Luận văn Tinh chế và phân tích các đặc tính của lectin từ rong biển betaphycus gelatinus

bỏ tạp chất và bảo quản ở - 20oC cho đến khi sử dụng. Hồng cầu của máu thỏ, cừu, ngựa và gà do Viện Vaccine và sinh phẩm, Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa cung cấp. Hồng cầu các nhóm máu A, B, O ở người do Bệnh viện đa khoa tỉnh Khánh Hòa cung cấp. 2.2.2. Hóa chất Các loại đường và glycoprotein: D-glucose, D-mannose, D-galactose, L- fucose, D-xylose, D-glucosamine, D-gluconic acid, p-nitrophenyl-D- galactoside, p-nitrophenyl-D-glucoside, p-nitrophenyl-D-mannoside, transferrin, fetuin, porcine thyroglobulin và procine stomach mucin; Yeast mannan mua từ hãng Merck (Đức). Sephacryl S - 200 mua của hãng Pharmacia, Uppsala, Thụy Điển. 2.2.3. Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu Một số thiết bị sử dụng trong nghiên cứu gồm: Bảng 2.1 Các thiết bị chính được sử dụng trong thí nghiệm STT Thiết bị Model máy Xuất xứ 1 Bể rửa siêu âm Ultrasonic Jeiotech – Hản Quốc 2 Bộ siêu lọc Toya – Roshi, UHP 43 Nhật 3 Cân phân tích CP224S Satorius – Đức 4 Cột sắc ký lọc gel 1,6 x 60 (cm) GE Healthcare, Thụy Điển 5 Cột sắc ký trao đổi ion 1,6 x 20 (cm) GE Healthcare, Thụy Điển 6 Máy đo pH PHS – 550 Đài Loan 7 Máy khuấy từ CB 162 Stuart - Anh 8 Máy lắc 3017 GFL – Đức 30 9 Máy ly tâm eppendorf Mikro 200 Hettich - Đức 10 Máy ly tâm EBA 20 Hettich - Đức 11 Máy đo quang phổ UV-Vis Spectro UV/- 2505/24 Labomed – Mỹ 12 Thiết bị điện di đứng AJ – 6530 Atto – Nhật 13 Thiết bị thu phân đoạn tự động Frac – 920 GE Healthcare – Mỹ 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Chuẩn bị huyền phù hồng cầu máu 2 % Mỗi mẫu máu được rửa từ 3 đến 5 lần với 50 thể tích dung dịch NaCl 0,15 M. Sau khi rửa, huyền phù hồng cầu máu 2 % (v/v) được chuẩn bị bằng cách thêm dung dịch đệm photphat 0,02 M có chứa NaCl 0,15 M, pH = 7,2 và được dùng như hồng cầu tự nhiên [13]. Hồng cầu máu xử lý trypsin được chuẩn bị như sau:1/10 thể tích của dung dịch trypsin 0,5 % (w/v) được thêm vào huyền phù máu tự nhiên 2% (v/v), trộn đều và được ủ ở 37 oC trong 60 phút. Sau khi ủ, hồng cầu máu được rửa từ 3 đến 5 lần với dung dịch muối và hòa lại bằng dung dịch đệm photphat 0,02 M có chứa NaCl 0,15 M, pH = 7,2, ta thu được huyền phù hồng cầu máu 2 % đã xử lý enzyme [13]. 2.3.2 Phân tích hoạt tính lectin bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu [13] Hồng cầu được sử dụng trong các thí nghiệm xác định hoạt tính NKHC của lectin là hồng cầu thỏ, cừu và gà 2 %, hồng cầu máu người A, B và O đã được xử lý enzyme trypsin. Cách tiến hành: - Cho 25µl dung dịch NaCl 0,85 % vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng đáy chữ V. - Thêm 25 µl mẫu dịch chiết lectin cần kiểm tra hoạt tính ngưng kết hồng cầu vào giếng đầu tiên, trộn đều, pha loãng sang các giếng tiếp theo với tỷ lệ pha là 1/2n (n:số lần pha loãng). 