Luận văn Sự tăng trưởng in vitro của cây mầm lúa Oryza sativa L. trong điều kiện stress nước

ờng tăng lên lúc chồi cây, củ, căn hành hết thời kỳ nghỉ, lúc hạt nảy mầm (Vũ Văn Vụ et al, 2000). GA nội sinh kích thích hạt nảy mầm kể cả sự phá ngủ của chồi, động viên chất dự trữ của nội nhũ (Nguyễn Như Khanh, 2002). Trong 18 thời kì nảy mầm, gibberellin kích thích sự tổng hợp của các enzyme amylase và các enzyme thuỷ phân khác như protease, photphatase... và làm tăng hoạt tính của các enzyme này, vì vậy mà xúc tiến quá trình phân hủy tinh bột thành đường cũng như phân hủy các polyme thành monome khác, tạo điều kiện về nguyên liệu và năng lượng cho quá trình nảy mầm. Trên cơ sở đó, nếu xử lý gibberellin ngoại sinh thì có thể phá bỏ trạng thái ngủ, nghỉ của hạt, củ, căn hành kể cả trạng thái nghỉ sâu (Vũ Văn Vụ et al, 2000). Trong điều kiện hiếu khí gibberellin có vai trò quan trọng trong sự nảy mầm của hạt lúa. Dưới điều kiện hiếu khí -amylase sản xuất được tăng cường để đáp ứng gibberellin sản xuất phôi. Nhưng trong điều kiện kị khí thì gibberellin không cần thiết cho nảy mầm của hạt lúa mà việc sản xuất -amylase trong quá trình nảy mầm của hạt gạo được cho là đóng một vai trò quan trọng đối với khả năng chịu thiếu oxy của các loại hạt ngũ cốc (Loreti et al, 2003). GA khởi động sự nảy mầm của hạt bằng cách tác động đến một trong các bước: hoạt hóa sinh dưỡng của phôi, làm yếu các lớp nội nhũ cản trở sinh trưởng bao quanh phôi và động viên chất dự trữ trong nội nhũ. GA hoạt hóa sự hình thành nhiều enzyme thủy phân, đáng chú ý nhất là α-amylase trong lớp tế bào alơron bao quanh nội nhũ của hạt ngũ cốc đang nảy mầm (Nguyễn Như Khanh, 2002). Các tế bào alơron là những tế bào sống không phân chia, có chức năng đặc trưng là hình thành và giải phóng các enzyme tiêu hóa khối nội nhũ của hạt. Ở đây GA có vai trò như là chất cảm ứng mở gen của hệ thống tổng hợp protein enzyme thủy phân hoạt động (Vũ Văn Vụ et al, 2000). Bổ sung GA3 ngoại sinh gây ra một kết quả là tăng tỷ lệ nảy mầm và sự tăng trưởng cây mầm bằng cách tăng cường sự sẵn có của GA3 nội sinh (Kim et al, 2006). Gibberellin kích thích sự biệt hóa tế bào của mô phân sinh ngọn chồi. Tuy nhiên nếu ở nồng độ cao sẽ cản sự phân chia tế bào bằng cách giảm hoạt tính kích thích phân chia tế bào của cytokinin ở mô phân sinh ngọn chồi. Gibberellin kích thích kéo dài tế bào, cùng với auxin sẽ giúp phân chia tế bào (Pua và Davey, 2009). 19 • Cytokinin Tính chất đặc trưng của cytokinin là kích thích sự phân chia tế bào mạnh mẽ. Vì vậy người ta xem chúng như là các chất hoạt hóa sự phân chia tế bào, nguyên nhân là do cytokinin hoạt hóa mạnh mẽ quá trình tổng hợp acid nucleic và protein dẫn đến kích thích sự phân chia tế bào (Vũ Văn Vụ et al, 2000). Cytokinin ảnh hưởng rõ rệt lên sự hình thành và phân hóa cơ quan của thực vật, đặc biệt là sự phân hóa chồi. Người ta đã chứng minh rằng sự cân bằng giữa tỷ lệ auxin (phân hóa rễ) và cytokinin (phân hóa chồi) có ý nghĩa rất quyết định trong quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy in vitro cũng như trên cây nguyên vẹn (Vũ Văn Vụ et al, 2000). Nếu tỷ lệ auxin cao hơn cytokinin thì kích thích sự ra rễ, còn tỷ lệ cytokinin cao hơn auxin thì kích thích ra chồi; sự cân bằng giữa hai kiểu hormone này là một trong những yếu tố kiểm soát sự phát triển (Bùi Trang Việt, 2000). • Acid abscisic Một trong những hậu quả đầu tiên của sự thiếu nước trong đất là sự đóng các khí khổng và sự cản quang hợp. Trong điều kiện này, AAB được vận chuyển theo hướng ngược với hướng được thấy trong điều kiện quang hợp mạnh. Trong điều kiện quang hợp bình thường, AAB tích lũy trong diệp lạp (khổng mở); nhưng khi tế bào thịt lá bắt đầu mất nước, một phần AAB trong tế bào thịt lá được phóng thích vào apoplast và theo dòng thoát hơi nước tới các tế bào khí khổng để khởi phát sự đóng khẩu. Sự gia tăng tổng hợp AAB chỉ xảy ra khi khổng đóng, có lẽ để thúc nhanh hay kéo dài hiệu ứng đóng khổng của AAB (Bùi Trang Việt, 2002). Ở lúa người ta đã xác định gen RAB 21, được gây ra khi cây lúa bị stress nước. Gen này mã hóa một protein glycine chỉ có trong các phần phân đoạn của tế bào chất. Protein này tích lũy trong phôi gạo, lá, rễ và các tế bào mô sẹo có nguồn gốc từ việc bổ sung NaCl (200 mM) hoặc hormone thực vật acid abscisic (10 microM AAB). Cảm ứng của RAB tích tụ mRNA 21 của AAB là nhanh chóng (ít hơn 15 phút trong các tế bào bị gây stress) và tổng hợp protein, để đáp ứng với hormone này. 20 Acid abscisic (10-7 M) làm đóng khí khổng sau vài phút. Khi cây thiếu nước, hàm lượng acid abscisic trong lá tăng mạnh. Nếu lá tái hấp thu nước, hàm lượng acid abscisic sẽ trở lại giá trị ban đầu. Nhiều người cho rằng AAB là dấu hiệu của sự “khô hạn” kích thích sự đóng khí khẩu. Nó được xem như là hormone của “stress” vì nó được hình thành mạnh để phản ứng với các “stress” hoặc các điều kiện bất lợi của môi trường như hạn hán, nồng độ muối caovà làm cho cây biến đổi để thích ứng với môi trường (Vũ Văn Vụ et al, 2000). GA và AAB hoạt động cùng lúc với giai đoạn ngủ và giai đoạn nảy mầm. GA cao làm thúc đẩy nảy mầm khi đã ức chế tổng hợp AAB. Do đó, gỡ ngủ được đặc trưng bởi sự suy giảm AAB và tăng sinh tổng hợp GA (Finch- savage, 2003). Trong các cơ quan đang ngủ nghỉ, hàm lượng acid abscisic tăng gấp 10 lần so với thời kỳ sinh trưởng. Sự ngủ nghỉ kéo dài cho đến khi nào hàm lượng acid abscisic trong cơ quan ngủ nghỉ giảm đến mức tối thiểu. Do vậy từ trạng thái ngủ nghỉ chuyển sang trạng thái nảy mầm có sự biến đổi tỷ lệ giữa acid abscisic và gibberellin ở trong các cơ quan (Jain et al, 1996). • Ethylene và một số chất làm chậm sinh trưởng Ethylene kích thích sự kéo dài thân cây mầm, ngược với hiệu ứng cản thông thường. Khi cây mầm lúa bị ngập nước, sự tăng trưởng lóng gia tăng đột ngột. Điều này là do khi bị ngập nước cây lúa bị thiếu oxygen, sự tổng hợp ethylene giảm, nhưng cây lúa chìm trong nước có hàm lượng ethylene cao vì ethylene khuếch tán rất chậm trong đất ngập nước. Sự rụng lá do stress khô hạn nghiêm trọng là cách thực vật đáp ứng với ethylene để giảm bề mặt thoát hơi nước (Bùi Trang Việt, 2000). Các chất làm chậm sinh trưởng là một nhóm chất tổng hợp nhân tạo có bản chất hoá học khác nhau, được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả trong nông nghiệp. Chúng có những hoạt tính sinh lí tương tự như ức chế sự sinh trưởng kéo dài, làm cây thấp, mở rộng phiến lá, xúc tiến sự ra hoa, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của rễ (Vũ Văn Vụ et al, 2000). 