Luận văn Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích đa dạng và định danh loài ở tập đoàn cây dó bầu (Aquilaria sp.) tại Hà Tĩnh

biến thiên để phân biệt giữa các loài nhưng cũng phải không khác nhau quá mức giữa các cá thể trong cùng loài. - Thứ hai, hệ thống định danh bằng DNA phải được chuẩn hóa, với cùng một vùng DNA có thể được sử dụng cho các nhóm phân loại khác nhau. - Thứ ba, đoạn DNA chỉ thị cần chứa đủ thông tin phát sinh loài để có thể dễ dàng định danh loài vào các nhóm phân loại (chi, họ,). - Thứ tư, có khả năng áp dụng với các mẫu vật thô, với vị trí cặp mồi nhân gen có độ bảo thủ cao, dễ dàng thực hiện phản ứng khuếch đại và đọc trình tự DNA - Đoạn DNA nghiên cứu nên có kích thước ngắn để quá trình nhân bản DNA không bị sai lệch. Thông thường, đoạn DNA nghiên cứu có kích thước 150 bp trở lại, nếu dài hơn sẽ dễ bị sai lầm trong quá trình nhân bản DNA. 1.4. Một số locus được sử dụng trong phương pháp DNA barcode ở thực vật 1.4.1. Trình tự gen nhân Các trình tự barcode được nhân bản từ DNA hệ gen của bố mẹ dự kiến sẽ cung cấp nhiều hơn thông tin về các loài cần xác định. Tuy nhiên khó khăn trong việc khuếch đại PCR từ gen nhân vì gen nhân chủ yếu là đơn gen hoặc có bản sao gen thấp, đặc biệt từ sự suy thoái và chất lượng DNA genome và khả năng phân biệt dưới loài do bảo toàn gen chức năng có thể chính là lý do tại sao hạn chế số lượng các gen nhân được thử nghiệm trong xác định loài bằng phương pháp DNA barcode [36], [39]. 1.4.2. Vùng gen mã hóa ribosome Gen rDNA là hệ thống đa gen mã hóa phần RNA của ribosome. Các gen DNA ribosome (rDNA) mang trình tự vừa có tính bảo thủ vừa có tính đa dạng thích hợp để phân biệt các loài gần gũi. Trong tế bào, rDNA được sắp xếp như các đơn vị được lặp lại ngẫu nhiên bao gồm DNA mã hóa ribosome 18S, 5,8S, 28S và xen giữa các trình tự không mã hóa ITS1, ITS2 (internal transcribed spacers) nằm ở hai bên sườn của vùng 5,8S. Vùng mã hóa của ba gen rDNA được bảo tồn cao hơn hai vùng ITS. Nhìn chung các đơn vị rDNA được lặp lại hàng nghìn lần và được sắp xếp tập trung tại vùng lớn trên nhiễm sắc thể. Một trong những tính năng đáng chú ý nhất của rDNA là từng đơn vị trong hệ thống đa gen không tiến hoá độc lập, thay vào đó tất cả các đơn vị tiến hoá một cách phối hợp nhờ vậy mà rDNA đạt mức ổn định cao hơn trong loài nhưng khác biệt giữa các loài khác nhau. Hiện tại, nrITS vùng ITS của gen nhân được xem là một trong những công cụ hữu ích nhất để đánh giá phát sinh loài ở cả thực vật và động vật vì nó phổ biến trong tự nhiên, kế thừa từ bố mẹ và biến đổi cao do ít hạn chế chức năng. Một số nghiên cứu gần đây ở cây sinh sản hữu tính và cây sinh sản vô tính cho thấy một số mức độ biến đổi số các bản sao của trình tự ITS1 và ITS2 do nhiều nguyên nhân như lai gần, phân ly, tái tổ hợp, tỷ lệ đột biến cao và hình thành gen giả của các gen chức năng dẫn đến những thay đổi đó. Trên cơ sở này nrDNA có thể được sử dụng để phân định chính xác và hiệu quả thực vật trong cùng loài với đặc điểm lịch sử đời sống khác nhau (một năm, lâu năm, trên cạn, dưới nước) và nguồn gốc tiến hóa khác nhau [36], [39] [40]. 