31 - Tiếp tục cho 25µl hồng cầu máu 2 % đã xử lý bằng trypsin vào tất cả các giếng. - Lắc nhẹ, giữ ở nhiệt độ phòng, sau 2 giờ đọc kết quả. Cách đọc kết quả: - Kết quả âm tính: tất cả hồng cầu lắng xuống đáy giếng thành chấm nhỏ. - Kết quả dương tính: hồng cầu trong giếng bị ngưng kết hơn 50 %. Đơn vị hoạt tính - 1 đơn vị hoạt tính lectin hay 1 đơn vị hoạt tính NKHC trên 1 ml (HU/ml) chính là giá trị nghịch đảo của độ pha loãng lớn nhất mà dịch chiết lectin còn có khả năng làm ngưng kết hơn 50 % lượng hồng cầu cho vào phản ứng. Hoạt tính lectin:được xác định theo 2 chỉ số: - Hoạt tính tổng (Utổng): là tổng số đơn vị hoạt tính có trong một thể tích nhất định. Đơn vị: HU Utổng = V. 2 n Trong đó: V:tổng thể tích (ml) n:số lần pha loãng - Hoạt tính riêng (Uriêng):là số đơn vị hoạt tính lectin có trong 1mg protein. Đơn vị: HU/mg Trong đó: Utổng:tổng số đơn vị hoạt tính. Proteintổng:tổng hàm lượng protein. 2.3.3 Xác định hàm lượng protein Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp của Lowry và cộng sự [116], dùng albumin huyết thanh bò (BSA – Bovine serium albumin) làm chất chuẩn. * Nguyên tắc Dựa trên cơ sở protein có khả năng phản ứng với thuốc thử Folin tạo phức chất có màu xanh da trời. Cường độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong một phạm vi nhất định. - Đo cường độ màu bằng thiết bị đo màu quang điện ở bước sóng 750nm. 32 - Dựa vào đồ thị protein chuẩn (BSA) có thể xác định được hàm lượng protein ở nồng độ vài chục µg. * Hóa chất - Dung dịch A:4g NaOH (0,1M) và 20g Na2CO3 (2 %) pha trong 1000ml nước cất. - Dung dịch B:0,5g CuSO4.5H2O (0,5 %) pha trong dung dịch Natri Xitrat (1 %) hoặc trong dung dịch Natri- Kali Tactrat 1%. - Dung dịch C:hỗn hợp của 2 dung dịch A và B theo tỉ lệ 49:1 (v/v), pha trước khi sử dụng. Ghi chú: Thuốc thử Folin, pha loãng 2 lần với nước cất trước khi sử dụng. Dung dịch gốc:Albumin huyết thanh bò (BSA) 1 mg/ml. * Các bước tiến hành - Cân 10 mg BSA hòa tan trong 10ml nước cất, thu được dung dịch gốc có nồng độ 1 mg/ml. - Sau đó, pha loãng dung dịch gốc bằng nước cất thành các nồng độ 20, 40, 60, 80, 100 và 120 µg/ml để tiến hành xây dựng đường chuẩn. - Lấy chính xác 0,5 ml dịch chứa protein với các nồng độ khác nhau cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2,5 ml dung dịch C, lắc đều để yên trong 20 phút. - Sau đó, thêm vào hỗn hợp trong ống nghiệm 0,25 ml thuốc thử Folin đã pha loãng 2 lần, lắc đều và để yên trong 60 phút. - Đem so màu của hỗn hợp trên máy so màu quang điện ở bước sóng 750nm. Thực hiện thí nghiệm với mẫu kép, lấy giá trị trung bình, xây dựng đường hồi quy. Kết quả được xử lý theo phương pháp thống kê thông thường. Kết quả hàm lượng protein được tính toán từ đường chuẩn BSA đã xây dựng. (Bảng 1, hình 1, phụ lục A). Sau khi đã xây dựng đường chuẩn: Mẫu thí nghiệm cũng được chuẩn bị tương tự như đã nêu trên. Sau đó, đem so màu ở bước sóng 750 nm, đối chiếu với đồ thị chuẩn BSA để tính hàm lượng protein trong các mẫu. Làm thí nghiệm với mẫu kép và lấy giá trị trung bình. 2.3.4 Bố trí thí nghiệm tổng quát 33 Hình 2.2 Qui trình nghiên cứu tổng quát Rong B.gelatinus Xử lý Chiết Lọc, ly tâm thu dịch chịchie61t Kết tủa dịch chiết Ly tâm, thu tủa Hòa tan tủa, thẩm tách Ly tâm, thu dịch trong Sắc ký trao đổi ion Thu các phân đoạn có lectin cô đặc Sắc ký lọc gel Sephacryl S - 200 Điện di SDS - PAGE Lectin Bã Dịch Khảo