21 Trong quá trình nuôi cấy thì quá trình nảy mầm, sự hình thành rễ, thân, lá đều được điều chỉnh bởi hai hay một vài hormone đặc hiệu. Nếu tỉ lệ này nghiêng về auxin thì rễ hình thành mạnh hơn, ngược lại, chồi hình thành mạnh hơn. Đây là cơ sở để hình thành cây hoàn chỉnh trong nuôi cấy in vitro. Sự ngủ và nảy mầm được điều chỉnh bằng tỉ lệ giữa AAB/GA. Tỉ lệ này nghiêng về AAB thì hạt ở trạng thái ngủ và ngược lại thì sự nảy mầm xảy ra (Vũ Văn Vụ et al, 2000). 1.2.6. Vai trò của saccharose và mannitol trong nuôi cấy in vitro cây mầm lúa Trong nuôi cấy in vitro, sự sinh trưởng của cây chủ yếu được xác định bởi các thành phần của môi trường dinh dưỡng. Đường trong môi trường nuôi cấy đã được coi là nguồn carbon duy nhất cho sự phát triển của tế bào, chồi, cành, và thậm chí cả cây con. Đường có vai trò trong các con đường trao đổi chất và chuyển đổi năng lượng cho sự tăng trưởng của tế bào. Trong nuôi cấy mô thực vật, đường như một nguồn cung cấp carbohydrate để cung cấp một điều kiện nuôi tối ưu cho các tế bào (Gauchan, 2012). Nồng độ đường được lựa chọn phụ thuộc vào loại và tuổi của mô cấy. Phôi non yêu cầu một lượng đường tương đối cao. Đường phổ biến nhất được sử dụng là saccharose ở nồng độ 2 - 5%. Saccharose được coi như một nguồn carbon chủ yếu trong nuôi cấy in vitro vì chúng hiển diện phổ biến nhất trong nhựa vỏ cây của nhiều carbohydrate thực vật (Gauchan, 2012). Mannitol là một đường 6 cacbon mạch hở, một trong những polyols phổ biến nhất trong tự nhiên. Một trong những chức năng sinh lý quan trọng của mannitol là kiểm soát tế bào ở thế nước thấp, hoạt động như trong điều kiện ưu trương (Iwamoto và Shiraiwa, 2005). Mannitol cũng có thể hoạt động giống một enzyme chống oxy hóa như superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) và peroxidase (POX), có hiệu quả tái sinh và bảo tồn nguồn gen (Tenuifolius và Dianthus, 2009). Mannitol được sử dụng trong phòng thí nghiệm như một phương tiện để gây khô hạn trong nuôi cấy mô thực vật (Jain et al, 1996). 22 Chương 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu * Hạt Lúa Nàng Thơm Chợ Đào (Oryza sativa L.) được cung cấp từ Viện Khoa Học Kĩ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam. Ảnh 2.1. Hạt lúa Nàng Thơm Chợ Đào * Vật liệu sinh trắc nghiệm - Khúc cắt diệp tiêu cây mạ lúa (Oryza sativa L.)72 giờ tuổi - Trụ hạ diệp cây mầm xà lách (Lactuca sativa L.) 72 giờ tuổi - Tử diệp cây mầm dưa leo (Cucumis sativa L.) 48 giờ tuổi 2.2. Phương pháp 2.2.1. Xác định thời điểm bão hòa nước của hạt lúa Mục đích thí nghiệm: Xác định thời điểm bão hòa nước của hạt lúa để từ đó tiến hành cảm ứng stress nước trên cây mầm lúa. Phương pháp thí nghiệm: Cân 5 (g) hạt lúa và ngâm nước, cứ sau 1 giờ thì cân lại khối lượng đến khi nào trọng lượng tươi của hạt lúa không đổi, đó chính là điểm bão hòa nước. 23 2.2.2. Quan sát giải phẫu hình thái Các