1.4.3. Trình tự gen luc lạp Hệ gen lục lạp của thực vật gồm phân tử DNA mạch vòng có kích thước 120 - 160 kb chia làm hai bản sao đơn là bản sao đơn lớn (large single-copy region) và bản sao đơn nhỏ (small single-copy region). Hai bản sao được phân cách bởi hai chuỗi lặp lại đảo nhau (IRa và IRb) có độ dài trung bình 20 - 30 kb. Hệ gen lục lạp chứa tất cả các gen rRNA (4 gen ở thực vật bậc cao), các gen tRNA (35 gen) và các gen khác mã hóa cho các protein tổng hợp trong lục lạp (khoảng 100 gen) cần thiết cho sự tồn tại của chúng. Bảng 1.1. Thông tin của một số mồi DNA Barcode thiết kế cho hệ gen lục lạp Mồi Trình tự 5’→3’ rbcL a-f a-r ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC CTTCTGCTACAAATAAGAATCGATCTC → ← matK matK 1F matK 1R matK 2F matK 2R GAACTCGTCGGATGGAGTG GAGAAATCTTTTTCATTACTACAGTG CGTACTTTTATGTTTACAGGCTAA TAAACGATCCTCTCATTCACGA → ← → ← rpoB rpoB 1 rpoB 2 rpoB 3 rpoB 4 AAGTGCATTGTTGGAACTGG ATGCAACGTCAAGCAGTTCC CCGTATGTGAAAAGAAGTATA GATCCCAGCATCACAATTCC → → ← ← rpoC1 rpoC1 1 rpoC1 2 rpoC1 3 rpoC1 4 GTGGATACACTTCTTGATAATGG GGCAAAGAGGGAAGATTTCG TGAGAAAACATAAGTAAACGGGC CCATAAGCATATCTTGAGTTGG → → ← ← ycf5 (ccsA) ycf5 1 ycf5 2 ycf5 3 ycf5 4 GGATTATTAGTCACTCGTTGG ACTTTAGAGCATATATTAACTC ACTTACGTGCATCATTAACCA CCCAATACCATCATACTTAC → → ← trnH - psbA trnH2 psbAF trnH(GUG) psb A CGCGCATGGTGGATTCACAATCC GTTATGCATGAAAGTAATGCTC ACTGCCTTGATCCACTTGGC CGAAGCTCCATCTACAAATGG → ← → ← trnL-F trnL-c trnL-d trnL-e CGAAATCGGTAGACGCTACG GGGGATAGAGGGACTTGAAC GGTTCAAGTCCCTCTTATCCC → ← → trnL-f trnL-g trnL-h ATTTGAACTGGTGACACGAG3’ GGGCAATCCTGAGCCAA CCATTGAGTCTCTGCACCTATC ← → ← →: mồi xuôi; ←: mồi ngược Hệ gen lục lạp có tính bảo thủ cao và mang tính đặc thù của từng loài do vậy việc sử dụng các kết quả phân tích hệ gen lục lạp vào nghiên cứu phát sinh loài và phân loại thực vật được các nhà khoa học rất quan tâm. Dựa trên những thông tin có sẵn từ các nghiên cứu về phát sinh loài và các nghiên cứu gần đây, một số locus là đoạn gen hay các gen được chọn để nghiên cứu làm chỉ thị barcode tiềm năng cho các loài thực vật trên trái đất. Có khoảng 20 gen lục lạp có độ dài phù hợp (khoảng 1 kb) được sử dụng trong nghiên cứu phát sinh loài. Các gen này chứa đựng nhiều mức độ tiến hoá và vì vậy phù hợp cho nhiều mức độ phân loại [36], [38], [35]. Các locus khác nhau đã được đề xuất về điều tra nhóm, mồi thích hợp cho các gen này được trình bày trong bảng 1.1. 1.4.4. Trình tự gen rbcL Trong các gen lạp thể, rbcL là trình tự gen đặc trưng nhất, mã hóa các tiểu đơn vị lớn của rubilose - 1,5 - bisphosphate cacboxylase/ oxygenase (RUBISCO). rbcL là gen đầu tiên được giải trình từ thực vật. rbcL đã được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu phát sinh loài và phân loại thực vật với hơn 10000 trình tự rbcL có sẵn trong GenBank. Do sự dễ dàng trong khuếch đại PCR ở một số nhóm thực vật, CBOL gần đây đã công nhận rbcL là một trong những trình tự gen tiềm năng nhất cho các nghiên cứu DNA barcode ở thực vật. Tuy nhiên, do khả năng phân biệt loài thấp, nên hầu hết các nhóm đều cho rằng nên sử dụng kết hợp rbcL với các với các chỉ thị barcode khác, ví dụ như matK là hai locus barcode chuẩn cho thực vật [36], [37], [39]. 