sát điều kiện chiết: - Dung môi chiết. - Tỷ lệ nguyên liệu:dung môi chiết (w/v). - Thời gian chiết (giờ). Khảo sát: Nồng độ ethanol C2H5OH (%). Xác định: - Đặc tính liên kết cacbohidrate - Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính lectin: pH, nhiệt độ, - Khả năng gây ngưng kết hồng cầu. Điện di SDS-Page, xác định: - Độ tinh sạch của lectin thu nhận được - Khối lượng phân tử của Lectin thu được Cặn 34 2.3.5 Xác định các điều kiện tối ưu để chiết lectin từ rong B. gelatinus 2.3.5.1 Khảo sát tỷ lệ nguyên liệu:dung môi chiết Tiến hành chiết lectin từ rong B. gelatinus bằng dung dịch ethanol 20 % với các tỷ lệ nguyên liệu:dung môi (w/v): 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, ở nhiệt độ 4 oC và thời gian chiết là 6 giờ. Sau đó, ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch chiết thô (DCT). Xác định hàm lượng protein, hoạt tính tổng số (HTTS) và hoạt tính riêng (HTR) của từng DCT. So sánh, chọn ra tỷ lệ nguyên liệu:dung môi chiết (w/v) thích hợp nhất. Hình 2.3 Bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ nguyên liệu:dung môi chiết thích hợp Rong BG Rửa sạch Thời gian: 6h Nhiệt độ: 4oC 1:3 1:4 1:6 1:5 Xay Chiết Lọc Ly tâm Dịch chiết Tỷ lệ chiết phù hợp Bã Xác định HTTS và hoạt tính riêng 35 2.3.5.2 Khảo sát nồng độ dung môi chiết Tiến hành chiết lectin từ rong Betaphycus gelatinusvới hệ dung môi ethanol các nồng độ khác nhau 0 %; 10 %; 20 %; 30 %; 40 %, với tỷ lệ nguyên liệu: dung môi (w/v) thích hợp, nhiệt độ chiết 4 oC và thời gian chiết 6 giờ. Sau đó, ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút, thu DCT. Xác định hàm lượng protein, HTTS và HTR của từng DCT. So sánh, chọn ra nồng độ dung môi chiết thích hợp. Hình 2.4 Bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ dung môi chiết thích hợp Rong BG Thời gian: 6 giờ Nhiệt độ: 4 OC Rửa sạch Xay nhuyễn Chiết Lọc Ly tâm Dịch chiết Xác định: HTTS và HTR C% dung môi chiết phù hợp Bã 0 % 10 % 20 % 30 % 40 % 36 2.3.5.3 Khảo sát thời gian chiết Tiến hành chiết lectin từ rong Betaphycus gelatinusvới các khoảng thời gian khác nhau: 2, 4, 6, 8 (giờ), với hệ dung môi, tỷ lệ nguyên liệu: dung môi (w/v) thích hợp đã được xác định và nhiệt độ chiết 4 oC. Sau đó, ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút, thu DC. Xác định hàm lượng protein, HTTS và HTR của từng DC. So sánh, chọn ra thời gian chiết thích hợp. Hình 2.5 Bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian chiết thích hợp Lọc Ly tâm Dịch chiết Xác định: HTTS và HTR Nhiệt độ chiết phù hợp Bã 2 giờ 4 giờ 6 giờ 8 giờ Rong BG Rửa sạch Xay nhuyễn Chiết 37 2.3.6 Khảo sát nồng độ tác nhân tủa thích hợp để thu tủa protein- lectin Mỗi loại tác nhân tủa thường có khả năng làm kết tủa protein lectin ở những nồng độ khác nhau và có ảnh hưởng khác nhau đến hoạt tính NKHC sau khi kết tủa. Tiến hành khảo sát khả năng tủa lectin từ DCT bằng tác nhân tủa là ethanol ở các nồng độ khác nhau. Hệ tác nhân tủa khảo sát gồm ethanol được làm lạnh ở nhiệt độ 4oC, với nồng độ % ethanol lần lượt là 70 %, 80 % và 90 %. Thu nhận kết tủa bằng ly tâm hỗn hợp ở 4 oC, tốc độ 6.000 vòng/phút trong 