hạt lúa in vitro trong các môi trường nuôi cấy ở điều kiện bình thường hay xử lí stress được chụp hình mẫu cắt dọc, cắt ngang bằng tay hay máy cắt microtome, sau đó được nhuộm bằng đỏ carmine – xanh iod và quan sát dưới kính hiển vi quang học. • Mẩu được cắt bằng tay Phương pháp giải phẫu lần lượt qua các bước: - Mẫu được cắt ngang hay cắt dọc thành từng lát nhỏ 0,5 – 1 mm. - Tẩy mẫu bằng javel trong 30 phút, sau đó rửa sach mẫu nhiều lần bằng nước cất, chậm giấy thấm cho hết nước. - Ngâm mẫu trong acid acetic 20% trong 5 phút, rửa sạch bằng nước cất. - Nhuộm mẫu bằng phẩm nhuộm hai màu đỏ carmine-xanh iot trong 15 phút, rửa sạch bằng nước cất. - Quan sát mẫu dưới kính hiển vi quang học. • Mẫu được cắt bằng máy cắt microtome có kích thước 7 µm 1. Cố định mẫu Mẫu được cố định ngay trong môi trường FAA (formadehid acol acid) sau 24 giờ, chuyển mẫu vào etanol 700 2. Đúc mẫu Loại nước bằng cách đặt mẫu lần lượt trong: - Etanol 700: 3 lần, mỗi lần 20 phút. - Etanol 950: 3 lần, mỗi lần 20 phút - Etanol 1000: 3 lần, mỗi lần 20 phút Loại etanol bằng cách đặt mẫu lần lượt trong : - Butanol 1: 30 phút. - Butanol 2: 30 phút. - Butanol 3: 30 phút. - Butanol 4: 10 giờ hoặc qua đêm. Loại butanol bằng cách đặt mẫu lần lượt trong paraffin tan ở 560 – 600 c: 24 - Paraffin 1: 1 giờ. - Paraffin 2: 1 giờ. - Paraffin 3: 1 giờ. Đổ paraffin nóng chảy vào khuôn, đặt mẫu vào và đổ đầy paraffin. 3. Cắt và dán mẫu Mẫu được cắt dọc thành từng lát mỏng 7µm nhờ máy vi phẫu (microtome). Băng paraffin có chứa mẫu được cắt thành từng đoạn ngắn và được dán lên lam chứa dung dịch gelatin 1%. Đặt mẫu trên bếp ở nhiệt độ khoảng 350C. Mẫu dãn ra dán chặt vào lam. Giữ mẫu trong tủ ấm ở 300C trong hai ngày để cho mẫu thật khô. 4. Nhuộm mẫu Loại paraffin bằng cách đặt mẫu lần lượt trong: - Methylcyclohexan 1: 10 phút. - Methylcyclohexan 2: 10 phút. Rửa mẫu bằng etanol 1000. Sau đó, đặt mẫu lần lượt trong: - Etanol 1000: 5 phút. - Etanol 950: 5 phút. - Etanol 700: 5 phút. - Nước cất: 5 phút. Nhuộm mẫu bằng phẩm nhuộm hai màu đỏ carmine-xanh iod và quan sát dưới kính hiển vi quang học (Lê Thị Trung, 2003). 2.2.3. Khảo sát sự tăng trưởng cây mầm lúa in vitro Mục đích thí nghiệm: Tìm môi trường thích hợp với sự phát triển của cây mầm lúa in vitro. Phương pháp thí nghiệm: 4 môi trường được sử dụng: MS, MS1/2 (hàm lượng khoáng đa lượng giảm 1/2), MS1/5 (khoáng đa lượng giảm 1/5) và MS1/10 (khoáng đa lượng giảm 1/10). Mỗi nghiệm thức gồm 5 ống nghiệm, mỗi ống nghiệm gồm 3 hạt với 3 lần lặp lại. 1 nghiệm thức = 3*5*3 = 45 mẫu. Lúa được bóc vỏ ở bên ngoài, khử trùng bằng NaOCl 4% trong vòng 25 30 phút, sau đó đưa vào phòng nuôi cấy và rửa sạch bằng nước cất vô trùng 5 – 7 lần. Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ 25 ± 2 0C, ánh sáng 2000 ± 200 lux. Hạt được xem là nảy mầm khi có rễ lú ra khoảng 1 mm. Các chỉ tiêu sinh trưởng được theo dõi sau 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày từ khi cấy mẫu. - Chiều dài rễ được xác định từ phần gốc rễ cho tới đỉnh rễ. - Chiều dài chồi được xác định từ phần ngang gốc lên hết đỉnh chồi. Môi trường số cây mầm tăng trưởng tốt sẽ được chọn để thực hiện các nghiệm thức tiếp theo. Tuổi cây mầm được tính từ ngày bắt đấu cấy hạt (ngày 0). 