dung dịch thu được. 3. Tủa ADN: Bổ sung natri acetate 3M (tỉ lệ 1 : 10 so với dịch thu được) và ethanol 100% lạnh (tỉ lệ thể tích 1 : 2 hoặc 1 : 2,5) rồi giữ lạnh qua đêm. 4. Thu tủa ADN: Ly tâm ống với tốc độ 12000 v/p trong 15 phút ở 40C để thu tủa ADN, loại dịch pha trên. Sau đó để tủa khô hoàn toàn ở nhiệt độ phòng. 5. Hòa tan tủa: Bổ sung 60 – 80 µl đệm TE, búng đều để tủa tan hoàn toàn. Lấy 10 µl mẫu, pha loãng 10 lần bằng nước khử ion vô trùng. 6. Loại ARN: Bổ sung 2 µl RNase, ủ ở 370C trong vòng 1h30 phút. Bất hoạt enzym ở nhiệt độ 900C trong vòng 30 phút. Bảo quản trong tủ lạnh -200C. 2.2.3. Xác định độ tinh sạch và hàm lượng ADN tổng số 2.2.3.1. Điện di ADN trên gel agarose Điện di ADN là phương pháp phổ biến dùng để phân tách các đoạn axit nucleic có kích thước và cấu hình khác nhau. Dưới tác dụng của điện trường trong môi trường đệm trung hòa hoặc kiềm, các axit nucleic tích điện âm sẽ di chuyển về phía điện cực dương theo nguyên tắc: các phân tử nhỏ sẽ di chuyển nhanh hơn các phân tử lớn, các phân tử có cấu hình cồng kềnh sẽ di chuyển chậm hơn các phân tử nhỏ gọn. Các phân tử này được phát hiện dưới tia UV sau khi nhuộm với ethidium bromide. Chúng tôi tiến hành kiểm tra kết quả tách chiết ADN tổng số bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8% pha trong đệm TAE 1X ở hiệu điện thế 80V. Thang ADN chuẩn sử dụng là λ/ HindIII. Nếu kết quả điện di chỉ cho 1 băng sáng duy nhất, kích thước tương ứng với băng lớn nhất của marker chứng tỏ ADN tổng số đã được tách chiết thành công. 2.2.3.2. Đo mật độ quang phổ hấp thụ Để kiểm tra độ tinh sạch và hàm lượng ADN thu được, chúng tôi tiến hành xác định chất lượng của sản phẩm ADN bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ. Giá trị mật độ quang của các mẫu ADN cho phép xác định nồng độ của ADN trong dung dịch. Protein có phổ hấp thụ cao nhất ở bước sóng 280 nm, đồng thời hấp thụ ở bước sóng 260 nm. Do đó, tỉ lệ A260/A280 biểu thị mức độ protein còn sót trong dịch chiết. ADN được coi là sạch khi giá trị A260/A280 = 1,8 - 2,0 [4]. Với các mẫu đạt yêu cầu có chỉ số OD từ 1,8 – 2,0 và nồng độ ADN dao động từ 50 đến 500 µg/ml được pha loãng tới nồng độ 100 μg/ml để dùng làm khuôn cho phản ứng PCR 2.2.4. Kỹ thuật PCR 2.2.4.1. Các thành phần của phản ứng PCR Bảng 6. Các thành phần phản ứng PCR Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích Khuôn ADN 100 μg/ml 5 μl dNTP 2mM 2 μl Tag buffer ( + Mg2+) 10X 1 μl Tag polymerase 1u 1,5 μl Mồi xuôi 10 pg/μl 1 μl Mồi ngược 10 pg/ μl 1 μl Nước khử ion 13,5 μl Tổng thể tích 25 μl Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 1,2%, chạy bằng đệm TAE 1X, hiệu điện thế 60V, thang chuẩn 100 bp. 2.2.4.2. Thiết kế các cặp mồi đặc hiệu Dựa trên trình tự nucleotit của mỗi exon, chúng tôi sử dụng công cụ “Primer Blast’’/ NCBI để thiết kế các cặp mồi đặc hiệu [63]. Trình tự các cặp mồi được thể hiện ở Bảng 7. Bảng 7. Trình tự mồi tương ứng của các exon 8, 13, 14, 16, 17, 18, 19 của gen MLH1 Exon Trình tự mồi Sản phẩm 8 Mồi xuôi CTC AGC CAT GAG ACA ATA AAT CC ~260 bp Mồi ngược AAT GTG ATG GAA TGA TAA ACC 13 Mồi xuôi TGC ACC CCA