Luận văn Tách và tinh chế dẫn xuất curcumin trích ly từ củ nghệ vàng (Curcuma Longa L.)

chống nấm, chống virus, làm lành vết thương, giảm cholesterol; chữa một số bệnh như: Alzheimer, đái tháo đường, viêm khớp, HIV-AIDS … [6, 22] Vì hoạt tính của curcumin khá đa dạng và phong phú, nội dung của luận văn này chỉ xin trình bày hoạt tính chống ung thư và chống oxy hóa của curcumin. Chương 1: Tổng quan 15 1.2.1. Hoạt tính chống ung thư Curcumin có khả năng ức chế sự tạo khối u, tác động đến hầu hết các giai đoạn của quá trình hình thành và phát triển khối u. Hình 1.12. Quá trình hình thành và di căn khối u và tác động của curcumin [23]. Trong giai đoạn đầu của bệnh, các tế bào bình thường bị tác động bởi các gốc tự do và bị biến đổi thành các tế bào ung thư. Curcumin có thể ngăn chặn quá trình này bằng cách bắt giữ các gốc oxy hóa khác nhau như: gốc hydroxyl OH•, gốc peroxyl ROO•, singlet oxygen, nitric oxide NO và peroxynitrite ONOO¯ [18, 24]. Curcumin có khả năng bảo vệ lipid, hemoglobin và AND khỏi quá trình oxy hóa. Curcumin tinh khiết có hoạt tính kháng các ion oxy hóa mạnh hơn demethoxycurcumin (DMC) và bisdemethoxycurcumin [24]. Kết quả nghiên cứu của Conney [24] cho thấy curcumin còn có tác dụng ức chế các chất gây ung thư benzo[a]pyrene (BaP) và 7,12- dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) trên da chuột. Curcumin được chứng minh là có khả năng chống di căn đối với một vài loại tế bào ung thư đồng thời ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Khả năng làm giảm quá trình di căn này curcumin phụ thuộc vào nguồn gốc của khối u và loại khối u ác tính [22, 24]. 1.2.2. Hoạt tính kháng oxy hóa Như đã nói ở phần giới thiệu chung về hoạt tính của curcumin, curcumin có hoạt tính sinh học mạnh và đa dạng. Một vài hoạt tính sinh học đó bắt nguồn từ tính kháng oxy hóa của curcumin. Curcumin là một chất kháng gốc oxy hóa tự do mạnh. Các nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh in vitro curcumin ức chế sự phát sinh của nhiều tác nhân gây oxy hóa (ROS) như: anion superoxide, H2O2, gốc nitrite đồng thời làm giảm lượng ROS in vivo. Các dẫn xuất của curcumin là demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin cũng có hoạt tính kháng oxy hóa.[22] Cấu trúc curcumin có hydrogen của nhóm phenol và hydrogen của nhóm methyl giữa mạch đều có khả năng tạo nên hoạt tính kháng oxy hóa. Tuy nhiên, vẫn còn nhiều tranh cãi xung quanh việc hoạt tính của curcumin thực chất do hydrogen ở vị trí nào đem lại. Liang Shen [2] cho rằng enolic proton hoạt động hơn phenolic proton và là proton có tính acid trội nhất trong ba proton. Enolic proton đóng vai trò quan trọng đối với quá Tế bào bình thường Tế bào ung thư Khối u tăng trưởng Khối u di căn Curcumin Biến đổi Phát triển Lan rộng Chương 1: Tổng quan 16 trình phân ly và trao đổi proton liên quan đến cơ chế loại bỏ gốc tự do của curcumin. Điều đó có nghĩa là trong suốt quá trình trao đổi proton để loại bỏ gốc tự do, proton enolic là proton đầu tiên tách ra. [2] O H C O H O H3CO OCH3 O H O H C H3CO OCH3 O H O O H O2 .