2.2.4. Khảo sát sự tăng trưởng của cây mầm lúa trong môi trường MS1/2 với các nồng độ đường khác nhau Trong sự tăng trưởng của cây mầm đường saccharose có vai trò cung cấp năng lượng trong khi đường mannitol không cung cấp nguồn năng lượng mà sẽ gây khô hạn trong môi trường nuôi cấy. 2.2.4.1. Với nồng độ saccharose khác nhau Mục đích thí nghiệm: Xác định nồng độ đường saccharose phù hợp với sự phát triển của cây mầm lúa in vitro. Phương pháp thí nghiệm: Từ kết quả ở mục 2.2.3, hạt lúa được cấy trên môi trường MS1/2 có sự thay đổi nồng độ saccharose lần lượt là 0%, 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3,0% (MS1/2, đối chứng). Theo dõi chiều dài rễ và chiều dài chồi (như mục 2.2.3) sau 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày nuôi cấy. 2.2.4.2. Với nồng độ mannitol khác nhau Mục đích thí nghiệm: Xác định nồng độ mannitol thích hợp để cảm ứng stress trong sự phát triển của cây mầm lúa in vitro. Phương pháp thí nghiệm: Thay đường saccharose bằng đường mannitol với các nồng độ lần lượt là 0%, 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3% trên môi trường MS1/2 (đối chứng). 26 Theo dõi chiều dài rễ và chiều dài chồi (như mục 2.2.3) sau 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày nuôi cấy. 2.2.4.3. Với nồng độ đường saccharose và mannitol khác nhau Mục đích thí nghiệm: Xác định sự tác động đồng thời của hai loại đường lên sự phát triển của cây mầm lúa in vitro. Phương pháp thí nghiệm: Mẫu được cấy trên môi trường MS1/2 có bổ sung cả hai loại đường để kiểm tra ảnh hưởng của đường đến sự tăng trưởng của cây mầm lúa. Nồng độ đường trong môi trường MS1/2 là 3%, các nghiệm thức được bố trí sao cho tổng lượng đường trong môi trường là 3%: Các loại đường Nghiệm thức Saccharose (%) 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Mannitol (%) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 Theo dõi chiều dài rễ và chiều dài chồi (như mục 2.2.3) sau 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày nuôi cấy. 2.2.5. Theo dõi sự tăng trưởng rễ nhánh cây mầm lúa trên môi trường MS1/2 bổ sung saccharose riêng rẽ hoặc kết hợp Mục đích thí nghiệm: Xác định khả năng tạo và phát triển của rễ nhánh trên môi trường bình thường (MS1/2) và môi trường không có đường cũng như trên môi trường bị stress. Phương pháp thí nghiệm: 3 môi trường được chọn - MS1/2 (saccharose 3%, đối chứng) - MS1/2 loại saccharose + mannitol 3% - MS1/2 + mannitol 3% Theo dõi sự phát triển rễ nhánh (số lượng, chiều dài) sau 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày nuôi cấy. Rễ nhánh được tính là những rễ không sinh ra từ vị trí của rễ mầm. 2.2.6. Xác định thời gian bị stress của cây mầm lúa 27 Mục đích thí nghiệm: Xác định thời gian bị stress nước trong sự phát triển của cây mầm lúa để khi đưa ra môi trường tự nhiên. Sau khi bị stress cây lúa có khả năng sinh trưởng bình thường, chống chịu tốt hơn. Phương pháp thí nghiệm: Các nghiệm thức được bố trí như sau: MS1/2 (đối chứng) Mannitol 3% (24 giờ) → MS1/2 : 24 + ĐC Mannitol 