CAA AAT TTG GC ~300 bp Mồi ngược CTT TCT CCA TTT CCA AAA CC 14 Mồi xuôi GTT GGT AGG ATT CTA TTA CT ~260 bp Mồi ngược ACC ATT GTT CTA GTA GCT CT 16 Mồi xuôi GAT GCT CCG TTA AAG CTT ~280 bp Mồi ngược ACC GCA CCC GGC TGG CAA 17 Mồi xuôi GGA AAG GCA CTG GAG AAA TGG G ~240 bp Mồi ngược AGC ACA CAT GCA TGT ACC GAA AT 18 Mồi xuôi GTA GTC TGT GAT CTC CGT TT ~280 bp Mồi ngược ATG TAT GAG GTC CTG TCC TA 19 Mồi xuôi CAA ACA GGG AGG CTT ATG A ~409 bp Mồi ngược AAA TAA GAA ATT ATG TTA AGA CAC ATC 2.2.5. Phân tích đa hình sợi đơn (SSCP - Single Strand Conformation Polymorphism) Các sản phẩm PCR thu được có kết quả tốt được sử dụng để tiến hành phân tích đa hình sợi đơn bằng PAGE không biến tính 12% dựa trên phương pháp của Orita và cộng sự năm 1989 [40] (Bảng 8). Bảng 8. Thành phần PAGE 12% cho 10ml dung dịch Thành phần Thể tích 50% Acrylamide – Bis Acrylamide (tỉ lệ 49 : 1 ) 2,4 ml 10X TBE 0,5 ml Glycerol 1 ml H2O 6,1 ml Xử lý biến tính mẫu: 4µl sản phẩm PCR được bổ sung thêm 12µl formamide, biến tính bằng nhiệt ở 950C trong 10 phút sau đó đưa nhanh ra đá lạnh gây sốc nhiệt. Mẫu đã qua xử lý được dùng để chạy điện di SSCP với PAGE 12% ở hiệu điện thế 90V trong 5-7 giờ. Bản gel sau khi chạy SSCP xong được xử lý bằng phương pháp nhuộm bạc của Z. W. An và cộng sự [9]. Bước 1: Cố định gel 5-10 phút trong dung dịch gồm: 11ml EtOH 95% Loại bỏ dung dịch I và rửa sạch dung dịch cố định bằng nước cất 3 ml HNO3 65% 0,2g AgNO3 Dẫn nước tới 200 ml Bước 2: Nhuộm bản gel đến khi hiện rõ băng trong dung dịch gồm: Loại bỏ dung dịch II và rửa sạch bằng nước cất 25ml NaOH 6M 3,5g Na2CO3 2,4ml HCHO 30% Dẫn nước tới 200 ml Bước 3: Xử lý gel với dung dịch III trong 5 phút gồm : Loại bỏ dung dịch II và bổ sung thêm nước cất Ethanol 95% : 5,5 ml HNO3  65% : 1,54 ml Bước 4: Soi gel trên máy UV vis 2.2.6. Phản ứng cắt bằng enzym giới hạn Chúng tôi tiến hành phản ứng cắt với 3 exon 16, 18 và 19 bằng enzym giới hạn. Đây là 3 exon đã được các nhà khoa học trên thế giới như Nakamura và cộng sự (1998), K.S.Young và cộng sự (2004), H. Zang và cộng sự (2008) nghiên cứu và phát hiện được đột biến trên các exon này bằng kỹ thuật PCR-RLFP. Thành phần tham gia phản ứng cắt được trình bày trong Bảng 9. Bảng 9. Thành phần tham gia phản ứng cắt exon 16, 18 và 19 gen MLH1 Thành phần phản ứng Exon 16 Exon 18 và exon 19 Enzym MspI 1 μl RsaI (CviQI) 1 μl Sản phẩm PCR 5 - 8 μl 5 – 8 μl Buffer Buffer Tango 2 μl Buffer B 2 μl Nước khử ion 6 - 9 μl 6 - 9 μl Tổng thể tích 17 μl 17 μl Exon 16: Ủ enzym ở 370C trong 14 – 16 giờ. Bất hoạt ở 800C trong vòng 20 phút. Exon 18 và exon 19: Ủ enzym ở 370C trong 14 – 16 giờ. Bất hoạt ở 650C trong vòng 20 phút. Tùy vào độ sáng của băng điện di mà chúng tôi bổ sung lượng tương ứng với thành phần cắt từ 5 – 8 μl sản phẩm PCR để đảm bảo quá trình cắt diễn ra hoàn toàn. Sản phẩm cắt được điện di kiểm tra trên gel agarose 3% trong đệm TAE 1X ở 80V và gel polyacrylamyde 12%, trong đệm TAE 0,5X ở 120V. 2.2.7. Giải trình tự gen Các mẫu thể hiện mô hình phân tích băng trên bản điện di sai khác so với đối chứng được chúng tôi gửi sang Hàn Quốc để giải trình tự (hãng Bioneer). Kết quả phân tích trình tự được xử lý bằng phần mềm BioEdit. Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tách chiết ADN tổng số Để tiến hành sàng lọc đột biến gen sửa chữa bắt cặp sai MLH1 gây ung thư ruột kết ở người, bước đầu tiên chúng tôi tiến hành tách chiết ADN tổng số từ các mẫu máu (20 mẫu) và mẫu mô (38 mẫu) tương ứng theo phương pháp của Sambrook và cộng sự (2001) [45] có cải tiến cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm; một số mẫu mô khác (12 mẫu) được tách chiết bằng kit tách ADN từ mô theo hướng dẫn của hãng R & D (Hàn Quốc). Sau đó, ADN tổng số được điện di trên gel agarose 0,8%, kết quả được thể hiện trên Hình 12. (A) (B) Hình 12. (A) Kết quả tách ADN tổng số từ mẫu mô. (B) Kết quả tách ADN tổng số từ mẫu máu M: marker λ/ Hind III. T30-T38: ADN tổng số tách từ mô bệnh phẩm người số 1-8. B13-B20: ADN tổng số tách từ mẫu máu bệnh phẩm người số 1-8 Mức độ đứt gãy của ADN tổng số sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến phản ứng PCR sau này. Kết quả điện di cho thấy, ADN tổng số được tách chiết từ các mẫu khác nhau đều chỉ cho 1 băng duy nhất, đậm nét với kích thước xấp xỉ băng 23,1 kb của thang chuẩn λ/ Hind III. Chất lượng ADN từ các mẫu khác nhau tương đối đồng đều và ổn định thể hiện qua các băng điện di có độ sáng cao, băng gọn, không bị đứt gãy và lẫn rất ít ARN. Các mẫu ADN tổng số đảm bảo yêu cầu chất lượng cho các thí nghiệm tiếp theo. Sau khi tách chiết ADN tổng số thành công, chúng tôi tiến hành xác định chất lượng của sản phẩm ADN bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ. Kết quả đo mật độ quang phổ hấp thụ cho thấy các mẫu ADN chúng tôi tách chiết được đều có giá trị A260/A280 ≈ 1,8 - 2,0 và nồng độ ADN dao động từ 50 đến 500 µg/ml đảm bảo yêu cầu dùng làm khuôn cho phản ứng PCR. 3.2. Phản ứng PCR Với các mẫu ADN tổng số đạt yêu cầu, chúng tôi tiến hành pha loãng về nồng độ 100 µg/ml và sử dụng làm khuôn để tiến hành phản ứng PCR, nhằm nhân bản 7 exon quan tâm trên gen MLH1: exon 8, exon 13, exon 14, exon 16, exon 17, exon 18 và exon 19. Phương pháp PCR đơn giản và dễ thực hiện, song để thu được kết quả tốt, cần phải có sự tối ưu các thành phần tham gia phản ứng, chu trình nhiệt, sự ổn định của các điều kiện thí nghiệm cũng như trang thiết bị chuyên dụng. 3.2.1. Kết quả tối ưu phản ứng PCR Đối với kỹ thuật PCR, thiết lập được một chu trình nhiệt là một yếu tố quan trọng, đảm bảo cho sự giãn xoắn của phân tử ADN cũng như việc gắn mồi và kéo dài chuỗi trong mỗi chu kỳ. Sự thay đổi yếu tố nào đó trong chu trình nhiệt có thể sẽ thu được sản phẩm PCR không như mong muốn. Trên cơ sở những nhận định đó, để thu được kết quả PCR tốt nhất, chúng tôi tiến hành tối ưu hóa các phản ứng PCR với mẫu T5 có kết quả đo OD (A260/280 = 1,92) với các nhiệt độ gắn mồi khác nhau để tìm ra vùng nhiệt độ gắn mồi tốt nhất. Dãy các nhiệt độ lựa chọn tùy thuộc vào Tm mồi của mỗi exon. Từ những kết quả thu được, chúng tôi tiếp tục thử nghiệm với các mẫu có độ tinh sạch khác nhau, đại diện cho cả nhóm mẫu. Nếu các băng ADN thu được khi điện di kiểm tra lên đặc hiệu, gọn, rõ nét, đún