- HO2 . Wei-Feng Chen [25] đã nghiên cứu khả năng ức chế 2,2’-azobis(2-amidinopropane hydrochloride) (AAPH) và Cu2+ trong oxy hóa lipoprotein nồng độ thấp của curcumin và một số chất có cấu trúc tương tự curcumin nhưng cấu tạo không có nhóm phenol. Các chất đó là: 1,7-bis(3,4-dimethoxyphenyl)-1,6-heptadiene3,5-dione (1), 1,7-bis(4- methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione (2) và 1,7-diphenyl-1,6-heptadiene-3,5- dione (3). Kết quả hoạt tính của các chất này yếu hơn curcumin. Do đó, nhóm nghiên cứu đã kết luận rằng nhóm phenol trong phân tử đóng vai trò quan trọng trong hoạt tính kháng oxy hóa của curcumin. Hình 1.13. Cấu trúc các chất 1,7-bis(3,4-dimethoxyphenyl)-1,6-heptadiene3,5-dione (1), 1,7-bis(4-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione (2) và 1,7-diphenyl-1,6- heptadiene-3,5-dione (3) [25]. Wright, J. S. [19] lại chỉ ra rằng vai trò của nhóm phenol và methyl đối với khả năng kháng oxy hóa của curcumin phụ thuộc vào loại gốc tự do và môi trường phản ứng. Nghiên cứu cho rằng curcumin bắt gốc tự do curcumin theo cơ chế HAT (H-atom transfer): FR• + Cur – H → FR – H + Cur•+ Trong đó: FR•: gốc tự do tấn công (1) O O OCH3 OCH3 H3CO H3CO (2) O O OCH3H3CO (3) O O Chương 1: Tổng quan 17 Cur – H : phân tử curcumin FR – H : gốc tự do sau khi nhận thêm một nguyên tử H Cur• : gốc curcumin hình thành do mất nguyên tử H của O-H hoặc C-H Ví dụ: DPPH• + trans-diketo curcumin → DPPH2 + trans-diketo curcumin. K. Indira Priyadarsini [13] cho rằng hoạt tính kháng oxy hóa của curcumin là do cả nhóm phenol lẫn nhóm methyl . Quá trình phản ứng của chất oxy hóa với curcumin diễn ra theo hai hướng: (1) sự dịch chuyển electron sau khi phân tử curcumin mất một proton; (2) sự tách ra của hydro ở nhóm phenol.(Hình 1.10) Khi nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa dựa trên khả năng phản ứng với monocation của 2,2’-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sunfonic acid (ABTS•+) trên curcumin và một vài chất có cấu tạo tương tự curcumin mà không chứa nhóm phenol, W. M. Weber [5’] đã kết luận curcumin phản ứng đánh bắt gốc tự do và tạo thành gốc phenoxy bền theo cả hai cơ chế sau: (1) Tách trực tiếp hydrogene ở nhóm phenol. (2) Ion hóa proton của nhóm methyl ở giữa mạch, sau đó thông qua sự dịch chuyển electron tạo thành gốc carbon trung tâm và đồng phân hóa hình thành gốc phenoxy. Chương 1: Tổng quan 18 OH OCH3 C C C O O H H OH OCH3 C C C O O H H + ABTS OH OCH3 C C C O O H OCH3 C C C O O H O H + H + O OCH3 C C C O O H H C C C O O R H C C C O O R C C C O O R ABTS Hình 1.14. Cơ chế phản ứng đánh bắt gốc tự do của curcumin (trên) và các chất tương tự curcumin không chứa nhóm phenol (dưới).