3% (48 giờ) → MS1/2 : 48 + ĐC Mannitol 3% (72 giờ) → MS1/2 : 72 + ĐC MS1/2 (24 giờ) → Mannitol 3% : ĐC 24 + Man 3% MS1/2 (48 giờ) → Mannitol 3% : ĐC 48 + Man 3% MS1/2 (72 giờ) → Mannitol 3% : ĐC 72 + Man 3% Chỉ tiêu theo dõi: chiều dài rễ và chiều dài chồi sau 3 ngày từ khi nuôi cấy. 2.2.7. Xác định trọng lượng tươi, trọng lượng khô của cây mầm lúa trên các môi trường cảm ứng mannitol 3% kết hợp thời gian bị stress khác nhau Mục đích thí nghiệm: Từ các nghiệm thức của mục 2.2.6, trọng lượng tươi, trọng lượng khô của cây mầm lúa được theo dõi để thấy được sự tăng trưởng của cây mầm. Phương pháp thí nghiệm: Cân khối lượng 30 hạt cho từng nghiệm thức. Sau 3 ngày nuôi cấy, mẫu được lấy ra khỏi ống nghiệm, rửa sạch, thấm khô và cân để xác định trọng lượng tươi. Trọng lượng khô được xác định bằng cách sấy khô ở 800C sau 24 giờ, cân lại. Tiếp tục sấy ở 600C và cân đến khi trọng lượng không đổi. 2.2.8. Xác định cường độ hô hấp của cây mầm lúa trên môi trường MS1/2 và MS1/2 bổ sung mannitol 3% ở các thời gian bị stress khác nhau Mục đích thí nghiệm: Xem sự thay đổi cường độ hô hấp của cây mầm lúa khi bị stress nước với các thời gian khác nhau so với cây không xử lý. Phương pháp thí nghiệm: Đo cường độ hô hấp của cây mầm lúa ở trên hai môi trường MS1/2 và MS1/2 bổ sung mannitol 3% theo thời gian: 5 giờ (kết quả 2.2.1 đối chứng), 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ bằng máy Warburg ở 250 C ± 20C, trong tối. 28 Cân chính xác trọng lượng tươi cây mầm lúa, rửa sạch mẫu nhẹ nhàng và đựng trong nước cất. Cho vào thân bình Warburg 2 ml nước cất, dùng kẹp cho mẫu vật vào thân bình. Cho vào trụ giữa 0,5 ml dung dich KOH 20%. Dùng kẹp cho mảnh giấy lọc đã xếp vào trụ giữa. Thực hiện một bình nhiệt khí áp kế với 2,5 ml nước cất (không có mẫu vật), thoa vaselin vào mặt trong cổ bình (kể cả ống nhánh). Gắn bình Warburg vào áp kế, xoay nhẹ nút và bình để chỗ ráp thật kín. Cột thun quanh các móc để giữ bình không rớt . Gắn áp kế vào thành máy Warburg, thân bình ngập trong nước, mở khóa chia ba để áp kế thông với khí quyển. Cho máy lắc 10 phút (thời gian này cho nhiệt độ không khí trong bình ổn định với nhiệt độ nước là 250C. Sau 10 phút, tắt máy lắc, điều chỉnh mực chất lỏng trong áp kế đến vạch mười. Đóng khóa áp kế để hệ thống bình Warburg và nhánh áp kế kín, mở máy lắc, ghi thời điểm t1 đồng thời tắt đèn: thí nghiệm đo bắt đầu. Khi đọc số đo (sau 15 phút): ngưng máy lắc, điều chỉnh chất lỏng trong nhánh kín của áp kế về vạch 10, đọc mực chất lỏng bên nhánh mở của áp kế. Tính trị số ∆p bằng số mm chất lỏng chênh lệch giữa 2 áp kế. Tính trị số ∆v ở bình (thể tích oxy bị mô hấp thụ) qua hệ thức ∆v=k. ∆p, từ đó tính ra cường độ hô hấp của mỗi thí nghiệm (µl oxygen hấp thu/ g TLT / giờ). 2.2.9. Xác định hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh của cây mầm lúa Mục đích thí nghiệm: Xác định được hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh trong cây mầm lúa in vitro ở các thời điểm khác nhau để từ đó có phương pháp tác động đến cây trong điều kiện stress. Phương pháp thí nghiệm: Cây mầm lúa trên môi trường MS1/2 và MS1/2 có bổ sung mannitol 3% được dùng để đo các chất điều hòa tăng trưởng thực vật sau 5 giờ, 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ nuôi cấy. * Li trích và phân đoạn Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh được li trích và phân đoạn theo Bùi Trang Việt (1992). 