30 phút, hòa tan với dung dịch đệm không muối PB 0,02M; pH= 7,5và đưa về cùng thể tích. Sau đó, tiến hành xác định HTTS, HTR và hiệu suất thu hồi của CPKT, từ đó chọn ra nồng độ tủa thích hợp. 2.3.7 Tinh sạch lectin bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion DEAF- Sepharose Nhựa DEAE – Sepharose là nhựa trao đổi anion yếu. Hỗn hợp mẫu qua cột sắc ký chứa nhiều loại protein với khả năng tích điện tích âm khác nhau, do đó, khả năng liên kết với nhựa cũng sẽ khác nhau. Trong quá trình rửa giải, khi thay đổi nồng độ muối, những protein nào liên kết yếu với cột sẽ bị đẩy ra trước, còn những protein liên kết chặt hơn sẽ bị đẩy ra ở nồng độ muối cao hơn. Lectin từ dịch chiết sau khi kết tủa được thẩm tách từ 2 – 3 lần trong đệm PB 0,05M để loại hoàn toàn lượng muối PBS còn trong dịch tủa. Sau đó, tiến hành tinh sạch bằng sắc ký trao đổi ion với các thông số được thiết lập như sau: - Gel: DEAE – Sepharose - Kích thước cột: 1,6 x 20 cm - Đệm: cacbonat 0,02M; pH = 9,0 (đã loại khí); cacbonat 0,02M, NaCl 0,5M, pH = 9,0 (đã loại khí). - Thể tích mẫu: 5ml - Tốc độ dòng: 5ml/phút - Số lượng phân đoạn: 40 phân đoạn. 38 - Tổng thể tích rửa giải: 345 ml. Xác định hoạt tính ngưng kết hồng cầu của các phân đoạn, từ đó thu nhận các phân đoạn có hoạt tính và tiến hành cô đặc nồng độ bằng màng siêu lọc kích cỡ 10 kDa. Vẽ đồ thị biểu diễn sự tương quan giá trị A280 nm, hoạt tính ngưng kết hồng cầu và thứ tự các phân đoạn. 2.3.8 Tinh sạch lectin bằng phương pháp sắc ký lọc gel Sephacryl S - 200 * Nguyên tắc:Kỹ thuật sắc ký lọc gel dùng để tách những phân tử có khối lượng phân tử khác nhau bằng cách cho chúng đi qua cột gel. Những protein có khối lượng phân tử lớn di chuyển nhanh và ra khỏi cột trước, những protein có khối lượng phân tử nhỏ di chuyển chậm qua lỗ gel và ra khỏi cột sau. * Kỹ thuật:Các thông số tinh sạch bằng sắc ký lọc gel được thiết lập như sau: Gel: SephacrylS - 200 Kích thước cột:đường kính 1cm, chiều cao 30cm Đệm: PB 0,05M NaCl 0,15M; pH = 7 (đã loại khí) Thể tích mẫu:1ml Tốc độ dòng:0,80 ml/phút Thể tích mỗi phân đoạn:2,5ml/phân đoạn Số lượng phân đoạn:52 phân đoạn; 2,5 ml/ống. Rửa cột: dd NaOH 0,2M (v = 0,5 ml/ph), rửa giải 0,5V cột = 65 ml Rửa lại 2V cột với đệm 250 ml (v = 0,8 ml/phút). Xác định hoạt tính NKHC của tất cả các phân đoạn, thu nhận các phân đoạn có hoạt tính và cô đặc nồng độ bằng màng siêu lọc kích cỡ 10 kDa. 2.3.9 Kiểm tra độ tinh sạch và xác định khối lượng phân tử lectin bằng phương pháp điện di SDS-PAGE [117] * Nguyên tắc: SDS - PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) là một kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide khi có sự hiện diện của SDS, đây là một tác nhân làm biến tính các phân tử protein. Trong kỹ thuật này protein được xử lý với SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là 39 mercaptoethanol. Với các tác nhân này protein từ cấu trúc bậc 2, 3, 4 được biến đổi thành chuỗi polypeptide (bậc 1) và tất cả các protein đều được tích điện âm. Nhờ đó, sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thước, những phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thước nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thước nhất định. Dưới tác dụng của điện trường các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. Để xác định khối lượng phân tử của protein, người ta thường so sánh với một thang phân tử lượng chuẩn, là một hỗn hợp các protein có khối lượng phân tử khác nhau đã biết. * Thực hiện: Đổ gel: a/ Gel phân tách 12,5% (Separating gel) Cho các thành phần sau theo thứ tự vào cốc 25 ml sạch: Acrylamide/Bis (15,5/1) : 3,8 ml Tris – HCl 3M; pH 8,8; 0,8 % SDS : 5 ml Glycerine : 2 g Nước cất : 4,2 ml APS 10% : 50 µl TEMED : 5 µl Sau khi cho TEMED vào, khuấy nhẹ, tiến hành đổ gel (tránh tạo bọt khí). Sau đó nhẹ nhàng đặt một lớp nước cất lên trên lớp mặt gel để mặt gel được phẳng. Chờ gel đông (khoảng 2 giờ). b/ Gel cô nồng độ (Stacking gel) Cho các thành phần sau theo thứ tự vào cốc 25 ml sạch khác: Acrylamide/Bis (15,5/1) : 1 ml Tris – HCl 3M; pH 6,8; 0,8 % SDS : 3,1 ml Nước cất : 8,4 ml APS 10% : 100 µl TEMED : 10 µl Sau khi gel phân tách đã trùng ngưng hoàn toàn, đổ hết nước bên trên. Tiến hành đỗ lớp gel gom bằng cách dùng pipetteman bơm dung dịch gel gom vào khuôn. Đồng thời đưa lược vào khuôn để tạo các giếng mẫu (tránh tạo bọt 40 khí trong khuôn gel). Sau khi gel trùng ngưng, tháo lược, lắp đĩa gel vào bộ phận điện di, cho dung dịch điện di vào buồng điện di. c/ Chuẩn bị mẫu: - Mẫu protein thô :200 µg. - Mẫu protein kết tủa : 100 µg. - Mẫu protein sau sắc ký trao đổi ion : 50 µg. - Mẫu protein sau sắc ký lọc gel :30 µg. Tất cả các mẫu được thẩm tách bằng nước cất ở 4 oC để loại bỏ ảnh hưởng của muối, sau đó cho vào ống eppendorf và sấy ở 40 oC đến khô. Thêm vào mỗi ống 15 µl dung dịch đệm mẫu, khuấy đều đến tan hoàn toàn. Đun các ống mẫu ở 100 oC trong 5 phút, có và không có chất khửβ- mercaptoethanol. Sau đó, làm lạnh các ống. d/ Tiến hành chạy điện di Cho 20µl dung dịch mẫu cần kiểm tra vào các giếng. Tiến hành chạy điện di với dòng điện ổn định có hiệu điện thế 100V. Quá trình điện di kết thúc dựa vào sự dịch chuyển của vạch màu xanh (bromophenol) khi cách đáy gel khoảng 1 cm. Sau khi điện di, nhuộm gel với dung dịch nhuộm Coomassie Brilliant Blue R-250, trong 30 phút. Sau đó cho tiến hành tẩy màu bằng cách ngâm gel trong dung dịch giải nhuộm (hỗn hợp methanol: acid acetic: nước). Protein sẽ được phát hiện nhờ các vạch màu xanh lam trên nền gel trong suốt. Xác định trọng lượng phân tử của protein Đo khoảng cách di chuyển của các băng protein từ gel phân tách tới các băng protein và khoảng cách từ gel phân tách tới vạch màu bromophenol (vạch màu cuối cùng). Tính giá trị Rf Rf = Khoảng cách di chuyển của protein lectin Khoảng cách từ gel phân tách đến dung môi (vạch màu Brommophenol) blue 41 Trọng lượng phân tử của các vạch protein có thể xác định thông qua giá trị Rf trên, nhờ phương pháp nội suy theo đồ thị. Dựa vào thang chuẩn trên gel điện di, tiến hành xác định giá trị Rf của từng vạch protein. Kết quả được trình bày trong Bảng 2 (phụ lục B). Từ đó, xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính giữa giá trị Rf và lgM (lg trọng lượng phân tử) của các protein trong thang chuẩn bằng phần mềm Excel (hình 2, phụ lục B) Để kiểm tra lectin là protein hay glycoprotein, sau khi điện di gel được nhuộm với thuốc thử periodic acid-Schiff (PAS) [118]. 