[26] Toshiya Masuda [27] cho rằng quá trình bắt gốc tự do của curcumin xảy ra theo cơ chế: S – OO• + AH  SOOH + A• (1) A• + X• → nonradical material (2) Trong đó: S: chất được oxy hóa AH: chất chống oxy hóa có nhóm phenolic A• : gốc kháng oxy hóa X• : gốc cùng loại hoặc khác loại với A• Chương 1: Tổng quan 19 Quá trình (1) là thuận nghịch, quá trình thứ (2) là bất thuận nghịch, sản phẩm cuối cùng là hợp chất bền. Chuỗi phản ứng trong dây chuyền phản ứng chống gốc tự do của curcumin cũng kết thúc bằng phản ứng ghép đôi giữa A• và X•. Khi có mặt các lipid không bão hòa, gốc lipid hydroperoxyl đóng vai trò là X• và tạo thành một vài đồng phân peroxide bằng phản ứng ghép đôi với gốc curcumin. Toshiya Masuda [27] đã xác định được 6 sản phẩm của quá trình kháng oxy hóa của curcumin với sự có mặt của linoleate. Các sản phẩm được đánh dấu từ 1 đến 6 trên hình 1.15. Chương 1: Tổng quan 20 Hình 1.15. Cấu trúc hóa học của các hợp chất từ 1 đến 6 [27]. Chương 1: Tổng quan 21 Hình 1.16. Cơ chế của curcumin chống lại sự oxy hóa lipid chưa bão hòa (EtLO: ethyl linoleate, EtLOOH: ethyl linoleate hydroperoxide, EtLOO•: gốc ethyl linoleate hydoperoxyl)[27] Cơ chế kháng oxy hóa của curcumin với sự hiện diện của linoleate được biểu diễn trên hình 1.16. Curcumin bắt giữ gốc tự do bằng nhóm phenolic và chuyển thành gốc tự do curcumin. Gốc tự do curcumin phản ứng với gốc peroxyl của ethyl linoleate tạo thành một sản phẩm ghép nối thông qua liên kết peroxyl. Sản phẩm này không bền nên tiếp tục phản ứng Diels-Alder cho sản phẩm cuối cùng là một trong 6 sản phẩm đã nêu ở trên. Linoleate tạo ra 4 gốc đồng phân peroxyl trong suốt quá trình tự oxy hóa, gồm: 9-trans 11-trans- diene 13-hydroperoxide, 9-cis-11-trans-diene 13-hydroperoxide, 10-trans-12 cis-diene 9- hydroperoxide, và 10-trans-12-trans-diene 9-hydroperoxide. Phản ứng ghép đôi tương ứng giữa các gốc peroxyl này và gốc curcumin tạo ra các sản phẩm trung gian. Các sản phẩm này tiếp tục biến đổi thành một trong số 6 sản phẩm cuối cùng kể trên thông qua phản ứng Diels-Alder.[27] Khả năng kháng oxy hóa của curcumin còn thể hiện ở khả năng tạo phức với các ion kim loại gây độc cho cơ thể động vật như: Pb, Cd, Fe. Do đó, giảm những tổn thương thần Chương 1: Tổng quan 22 kinh và mô động vật nhờ giảm quá trình oxy hóa lipid gây ra bởi các kim loại trên não [28, 29]. Hoạt tính kháng oxy hóa không giống nhau giữa các curcuminoid có trong nghệ. Hoạt tính in vitro của các chất này thay đổi theo thứ tự curcumin > demethoxycurcumin > bisdemethoxycurcumin [30]. Sở dĩ như vậy là do ảnh hưởng của nhóm methoxyl ở vị trí ortho tồn tại trong cấu tạo. Nhóm methoxyl ở vị trí ortho tạo liên kết hydro nội phân tử với hydro của nhóm phenol làm cho hydro này tách ra dễ dàng hơn [25]. Điều đó giải thích vì sao hoạt tính của curcumin cao hơn các curcuminoid còn lại: DMC chỉ còn một nhóm ortho-methoxy và BDMC không còn ortho-methoxy nào. O H O CH3 O O CH3 H Hình 1.17. Liên kết hydro nội phân tử giữa hydro của nhóm phenol với ortho-methoxy [25] Chương 1: Tổng quan 23 CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 2.1. Mục đích nghiên cứu - Tách 3 thành phần riêng biệt trong hỗn hợp curcuminoid thương phẩm. - Xác định độ tinh khiết, cấu trúc hóa học của mỗi thành phần. - Xác định hoạt tính sinh học từng thành phần tách được. 2.2. Sơ đồ tiến hành thực nghiệm Hình 2.1. Sơ đồ tiến hành thực nghiệm. Bột curcuminoid Kết tinh lại Curcumin đã kết tinh Nước cái dưới lọc Sắc kí