1.4.5. Trình tự gen matK Trong số các gen lục lạp, matK là một trong những gen tiến hoá nhanh nhất, có kích thước khoảng 1550 bp và mã hóa cho enzyme maturase liên quan đến quá trình loại bỏ các intron loại 2 trong quá trình phiên mã RNA. Do matK tiến hoá nhanh và có mặt hầu hết trong thực vật nên đã được sử dụng như một chỉ thị trong nghiên cứu mối quan hệ giữa các loài và phát sinh loài ở thực vật. CBOL đã thử nghiệm matK trên gần 550 loài thực vật và thấy rằng 90% mẫu thực vật hạt kín dễ dàng khuếch đại trình tự bằng cách sử dụng một cặp mồi đơn và đề nghị sử dụng matK là một trong những locus barcode chuẩn cho thực vật [36], [40]. 1.4.6. Trình tự gen rpoB và rpoC1 Gen rpoB, rpoC1, rpoC2 mã hóa ba trong 4 tiểu đơn vị của RNA polymerase lục lạp. Khi nghiên cứu họ Dipterocarpaceae, Tsumura và đtg (1996) đã nhận thấy gen rpoB là thích hợp để nghiên cứu phát sinh loài. Hiện nay rpoB là gen được sử dụng nhiều trong nghiên cứu phát sinh loài và xác định các loài vi khuẩn, đặc biệt là khi nghiên cứu các chủng có quan hệ gần gũi. Cùng với gen 16S rRNA, rpoB được sử dụng trong nhiều nghiên cứu để xác định loài vi khuẩn mới, do vậy các gen này được đề xuất là chỉ thị barcode độc lập hoặc kết hợp với một số gen khác. Trong các nghiên cứu gần đây, CBOL đã thử nghiệm 7 locus và thấy rằng khả năng phân biệt loài cuả đoạn gen rpoC1 là thấp nhất (43%). Mặc dù vậy, trong nghiên cứu Liu và đtg (2010) đã chỉ ra rpoC1 là một chỉ thị rất hữu ích khi được sử dụng để phân biệt các loài bryophytes. Do vậy cần có các nghiên cứu tiếp theo để chứng minh sự phù hợp khi sử dụng rpoB và rpoC1 làm chỉ thị barcode trong các nghiên cứu giám định loài [36], [38]. 1.4.7. Trình tự gen ycf5 ycf5 mã hóa cho một protein có chứa 330 amino acids. Gen này được bảo tồn trên tất cả các vùng thực vật và đã được kiểm nghiệm cho phù hợp với DNA barcode của một vài nhóm. Tuy nhiên, gen này chưa được công nhận và sử dụng nhiều trong vai trò của một DNA barcode [36], [35]. 1.4.8. Trình tự hai gen trnH-psbA Gen trnH-psbA có kích thước trung bình khoảng 450 bp, nhưng thay đổi từ 296 đến 1120 bp, trnH-psbA được chứng minh là có khả năng xác định loài cao. Locus trnH-psbA đã được khuếch đại thành công ở nhiều thực vật hạt kín và hạt trần. Tuy nhiên, trong nhiều thực vật hạt kín trnH-psbA lại có kích thước rất ngắn (~ 300 bp), kích thước của gen này thay đổi lớn do sự có mặt của gen rpS19 hoặc các gen giả nằm giữa cùng gen của hai gen trnH và psbA. Trong nhiều nghiên cứu gần đây đã đề xuất việc sử dụng trnH-psbA như chỉ thị barcode độc lập cho thực vật hay kết hợp với matK. CBOL thấy rằng khả năng phân biệt loài của trnH-psbA là cao nhất (69%) trong số 7 locus được thử nghiệm và do đó đề nghị nó như là chỉ thị barode bổ sung. trnH-psbA có thể sử dụng trong hệ thống barcode ba locus khi hệ thống barcode hai locus không cung cấp đầy đủ khả năng phân tích [36], [28]. 