29 Nghiền 1 (g) mẫu trong 50 ml methanol 80%, để trong tối, thỉnh thoảng lắc. Sau 24 giờ, lọc hỗn hợp và thu lấy dịch lọc I. Thêm vào bã 20 ml methanol 80%, lắc 20 phút, lọc thu dịch lọc II. Lặp lại như trên một lần nữa và thu dịch lọc III. Hòa chung 3 dịch lọc I, II, III, đem cô cạn dưới quạt còn khoảng 1 ml. Thêm nước cất vào cho đủ 10 ml, dịch nước được chỉnh pH = 2,5 với dung dịch HCl 1%. Cho hỗn hợp vào bình lóng, thêm 15 ml eter, lắc bình lóng khoảng 20 phút, để yên và chờ dịch lọc trong bình lóng phân lớp. Tách riêng dịch nước (lớp dưới) vào và dịch eter (lớp trên). Từ dịch nước thu được, lặp lại sự lóng tương tự hai lần nữa. Sau quá trình này, thu được dịch eter 1 (chuẩn bị cho sự sắc ký và sinh trắc nghiệm nhóm chất acid: AIA, AAB và GA3) và dịch nước. Dịch nước được chỉnh pH = 7 và tiếp tục lóng eter theo cách tương tự như trên, sau đó thu dịch eter 2 (dịch để sắc ký và sinh trắc nghiệm zeatin) và nước (bỏ). Dịch eter 1 và 2 thu từ những lần lóng được cho vào bình lóng (riêng cho từng phần) thêm 3 ml dung dịch NaHCO3 8%, lắc khoảng 5 phút, để yên hỗn hợp trong bình lóng sẽ phân thành hai lớp, loại bỏ lớp bên dưới. Tiếp tục lặp lại như vậy một lần nữa với 3 ml NaHCO3 8%. Mỗi dịch eter thu được từ quá trình này được cho vào một becher và quạt cạn đến 0,5 ml. * Sắc ký lớp mỏng: Dịch trích của các mẫu được chấm trên bản mỏng silicagel 60 F254 (mã số 1.05554, Merck), ở nhiệt độ 30 ± 10C. Dung môi di chuyển là chloroform: metanol : acid acetic (tỉ lệ 80 : 15 : 5 theo thể tích). Vị trí hormon tăng trưởng thực vật trên bản sắc ký được phát hiện nhờ quan sát dưới tia UV ở bước sóng 254 nm. * Xác định hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật bằng các sinh trắc nghiệm: Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật được trích từ mẫu ở các thời điểm khác nhau được xác định tương ứng với các băng trên bản silicagel nhờ giá trị Rf 30 của mỗi chất chuẩn. Chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh được cô lập riêng, cạo lấy các hạt silicagel trên bản sắc ký, ngâm với nước cất 24 giờ để chuẩn bị sinh trắc nghiệm xác định hoạt tính. Sinh trắc nghiệm auxin và acid abscisic Hoạt tính auxin và acid abscisic được xác định nhờ sinh trắc nghiệm diệp tiêu lúa (Bùi Trang Việt, 1992). Hạt lúa được cho nẩy mầm trong tối, sau 72 giờ diệp tiêu (chưa bị xé) được cắt thành đoạn dài 2 mm để dùng trong sinh trắc nghiệm. Mỗi nghiệm thức gồm 10 khúc diệp tiêu. Sự gia tăng chiều dài của diệp tiêu được đo sau 24 giờ, trong tối, nhiệt độ 30 ± 10C. Hoạt tính của auxin và acid abscisic lần lượt tỉ lệ thuận và nghịch với sự sai biệt chiều dài diệp tiêu so với đối chứng và được tính bằng cách so sánh sai biệt chiều dài của diệp tiêu trong các dịch trích và các dung dịch AIA 1 mg/l và AAB 1 mg/l. Sinh trắc nghiệm cytokinin Hoạt tính cytokinin được đo bằng dịch trích trắc