cột (CC) Sắc kí cột (CC) Curcumin DMC, BDMC Xác định cấu trúc, định lượng Xác định hoạt tính sinh học Chương 1: Tổng quan 24 Bột curcuminoid thương phẩm đầu tiên được kết tinh lại trong hệ dung môi methanol:nước. Sau đó, cả curcumin sau kết tinh và nước cái dưới lọc đểu được chạy sắc ký cột để tách lấy các curcuminoid thành phần. Qua sắc ký cột, curcuminoid sau kết tinh cho nhiều curcumin và curcuminoid trong nước cái cho nhiều DMC và BDMC. Các curcuminoid thành phần cô lập được xác định độ tinh khiết bằng TLC, đo điểm chảy, HPLC và xác định cấu trúc bằng đo phổ UV-Vis, MS, NMR. Hoạt tính sinh học của hỗn hợp curcuminod ban đầu và các curcuminoid thành phần được xác định bằng phương pháp DPPH và MDA. 2.3. Phương pháp thực hiện 2.3.1. Kết tinh 2.3.1.1. Mục đích - Làm sạch curcumin, loại bỏ một số tạp chất, các chất nhựa còn tồn tại trong nguyên liệu. - Thu bột curcumin đã kết tinh có hàm lượng curcumin cao và nước cái dưới lọc có hàm lượng BMC, BDMC cao. 2.3.1.2. Nguyên tắc Dựa vào tính tan khác nhau của các chất trong dung môi. 2.3.1.3. Phương pháp thực hiện Hóa chất, nguyên liệu: - Bột curcuminoid thô (Viện dược liệu, Bộ Y Tế, Hà Nội). - Methanol 99.9% (Công ty giải pháp hóa học Vina, quận Tân Bình, TP. Hồ Chí Minh). - Nước cất. Chương 1: Tổng quan 25 Hình 2.2. Bột curcuminoid ban đầu Phương pháp: Bột curcuminoid thương phẩm được kết tinh lại 3 lần trong hỗn hợp methanol:nước. Các bước thực hiện như sau: - Hòa tan hoàn toàn 500mg bột curcumiod thô bằng một lượng tối thiểu methanol ở 60°C. - Thêm nước cất vào cho đến khi dung dịch vừa đục. - Cho tiếp thêm một lượng nhỏ methanol khuấy cho đến khi dung dịch trong trở lại. - Giữ lạnh hỗn hợp ở 5°C trong 2h. - Đem hỗn hợp sau kết tinh lọc chân không. - Bột curcumin trên lọc được hút chân không, chuẩn bị cho giai đoạn tiếp theo. - Nước cái dưới lọc đem đi cô quay thành dạng bột khô, hút chân không, chuẩn bị cho giai đoạn tiếp theo. 2.3.2. Sắc ký bản mỏng (TLC) 2.3.2.1. Mục đích - Xác định hệ dung môi để chạy sắc ký cột. - Kiểm tra thành phần, độ tinh khiết của các hỗn hợp, các phân đoạn sắc ký cột. 2.3.2.2. Nguyên tắc Chương 1: Tổng quan 26 Sắc ký bản mỏng là sắc ký hấp phụ được tiến hành trên một bản mỏng, chất hấp phụ là silica gel hay oxyde nhôm cộng thêm bột bó để trải một lớp mỏng bám trên bề mặt tấm kính. Phương pháp này có ưu điểm: hiệu ứng tách tốt, nhạy hơn các phương pháp khác, thời gian tiến hành nhanh, lượng chất phân tích nhỏ và dụng cụ đơn giản. 2.3.2.3. Phương pháp thực hiện Dụng cụ, hóa chất: - Bình sắc ký bản mỏng. - Bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck) 9 Bản mỏng khảo sát hệ dung môi: 2x10cm. 9 Bản mỏng chạy các mẫu curcuminod sau kết tinh và mẫu sau khi qua cột sắc ký: 5x10cm. Chiều cao triển khai bản mỏng: 8cm. - Dung môi: 9 dichloromethane 99.5% (Shantou Vilong Chemical Factory). 9 trichloromethane 99.7% (Shantou Vilong Chemical Factory). 9 methanol 99.9% (Công ty giải pháp hóa học Vina, quận Tân Bình, TP. Hồ Chí Minh). 