1.4.9. Trình tự hai gen trnL(UAA)-trnF(GAA) Locus trnL (UAA) - trnF (FAA) chứa gen trnL (UAA), vùng intron và vùng nằm giữa hai gen trnL (UAA) và trnF (GAA). Taberlet và đtg là nhóm nghiên cứu đầu tiên sử dụng trnL trong các nghiên cứu hệ thống học thực vật. Vùng không mã hoá trnL(UAA) và trnF (GAA) không phải là vùng có sự biến đổi lớn nhất của DNA lục lạp nhưng có ưu thế như cấu trúc bậc 2 với vùng biến đổi và vùng bảo thủ xen kẽ nhau. Điều này tạo thuận lợi cho các nghiên cứu tìm kiếm trình tự nucleotide ở các vùng bảo thủ để thiết kế mồi và sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại các đoạn gen ở vùng biến đổi. Trong nghiên cứu để xác định trnL (UAA) intron có nên được sử dụng làm vùng DNA barcode, Taberlet (2007) đã sử dụng 100 loài thực vật và kết luận rằng trnL intron có thể sử dụng như là một barcode của thực vật, trnL-trnF là một barcode tiềm năng cho phân tích, xác định các loài thực vật [29], [36], [40]. 1.5. Tình hình nghiên cứu DNA barcode ở thực vật Trọng tâm nghiên cứu barcode ở thực vật chủ yếu là về đánh giá hiệu quả tương đối của của các đoạn gen chỉ thị đã được sử dụng trong nghiên cứu phát sinh loài. Đối với thực vật, quá trình tìm kiếm một chỉ thị DNA chung cho các loài thực vật gặp nhiều khó khăn. Hệ gen ty thể ở thực vật thường quá bảo thủ nên không được dùng cho chỉ thị DNA, trong khi đó hệ gen lục lạp lại mang nhiều đặc điểm mong muốn đối với chỉ thị DNA như ở hệ gen ty thể ở động vật. Ở hệ gen nhân, vùng DNA nằm giữa các gen hay còn gọi ITS (Internal Transcribed Spacer) cũng được sử dụng làm DNA chỉ thị trong một số nghiên cứu [12], [26], [35]. Mặc dù một vài locus trong hệ gen lục lạp và gen nhân đã được nghiên cứu làm chỉ thị trong nghiên cứu DNA barcode song kết quả thu được vẫn có những hạn chế. Điều này cho thấy việc cần thiết sử dụng kết hợp các locus để bổ sung cho nhau đem lại hiệu quả cao hơn trong đánh giá, phân loại các loài thực vật. Trên thực tế từ lâu rbcL đã được sử dụng trong nghiên cứu phát sinh loài, bên cạnh đó trình tự gen matK có tỷ lệ tiến hóa cao nhất trong các gen lạp thể cũng có khả năng phân biệt loài cao. Trên cơ sở đó CBOL đã kết hợp hai locus của rbcL và matK mang lại hiệu quả cao (70% sự phân biệt loài) và giảm nhiều chi phí cho các điều tra về xây dựng mối quan hệ cũng như phân loại đánh giá các loài thực vật. Hiệu quả kết hợp giữa hai gen này thích hợp cho các nghiên cứu như là điều tra tương tác thực vật - động vật, xác định các loài cây được bảo vệ, các cuộc khảo sát đa dạng sinh học quy mô lớn và phân biệt cây giống trong các chương trình tái sinh rừng phân biệt và cho mục đích xác định loài và phân loại [36]. Spooner sau khi xem xét hiệu quả của psbA - trnH, matK, nrITS trên 63 loài khoai tây dại đã chỉ ra rằng trình tự của psbA - trnH, matK và nrITS không cung cấp đầy đủ các thông tin về loài cụ thể. Gen lạp thể không cho thấy đầy đủ sự khác biệt, trong khi các trình tự nrITS cho thấy sự khác biệt trong loài cao. Những khó khăn đó cũng gặp phải trong chi Magnolioideae, họ Magnoliaceae và trong họ Lauraceae khi giải thích những mối quan hệ trong loài. Từ những nghiên cứu cụ thể trên ba nhóm thực vật khác nhau, thực vật hạt kín, hạt trần và rêu các nhà phân loại kết luận rằng việc kết hợp các locus hệ gen lạp thể như rbcL + rpoC1 + matK + trnH-psbA mang lại hiệu quả cao như một hệ thống barcode duy nhất cho xác định các nhóm loài rộng. Vì vậy, trong các dự án như giám định loài sử