nghiệm tử diệp dưa leo. Hột dưa leo được ngâm 2 giờ, cho nảy mầm sau 24 giờ và khi rễ mầm nhú ra khoảng 2mm thì tử diệp được cắt ra để dùng trong sinh trắc nghiệm. Mỗi nghiệm thức gồm 5 tử diệp. Hoạt tính cytokinin tỉ lệ thuận với sai biệt trọng lượng tươi của tử diệp so với đối chứng và được tính bằng cách so sánh với dung dịch zeatin 1 mg/l sau 48 giờ chiếu sáng (2000 ± 200 lux), ở nhiệt độ 30 ± 10C, ẩm độ 65 ± 5%. Sinh trắc nghiệm gibberellin Hoạt tính gibberellin được đo bằng sinh trắc nghiệm trụ hạ diệp cây mầm xà lách sau 24 giờ cho nảy mầm ở 2000 ± 200 lux, nhiệt độ 30 ± 10C, ẩm độ 65 ± 5%. Các hột với rễ mầm nhú ra 1 mm được chọn để dùng trong sinh trắc nghiệm. Mỗi nghiệm thức gồm 10 cây mầm. Hoạt tính gibberellin tỉ lệ thuận với sự sai biệt chiều dài trụ hạ diệp so với đối chứng sau 72 giờ xử lý và được tính bằng cách so sánh với dung dịch GA3 10 mg/l. Sự ly trích, phân đoạn và sinh trắc nghiệm các chất điều hòa tăng trưởng thực vật được thực hiện trong ba lần riêng biệt. Hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật là giá trị trung bình của ba lần lặp lại. 31 Hình 2.1. Sơ đồ ly trích và xác định hoạt tính tương đương của hormone thực vật (theo Bùi Trang Việt, 1992; Nguyễn Du Sanh và cs, 2011) 32 2.2.10. Đưa cây in vitro từ hai môi trường MS1/2 và MS1/2 có bổ sung mannitol 3% đã cảm ứng 48 giờ ra vườn ươm Mục đích thí nghiệm: Từ các kết quả đạt được, cây được gây stress trên môi trường có mannitol 3% với thời gian xử lý 48 giờ được đưa ra trồng ở vườn ươm nhằm tìm hiểu khả năng thích nghi của cây mầm lúa đã được cảm ứng stress trước khi đưa ra ngoài tự nhiên. Phương pháp thí nghiệm: Tiến hành đưa cây in vitro 7 ngày tuổi từ khi cấy ra khỏi môi trường MS1/2 và MS1/2 có bổ sung mannitol 3% được cảm ứng trong 48 giờ trồng ngoài môi trường tự nhiên tại vườn thí nghiệm thực vật trường Đại học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh. Tỉ lệ đất như sau: 1 kg đất + 1 kg mùn + 0,5 kg xơ dừa + 0,3 kg phân bò Đất được phân thành 2 loại: đất được cung cấp đầy đủ nước mỗi ngày và đất được tưới nước gián đoạn. - Đất ngập nước được xác định khi trong đất bão hòa nước (đất ướt). - Đất được tưới nước gián đoạn được xác định sau khi để đất khô 3 ngày, đo độ ẩm rồi tưới nước trở lại để đất đạt được độ ẩm ban đầu (đất khô). Độ ẩm đất được xác định bằng % lượng nước có trong đất: Wt(%) = a/b × 100 Trong đó: Wt - độ ẩm đất tính theo % trọng lượng a - lượng nước mất khi sấy ở 1050C (g) b - trọng lượng đất khô tuyệt đối (g) Cách trồng: khoảng cách rộng = dài = 15 cm, mỗi bụi trồng 3 cây Các chỉ tiêu theo dõi: - số rễ, chiều dài rễ - số lá, chiều dài lá - chiều dài thân - màu sắc lá 33 2.2.12. Xử lý thống kê kết quả thu được Số liệu thu được từ các thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm SPSS phiên bản 16.5 cho Window. Sự khác biệt có ý nghĩa ở mức xác xuất 0,05 với các giá trị được thể hiện bởi các chứ cái khác nhau kèm theo. - Số lần lặp lại của mỗi nghiệm thức: 3 - Thời gian thực hiện đề tài: 3/2012 -3/2013. - Địa điểm thực hiện đề tài: Phòng thí nghiệm Sinh lí thực vật trường Đại học Sư phạm Thành Phố Hồ Chí Minh, phòng t