9 acetone 99.7% (Công ty giải pháp hóa học Vina, quận Tân Bình, TP. Hồ Chí Minh). Các bước tiến hành: - Hoạt hóa silica gel bằng cách sấy bản mỏng ở nhiệt độ 110°C trong 1h, sau đó để cân bằng ẩm trong bình hút ẩm 30 phút. - Chấm chất cần phân tích lên bản mỏng: 9 Hòa tan một ít mẫu curcumin vào một lượng vừa đủ acetone. 9 Vuốt ống mao quản bằng ngọn lửa đèn cồn, rửa ống mao quản 2 lần bằng acetone. 9 Dùng ống mao quản, hút một lượng mẫu đã hòa tan rồi chấm lên bản mỏng. Khoảng cách của vết chấm đến bờ dưới khoảng 1cm, các vết chấm cách hai bờ Chương 1: Tổng quan 27 (A) y x (B) hai bên bản 1cm và cách nhau 1cm. Độ lớn của vết chấm càng nhỏ, sự tách càng tốt. - Triển khai bản mỏng: 9 Chuẩn bị bình sắc ký: rửa sạch, sấy khô, lót giấy lọc xung quanh thành. 9 Pha hệ dung môi khai triển cho vào bình, bão hòa khí quyển trong bình từ 15- 20 phút. 9 Đặt tấm bản mỏng vào bình, đậy nắp bình. 9 Theo dõi vạch dung môi chạy đến cách đầu trên của bản 1cm, dùng kẹp gắp bản mỏng ra. 9 Sấy nhẹ bản mỏng để đuổi hết dung môi. - Phát hiện vết và tính trị số Rf : 9 Phất hiện vết qua màu sắc tự nhiên của vết. 9 Phun thuốc thử H2SO4 10% trong C2H5OH. 9 Tính trị số Rf Gọi x: khoảng cách từ điểm xuất phát đến trung tâm vết. y: khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi. ௙ܴ ൌ ௫ ௬ Hình 2.3. Sắc ký bản mỏng (TLC): (A) Triển khai bản mỏng (B) Cách đo khoảng cách trên bản mỏng sau khi triển khai để tính giá trị Rf . 2.3.3. Sắc kí cột (CC) Chương 1: Tổng quan 28 2.3.3.1. Mục đích: phân lập các đơn chất từ hỗn hợp. 2.3.3.2. Nguyên tắc: Sắc ký hấp phụ có thể được tiến hành trên một cột thủy tinh thẳng đứng với chất hấp thụ đóng vai trò tướng tĩnh, dung môi rửa cột đóng vai trò tướng động chảy qua chất hấp phụ dưới ảnh hưởng của trọng lực. Đối với mỗi chất riêng biệt trong hỗn hợp cần tách, tùy theo khả năng hấp phụ và khả năng hòa tan của nó đối với dung môi rửa cột để lấy ra lần lượt trước hoặc sau. 2.3.3.3. Phương pháp thực hiện: Hóa chất, dụng cụ: - Cột đường kính 13cm. - Silica gel 60G F254 (Merck) 0.063 – 0.200 mm. - Dichloromethane 99.8% (Công ty giải pháp hóa học Vina, quận Tân Bình, TP. Hồ Chí Minh). - Methanol 99.9% (Công ty giải pháp hóa học Vina, quận Tân Bình, TP. Hồ Chí Minh). - Cát biển (Merck) 0.1 – 0.315mm. Các bước tiến hành: Bước 1: chuẩn bị - Sấy silica gel ở 110°C trong 1h, cân bằng ẩm trong bình hút ẩm trong 30 phút. Ngâm qua đêm với dung môi chạy cột (dichloromethane). - Cột được rửa sạch, sấy khô, cho bông gòn vào đáy, kẹp thẳng góc trên giá. Bước 2: nhồi cột - Cho dung môi vào đến nửa chiều cao cột, mở van, từ từ nhồi liên tục silica gel vào cột cho đến hết lượng silica gel cần nhồi. - Cho dung môi lên đầy cột, cho dung môi chạy tuần hoàn khoảng 2-4h để nén lớp silicagel ổn định trong cột. Chú ý không để mực dung môi xuống thấp hơn mực silica gel để tránh hiện tượng khô cột. - Cho một lớp cát biển khoảng 0.5-1cm lên trên lớp silica gel để bảo vệ bề mặt cột. Bước 3: đưa chất phân tích vào cột. Chương 1: Tổng quan 29 Có nhiều phương pháp nạp mẫu cần phân túch vào cột. Ở trong luận văn này, có hai phương pháp được sử dụng: - Cách 1: hòa tan hoàn toàn mẫu cần nạp bằng dichloromethane