dụng các chỉ thị barcode, việc đề xuất barcode hai locus tiêu chuẩn là không đủ do sự phân ly trong loài và quần thể ở nhiều thực vật hạt kín là rất lớn. Đặc biệt trong cùng khu vực phân bố trải qua giao phối và giao phối cận huyết, sự thay đổi của một hoặc hai trình tự gen lạp thể không đủ để đánh dấu ranh giới loài. Các vấn đề sinh học như đa bôi thể, dị bội, sinh sản vô tính, chuyển gen, chọn dòng, phân ly và tiến hóa nhanh hình thái học dẫn đến sự khó khăn trong xác định loài. Do vậy không thể sử dụng cùng một vùng DNA để xác định cho các loài khác nhau mà cần lựa chọn các vùng DNA khác nhau cho xác định ở các loài khác nhau [37], [38]. Hiện nay hệ thống DNA barcode cho thực vật chưa hoàn chỉnh. Tuy nhiên với các trình tự DNA barcode này, các nhà khoa học đã có những nghiên cứu, ứng dụng đầy hứa hẹn cho xác định loài ở thực vật, mở ra một triển vọng mới cho cho công tác đánh giá, phân loại và bảo tồn đa dạng sinh học. 1.6. Một số kết quả trong nghiên cứu về cây dó bầu tại Việt Nam và trên thế giới Xuất phát từ những giá trị mà cây dó bầu mang lại đã thúc đẩy các nhà khoa học trên thế giới trong đó có Việt Nam đã tiến hành những thí nghiệm để nghiên cứu về loài cây này. Một trong những nghiên cứu có đóng góp lớn nhất cho tới nay là TS. Lê Công Kiệt và TS. Paul Kessler người Hà Lan đã phát hiện loài Aquilaria rugosa năm 2005 đồng thời phân biệt được Aquilaria rugosa với A. sinnesiss, A. crassna, A. yunasensis [18]. Bằng chỉ thị AFLP nhóm nghiên cứu của Nurita và đống tác giả (2009) đã phát hiện được sự tương đồng di truyền giữa các Aquilaria sp là A. malaccensis, A. beccatianavà A. crassna khoảng 63,9 đến 72% so với các loài Aquilaria khác [21]. Các nhà khoa học người Malaysia cũng đã tiến hình phân tích trên 5 quần thể cây dó bầu ở Malaysia bằng chỉ thị RAPD với 23 cặp mồi RADP từ đó đã tìm ra 5 chỉ thị SCAR để phân biệt A. hita với các Aquilaria khác [27]. Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1.Vật liệu 2.1.1. Thực vật Gồm 18 mẫu lá cây dó bầu được thu thập tại Hà Tĩnh, Phú Quốc và tại Lào được thống kê qua bảng sau. Bảng 2.1. Thông tin về các mẫu dó bầu dùng trong nghiên cứu STT Tên mẫu Loài Xuất xứ 1 AL 02 Aquiaria sp Lào 2 AL 06 Aquiaria sp Lào 3 AL 08 Aquiaria sp Lào 4 G 1 Aquiaria sp Hà Tĩnh 5 T 1 Aquiaria sp Hà Tĩnh 6 T 2 Aquiaria sp Hã Tĩnh 7 T 3 Aquiaria sp Hà Tĩnh 8 T 4 Aquiaria sp Hà Tĩnh 9 T 6 Aquiaria sp Hà Tĩnh 10 T 7 Aquiaria sp Hà Tĩnh 11 T 8 Aquiaria sp Hà Tình 12 T 9 Aquiaria sp Hà Tĩnh 13 T 10 Aquiaria sp Hà Tĩnh 14 T 11 Aquiaria sp Hà Tĩnh 15 T 14 Aquiaria sp Hà Tĩnh 16 PQ64 Aquiaria sp Phú Quốc 17 Qx Aquiaria sp Phú Quốc 18 M1 Aquiaria sp Phú quốc 2.1.2. Chủng vi khuẩn Chủng vi khuẩn Escherichia coli (DH5α) sử dụng cho mục đích tách dòng do Phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ sinh học cung cấp. 2.1.3. Hóa chất Kit tinh sạch DNA (AccuPrep® Gel Purification Kit) của hãng Bioneer (Hàn Quốc). Enzyme hạn chế BamHI, T4 DNA Ligase của Fermentas (Hàn Quốc), Taq DNA polymerase, RNase được mua từ hãng Fermentas, vector tách dòng pBT do Phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ sinh học cung cấp. Hóa chất dùng cho tách chiết DNA tổng số: Nitơ lỏng, CTAB, NaCl, Tris HCl, EDTA, Sorbitol, NaH2PO4, H2O deion, Isopropanol, Ethanol, Chloroform, Isoamyl alcohol, RNase. Hóa chất dùng cho tách dòng gen: X-gal, IPTG, Vector tách dòng pBT do phòng Công nghệ tế bào thực vật cung cấp, Bacto tryptone, Yeast extract, NaCl, kháng sinh carbecillin Hóa chất để tách plasmid: Sol I (Tris HCl, EDTA), Sol II (NaOH, SDS), Sol III (Kali axetat), isopropanol, ethanol, phenol, chloroform. Hóa chất dùng cho phản ứng PCR: MgCl2, Buffer , Taq-polymerase, dNTP. Hóa chất dùng trong điện di DNA: agarose, TAE 1X (Tris - Acetic acide - EDTA), ethidium bromide. 2.1.4. Máy móc thiết bị Máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi DNA (Mini-transllumminatior, Bio-Rad, Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thuỵ Điển), máy vortex (Mimishaker, IKA, Đức), máy ly tâm, cùng với các trang thiết bị khác của phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học. 2.1.5. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu Cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm 4 cặp mồi barcode và 1 cặp mồi pUC18. Trình tự nucleotide của các cặp mồi được trình bầy trong bảng 2.2 Bảng 2.2.Trình tự các cặp mồi nhân bản gen barcode TT Vùng gen nhân bản Trình tự mồi 5’-3’ Ký hiệu 1 rbcL ATGTCACCACAAACAGAAAC P2F TCGCATGTACCTGCAGTAGC P2R 2 psbA-trnH GTTATGCATGAACGTAATGCTC P10F CGCGCATGGTGGATTCACAATCC P10R 3 rpoB AAGTGCATTGTTGGAACTGG P5F GATCCCAGCATCACAATTCC P5R 4 ITS ACGAATTCATGGTCCGGTGAAGTGTTCG P12F TAGAATTCCCCGGTTCGCTCGCCGTTAC P12R 5 PuC18 CAGGGTTTTCCCAGTCACGA puC18F GCGGATAACAATTTCACACA puC18R 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Các bước nghiên cứu - Thu thập mẫu lá ở các cây dó bầu - Tách chiết tinh sạch DNA tổng số từ 18 mẫu dó bầu - Sử dụng phương pháp PCR để nhân bản đoạn gen quan tâm với mồi đặc hiệu - Tách dòng đoạn gen quan tâm - Xác định trình tự gen và phân tích kết quả 2.2.2. Các phương pháp nghiên cứu 2.2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA từ mẫu cây dó bầu DNA được tách chiết bằng phương pháp CTAB có cải tiến bao gồm các bước sau. Cân 200 mg mẫu lá cây dó bầu và nghiền cẩn thận trong nitơ lỏng thành dạng bột mịn, chuyển ngay vào ống eppendorf 2 ml. Bổ sung 1 ml đệm rửa (thành phần bảng 2.3) vào ống eppendorf 2 ml, voltex tạo thành dịch đồng nhất. Ly tâm 13000 vòng/phút (v/p) trong 5 phút. Bổ sung 0,6 ml đệm tách chiết (thành phần bảng 2.4), đảo nhẹ thành hỗn hợp đồng nhất. Ủ trong 1 giờ 30 phút ( thỉnh thoảng đảo đều ). Bổ sung 0,8 ml chloroform: isoamylalcohol (24:1), đảo đều. Ly tâm 13000 v/p ở 4oC. Hút dịch nổi cho vào ống eppendorf 1,5 ml mới. Bổ sung 0,8 ml isopropanol, đảo nhẹ, để ở tủ -20oC trong 1 giờ (ít nhất 20 phút). Ly tâm 13000 v/p trong 15 phút ở 4oC, loại bỏ dịch nổi thu tủa. Bổ sung 0,8 ml cồn 70%. Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút ở 4oC, loại cồn thu tủa. Làm khô DNA ở nhiệt độ phòng. Hòa tan DNA trong 200 µl nước khử ion. Bổ sung 0,5 µl RNase (100 mg/ml) ủ ở 37oC trong 2 giờ. Bảo quản DNA tổng số ở -20oC Bảng 2.3. Thành phần dung dịch đệm rửa STT Hóa chất Nồng độ chuẩn Nồng độ cuối cùng 1 Sorbitol 350 mM 2 Tris-HCl (pH 8,0) 1 M 100 mM 3 EDTA (pH 8,0) 0,5 M 5 mM 4 Sordium metabisulfit 5% Bảng 2.4. Thành phần dung dịch đệm tách STT Hóa chất Nồng độ chuẩn Nồng độ cuối cùng 1 NaCl 3 M 1.5 M 2 Tris-HCl (pH 8,0) 1 M 100 mM 3 EDTA (pH 8,0) 0,5 M 20 mM 4 CTAB 4% 2.2.2.2. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Phản ứng PCR được thực hiện trên máy PCR PTC - 100 (MJ. Research., Mỹ) với tổng thể tích là 25 µl/mẫu trong đó chứa các thành phần và nồng độ của các chất tham gia phản ứng như sau: Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR Thành phần phản ứng Thể tích (µl) Nước khử ion vô trùng 12,8 Buffer (10X) 2,5 MgCl2 (25 mM) 2,5 dNTPs (10 mM) 2,5 Primer barcode_F (100 pmol/µl) 1 Primer barcode_R (100 pmol/µl) 1 Taq DNA polymerase (6 unit/µl) 0,7 DNA 2 Tổng thể tích 25 Bảng 2.6. Chu kỳ phản ứng PCR Bước Phản ứng Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ 1 Biến tính 94 2 phút 30 2 Biến tính 94 30 giây 3 Gắn mồi 54 50 giây 4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút 5 Hoàn tất kéo dài chuỗi 72 10 phút 6 Kết thúc phản ứng 4 ∞ 2.2.2.3. Phương pháp tinh sạch DNA từ gel agarose Quy trình. - Cắt vùng gel chứa đoạn DNA quan tâm trên bản điện di. - Cân đoạn gel vừa cắt được và xác định thể tích đoạn gel này theo quy ước 1mg trọng lượng sẽ tương đương với 1 µl thể tích. - Bổ sung dịch kết gắn DNA vào cột tinh sạch GB (Gel Binding), theo tỉ lệ: Vmẫu:VGB = 1:1. - Ủ hỗn hợp ở 60oC trong 10 phút và cứ 2 phút thì đảo nhẹ 1 lần cho đến khi gel tan hoàn toàn. - Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột liên kết DNA và ly tâm 13000 vòng/phút (v/p) trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. - Tiếp tục bổ sung đệm rửa 0,7 ml WB (Washing Buffer), ly tâm 13.000v/p. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Ly tâm thêm 1 lần nữa trong vòng 1 phút để loại đệm WB. - Chuyển cột sang ống Eppendorf mới 1,5 ml. Bổ sung 30 µl nước khử ion khử trùng, để ở nhiệt độ phòng 1 phút và ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút để thu mẫu DNA. 2.2.2.4. Phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào vector Sau khi đoạn DNA được tinh sạch, tiến hành gắn chúng vào vector tái tổ hợp thông qua phản ứng lai DNA sử dụng enzyme DNA T4 - ligase. Vector sử dụng là vector pBT (Hình 2.1) Hình 2.1. Sơ đồ vector pBT Phản ứng ghép nối ở điều kiện 22oC trong 1h30’.Sản phẩm sau khi ghép nối được sử dụng để biến nạp. Bảng 2.7. Thành phần phản ứng ligase Thành phần phản ứng Thể tích (µl) H2O 3 Buffer T4 ligase 1 pBT 1 T4 DNA ligase 1 DNA 5 Tổng thể tích 10 2.2.2.5. Phương pháp biến nạp DNA plasmid vào tế bào vi khuẩn E. Coli Biến nạp là quá trình chuyển DNA trực tiếp vào tế bào nhận, những tế bào có khả năng tiếp nhận DNA được gọi là tế bào khả biến. Quy trình. - Tế bào khả biến lấy từ tủ -83 0C ra và cho vào đá khoảng 10 phút trước khi biến nạp. - Bổ sung 10 µl DNA plasmid vào ống tế bào khả biến (50 - 100 µl). - Để ổn định trong đá trong vòng 5 phút. - Sốc nhiệt ở 42oC trong vòng 90 giây sau đó để trong đá 15 phút. - Bổ sung 200 µl môi trường LB lỏng, nuôi lắc với tốc độ 200 vòng/phút, 370C trong vòng 1giờ. - Cấy trải 100 µl -150 µl trên môi trường thạch LB chứa