rồi nạp hết lượng dung dịch sau hòa tan vào cột. - Cách 2: hòa tan hoàn toàn lượng mẫu cần nạp bằng acetone, cho từ từ một lượng vừa đủ bột silica gel khô vào → trộn đều → cô đuổi dung môi → nạp vào cột. Tuy áp dụng cách nào thì các bước thực hiện cũng theo trình tự như sau: - Hạ mực dung môi trong cột xuống ngang mặt lớp cát trên cùng. Khóa van cột. - Dùng pasteur pipet (đối với mẫu nạp lỏng) hoặc đũa khuấy (đối với mẫu nạp rắn) từ từ nhẹ nhành nạp lớp mẫu lên trên bề mặt cột mà không làm xáo trộn bề mặt. - Mở van cột, tiếp tục cho dung môi vào để mẫu được hấp phụ vào silica gel. Bước 4: triển khai cột. - Dung môi dùng để rửa giải là hệ dichloromethane. - Đầu tiên, dùng hệ 100% dicholomethane. Sau đó theo thời gian tăng dần độ phân cực của dung môi bằng cách pha thêm vào dung môi lượng tăng dần methanol: (99.5: 0.5 v/v), (99:1 v/v), (98:2 v/v) … Bước 5: hứng và kiểm tra các phân đoạn. - Dung môi chạy qua cột được hứng bằng các phân đoạn thể tích bằng nhau v=10ml. - Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký bản mỏng với hệ dung môi thích hợp. Ở đây sử dụng hệ dung môi chạy bản mỏng dichloromethane: methanol (98:2 v/v) Bước 6: thu hồi và định lượng các phân đoạn. Các phân đoạn có kết quả kiểm tra TLC như nhau được gom lại và cô quay chân không, hút chân không và cân định lượng. Chương 1: Tổng quan 30 Hình 2.4. Các bước thực hiện sắc ký cột: (A) nhồi cột; (B) nạp mẫu; (C) hứng các phân đoạn. 2.3.4. Xác định cấu trúc 2.3.4.1. Phổ UV-Vis Mục đích: Xác định bước sóng hấp thu cực đại và kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm. Nguyên tắc: Khi phân tử hấp thu bức xạ tử ngoại hoặc khả kiến thì những electron hóa trị của nó bị kích thích và chuyển từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích và thu được phổ tử ngoại khả kiến (Ultraviolet and visible Spectra, UV-Vis). Phương pháp thực hiện: pha các mẫu curcumin tinh, DMC tinh, BDMC tinh với nồng độ 0.6x10-5mol/l. Tiến hành đo phổ UV-Vis. Máy đo: 6505 UV-Vis Spectrophotometer JENWAY. (A) (B) (C) Chương 1: Tổng quan 31 Hình 2.5. Dung dịch curcumin, DMC, BDMC dùng để đo phổ UV-Vis. 2.3.4.2. Đo điểm chảy Mục đích: xác định độ tinh khiết của curcumin, DMC, BDMC thu được. Máy đo: Electrothermal 9100. 2.3.4.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H NMR, 13 C NMR) Phổ NMR được phân tích tại Viện Hóa học Việt Nam, Hà Nội. Dung môi hòa tan: DMSO. Thông số máy: máy Bruker av 500 tần số 500MHz. 2.3.4.4. Phổ MS Phổ MS được phân tích tại Viện Hóa học Việt Nam, Hà Nội. 2.3.4.5. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Mục đích: Khảo sát thành phần của curcuminoid ban đầu, curcumin sau kết tinh và xác đinh độ tinh khiết của curcumin, DMC, BDMC tách được từ sắc ký cột. Nguyên tắc: Phân tách các chất dựa trên sự tương tác khác nhau của các chất với pha tĩnh, pha tĩnh với pha động, các chất với pha động. Phương pháp thực hiện: Phổ HPLC được phân tích tại Trung tâm Đào tạo và Phát triển Sắc ký, Tp. Hồ Chí Minh. - Chuẩn bị mẫu thử nghiệm: Cân m(g) mẫu thử. Chuyển phần mẫu thử vào bình định mức 10ml. Định mức bằng acetonitrile, lắc đều. Đánh siêu âm khoảng 5 phút. Pha loãng mẫu 20 lần. Lọc qua giấy lọc 0.45µm. Dung dịch sau lọc được tiêm vào máy. Chương 1: Tổng quan 32 - Tiến hành phân tích trên máy HPLC: 9 Cột sắc ký: cột pha đảo C18 (250x4.6mm, 5cm). 