Carbenicillin. - Nuôi cấy trong tủ ấm 37oC qua đêm. - Sản phẩm sau biến nạp được cấy trải trên môi trường có chứa kháng sinh carbenicilin, X-gal và IPTG kết quả sẽ xuất hiện hai loại khuẩn lạc: khuẩn lạc xanh và khuẩn lạc trắng. Tất cả các khuẩn lạc này là những khuẩn lạc đều đã được biến nạp plasmid chứa gen kháng sinh carbenicillin nên có thể phát triển được trên môi trường chọn lọc này và phát triển thành các khuẩn lạc. Những khuẩn lạc xanh xuất hiện là do vector không có nhận được gen ngoại lai. Do vector có mang operon lacZ nên khi operon này hoạt động bình thường và khi có mặt chất cảm ứng IPTG sẽ tổng hợp enzyme β-galactosidase, enzyme này sẽ chuyển hóa cơ chất X-gal thành hợp chất có màu xanh. Còn những khuẩn lạc trắng là do nhận được plasmid mang gen ngoại lai. Gen ngoại lai sẽ chèn vào và nó sẽ phá vỡ cấu trúc gen lacZ khi có chất cảm ứng IPTG thì gen lacZ cũng không tổng hợp enzyme β-galactosidase và không xảy ra sự chuyển hóa X-gal. Tuy nhiên không phải tất cả các khuẩn lạc trắng đều mang plasmid tái tổ hợp có chứa đoạn gen barcode chèn vào có thể là chứa đoạn gen là sản phẩm phụ của phản ứng PCR, sự đột biến trên promoter lac hay sự đứt gãy base thymine đầu 3’ của vector cũng có thể làm cho khuẩn lạc mang màu trắng. Vì vậy để có thể biết chính xác các khuẩn lạc trắng mang plasmid tái tổ hợp cần tiến hành chọn bằng phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) để phục vụ cho quá trình nghiên cứu tiếp theo. Bảng 2.8. Thành phần môi trường chọn lọc tế bào vi khuẩn mang DNA tái tổ hợp Hóa chất Thể tích Xgal (0,004%) 40 μl IPTG(100 μM) 20 μl Carbecilin(100 mg/l) 20 μl LB đặc 20 ml 2.2.2.6. Chọn dòng tế bào mang vector tái tổ hợp và tách plasmid Chọn dòng tế bào mang DNA tái tổ hợp: Sau khi biến nạp vector tái tổ hợp vào trong tế bào E.coli, chọn lọc trên môi trường LB đặc có chứa Carbecilin 100 mg/l, Xgal 0,004%, IPTG 100 μM, ủ đĩa ở 37oC trong 16h sẽ thu được khuẩn lạc xanh - trắng. Tuy nhiên không phải bất cứ khuẩn lac trắng nào cũng là khuẩn lạc nhận được đoạn gen chúng ta quan tâm do vậy chúng ta cần tiến hành quá trình sàng lọc bằng phản ứng PCR - clony. Lấy lượng phù hợp sinh khối từ khuẩn lạc lựa chọn, cho sinh khối tế bào vi khuẩn này vào trong 10 µl nước khử ion. Sau đó sử dụng 3 µl hỗn hợp này để dùng cho phản ứng PCR. Phản ứng PCR được thực hiện với thanh phần như sau Bảng 2.9. Thành phần phản ứng PCR kiểm tra khuẩn lạc TT Thành phần và nồng độ Thể tích (µl) 1 H2O 12,8 2 Dream Taq Buffer 2,5 3 MgCl2 2,5 4 dNTPs (2,5 mM) 2,5 5 Mồi puC-18 xuôi (10 µM) 1,0 6 Mồi puC-18 ngược (10µM) 1,0 7 Dream Taq (5 U/µl) 0,7 8 DNA 2,0 Tổng 25 Bảng 2.10. Chu kỳ phản ứng PCR- clony Bước Phản ứng Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ 1 Biến tính 94 5 phút 25 2 Biến tính 94 30s 3 Gắn mồi 54 50s 4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút 30s 5 Hoàn tất kéo dài chuỗi 72 10 phút 6 Kết thúc phản ứng 4 ∞ 2.2.2.7. Phương pháp tách DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn E. Coli Quy trình tách DNA plasmid được tiến hành theo phương pháp phenol/chloroform có cải tiến sử dụng hóa chất bao gồm 3 dung dịch Sol I, Sol II và Sol III . Bảng