9 Nhiệt độ cột: 40°C. 9 Pha động: ACN:H3PO4 0.05%/ 55:45 (v/v). 9 Tốc độ dòng: 0.8ml/ phút. 9 Bước sóng cài đặt cho đầu dò UV-Vis là 422nm. 2.3.5. Xác định hoạt tính sinh học Mục đích: đáng giá hoạt tính chống oxy hóa ở mức độ in vitro của hỗn hợp curcuminoid ban đầu, curcumin, DMC và BDMC. 2.3.5.1. Phương pháp đánh bắt gốc tự do bằng thử nghiệm DPPH Nguyên tắc: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là chất tạo gốc tự do được dùng để thực hiện phản ứng man tính chất sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu. Hoạt tính oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu của DPPH, được xác đinh bằng cách đo quang ở bước sóng λ=517 nm. Phương pháp thực hiện: - 0.5ml mẫu thử được pha loãng ở các nồng độ khác nhau bằng methanol và cho phản ứng với đồng lượng dung lượng DPPH 1mM pha trong methanol. Thêm methanol cho vừa đủ 4ml. - Hỗn hợp phản ứng được pha theo bảng sau: Bảng 2.1. Hỗn hợp phản ứng Ống Dung dịch thử Methanol (ml) Dung dịch DPPH(ml) Trắng 0 4 0 Chứng 0 3.5 0.5 Thử 0.5 3 0.5 Lắc đều các ống trong 15 giây, để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 30 phút và đo quang ở bước sóng λ=517 nm. Chương 1: Tổng quan 33 Malonyl dialdehyd Acid thiobarbituric  Phức trimethin  N N OHSH H OH + C CH2 O H C O H HCl H2O N N OH OH S CH C CH H N N OH OH S H O H H H + Cl - O H H Hình 2.6. Dãy hỗn hợp sau phản ứng. Hoạt tính kháng oxy hóa được tính theo trị số IC50. Các bước tính toán như sau: - Vẽ đồ thị OD của các mẫu thử theo nồng độ (µg/ml). - Từ đồ thị, nội suy tìm nồng độ của mẫu thử tương ứng với giá trị OD=½ODchứng = 0.7505 (ODchứng trong phép thử DPPH là 1.501). Đó chính là giá trị IC50 của mẫu thử. 2.3.5.2. Phương pháp xác định sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipid (định lượng MDA) Nguyên tắc: Malonyl dialdehyd (MDA) là sản phẩm được sinh ra bởi quá trình peroxy hóa màng lipid tế bào. Khi cho phản ứng với acid thiobarbituric (TBA), một phân tử MDA sẽ phản ứng với hai phân tử TBA tạo thành phức trimethin (màu hồng) có hấp thu cực đại ở bước sóng λ=532nm. Phản ứng này thực hiện trong môi trường pH=2-3, nhiệt độ 90- 100°C trong vòng 15 phút. Cường độ màu của dung dịch tỉ lệ với hàm lượng MDA. Phương trình phản ứng: Phương pháp thực hiện: Chương 1: Tổng quan 34 0.1ml mẫu thử ở các nồng độ thử nghiệm được cho phản ứng với 0.5ml dịch đồng thể não và thêm đệm phosphate vừa đủ 2ml. Ủ hỗn hợp phản ứng ở 37°C trong 15 phút và dừng phản ứng bằng 1ml acid tricloacetic 10%. Sau khi ly tâm lấy dịch trong cho phản ứng với 1ml acid thiobarbituric 0.8% trong 15 phút ở nhiệt độ 100°C. Làm lạnh và tiến hành đo quang ở bước sóng 532nm. Hoạt tính kháng oxy hóa được tính theo trị số IC50. Các bước tính toán như sau: - Vẽ đồ thị OD của các mẫu thử theo nồng độ (µg/ml). - Từ đồ thị, nội suy tìm nồng độ của mẫu thử tương ứng với giá trị OD=½ODchứng = 0.3615 (ODchứng trong phép thử MDA là 0.723). Đó chính là giá trị IC50 của mẫu thử. Hình 2.7. Phương pháp định lượng MDA: (A) hỗn hợp được phản ứng ở 37°C trong 15 phút; (B) Hỗn hợp sau phản ứng, ly tâm và chuẩn bị đo quang. (A) (B) Chương 1: Tổng quan 35 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ - BÀN LUẬN 3.2. Sắc ký bản mỏng (TLC) Tiến hành khảo sát hai hệ dung môi (trichloromethane:methanol) và (dichloromethane:methanol) với các tỉ lệ khác nhau và tính trị số Rf tương ứng. Kết quả được trình bày ở bảng 3.1. Bảng 3.1. Kết quả khảo sát hệ dung môi (trichloromethane:methanol). Tỉ lệ CH3Cl:CH3OH (v/v) Rf ∆Rf Curcumin DMC BDMC Curcumin DMC BDMC 100:0 0.163 0.056 0.013 0.106 0.044 0.013 99:1 0.338 0.150 0.063 0.188 0.088 0.063 98:2 0.425 0.231 0.113 0.194 0.119 0.113 97:3 0.500 0.313 0.181 0.188 0.131 0.181 96:4 0.538 0.400 0.275 0.138 0.125 0.275 95:5 0.550 0.425 0.306 0.125 0.119 0.306 90:10 0.625 0.575 0.513 0.050 0.063 0.513 Nhận xét Các giá trị ∆Rf của các hệ CH3Cl:CH3OH (98:2), (97:3), (96:4) và (95:5) đều lớn hơn 0.1 chứng tỏ các hệ dung môi này có khả năng tách hỗn hợp curcuminoid thành các đơn chất riêng biệt. Tuy nhiên, kết quả sắc ký bản mỏng cho thấy các hệ CH3Cl:CH3OH (96:4) và (95:5) có độ phân cực cao nên vết nhựa đồng thời cũng bị kéo lên cao theo. Điều này rõ ràng không tốt vì lượng nhựa này lẫn vào vết BDMC nằm ở dưới cùng. Đối với trường hợp hệ dung môi CH3Cl:CH3OH (98:2), vết BDMC quá thấp (∆Rf =0.113 nhỏ) nên cũng dẫn đến hiện tượng vết nhựa bị kéo lên dính liền với vết BDMC. Nhận xét chung đối với hệ dung môi CH3Cl:CH3OH, hệ CH3Cl:CH3OH (97:3) có các giá trị ∆Rf cao có khả năng tách trên TLC là tốt nhất. Chương 1: Tổng quan 36 Hình 3.1. Kết quả TLC của curcumin với hệ dung môi CH3Cl:CH3OH với các tỉ lệ (A): (98:2 v/v); (B): (97:3 v/v); (C): (96:4 v/v) và (D): (95:5 v/v). Bảng 3.2. Kết quả khảo sát hệ dung môi (dichloromethane:methanol) Tỉ lệ CH2Cl2:CH3OH (v/v) Rf ∆Rf Curcumin DMC BDMC Curcumin DMC BDMC 100:0 0.125 0.038 0.000 0.088 0.038 0.000 99:1 0.400 0.200 0.088 0.200 0.113 0.088 98:2 0.525 0.313 0.188 0.213 0.125 0.188 97:3 0.575 0.413 0.288 0.163 0.125 0.288 96:4 0.750 0.606 0.463 0.144 0.144 0.463 95:5 0.813 0.688 0.563 0.125 0.125 0.563 Nhận xét Tương tự như hệ CH3Cl:CH3OH, các giá trị ∆Rf của các hệ CH2Cl2:CH3OH (98:2), (97:3) và (96:4) đều lớn hơn 0.1 chứng tỏ các hệ dung môi này có khả năng tách hỗn hợp curcuminoid thành các đơn chất riêng biệt. Tuy nhiên, các hệ có độ phân cực cao (97:3) và (96:4) có vết nhựa kéo lên quá cao. Chính vì vậy, hệ CH2Cl2:CH3OH ( 98:2) có các giá trị ∆Rf cao là hệ cho kết quả TLC tốt nhất. (A) (B) (C) (D) Chương 1: Tổng quan 37 Hình 3.2. Kết quả TLC của curcumin với hệ dung môi CH2Cl2:CH3OH với các tỉ lệ (A): (99:1 v/v); (B): (98:2 v/v); (C): (97:3 v/v) và (D): (96:4 v/v). Kết luận: sau khi khảo sát các hệ dung môi CH3Cl:CH3OH và CH2Cl2:CH3OH với các tỉ lệ khác nhau, chọn hệ CH2Cl2:CH3OH (98:2 v/v) là hệ dung môi để tách 3 thành phần curcumin, DMC và BDMC có trong hỗn hợp curcuminoid. 3.1