2.3.10 Phân tích các yếu tố ảnh hưởng đến đặc tính lý, hóa của lectin từ rong biển B. Gelatinus 2.3.10.1 Phương pháp phân tích ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính ngưng kết hồng cầu [13] Để tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của lectin từ rong đỏ B. gelatinus, ta lấy mỗi 0,5 ml dung dịch chứa lectin thu được sau sắc ký lọc gel cho vào mỗi ống nghiệm, tiến hành đun nóng ở các nhiệt độ khác nhau: 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 oC trong 30 phút. Sau đó làm lạnh nhanh bằng nước đá và kiểm tra lại hoạt tính ngưng kết hồng cầu của các mẫu bằng hồng cầu máu thỏ 2 % đã xử lý trypsin. Các thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần. 2.3.10.2 Phương pháp phân tích ảnh hưởng của pH đến hoạt tính ngưng kết hồng cầu[13] Lấy 0,5 ml mỗi dung dịch chứa lectin thu được sau sắc ký lọc gel thẩm tách qua đêm trong các dung dịch đệm có pH khác nhau: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ở 4 oC. Sau đó, tiến hành thẩm tách ngược lại với dung dịch NaCl 0,15 M trong 4 giờ để loại bỏ ảnh hưởng của pH, lấy phần dịch này đem ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 5 phút. Thu lấy phần dịch trong và tiến hành đo hoạt tính ngưng kết hồng cầu của các mẫu bằng hồng cầu máu thỏ 2 % đã xử lý trypsin. Các thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần. Các dung dịch đệm được sử dụng: + Đệm axetat pH: 3, 4 và 5 axit axetic/natri axetat 42 + Đệm photphat pH: 6 và 7 Na2HPO4.12H2O/NaH2PO4.2H2O + Đệm Tris HCl pH: 8 Tris/HCl + Đệm cacbonat pH: 9 và 10 Na2CO3/NaHCO3 2.3.10.3 Phương pháp phân tích ảnh hưởng của cation hóa trị 2, EDTA đến hoạt tính ngưng kết hồng cầu[13] Lấy 1,0 ml dịch lectin sau sắc ký lọc gel cho tương tác với muối của các ion kim loại hóa trị hai như: Ca2+, Mg2+ ở nồng độ 50 mM. Sau 2 giờ, các mẫu thí nghiệm được xác định hoạt tính ngưng kết hồng cầu và so sánh với mẫu đối chứng (không tương tác với cation hóa trị II và EDTA). Các thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần. 2.3.10.4 Phương pháp phân tích đặc tính liên kết carbohydrate của lectin * Điều chế porcine stomach mucin được xử lý enzyme trypsin Hòa tan 10 mg porcine stomach mucin trong 5 ml dung dịch đệm photphate 20 mM có chứa 150 mM NaCl (pH 7.2). Thêm 5 mg trypsin vào mẫu và ủ ở 37 °C trong 24 giờ. Sau đó hỗn hợp được đun nóng ở 100 °C trong 30 phút để hủy hoạt tính của enzyme và được dùng cũng như chất ức chế (nồng độ cuối cùng 2 mg/ml) [119]. * Phân tích đặc tính liên kết carbohydrate của lectin Đặc tính liên kết carbohydrate được tiến hành theo phương pháp được mô tả trong nghiên cứu của Hori [49], [55]. Tiến hành khảo sát khả năng liên kết carbohydrate của lectin với một số loại đường đơn (monosaccarit) và glycoprotein được liệt kê trong Bảng 2.2. Bảng 2.2 Các loại đường monosaccarit và glycoprotein sử dụng để khảo sát đặc tính liên kết carbohydrate của lectin. Monosaccarit (100 mM) Glycoprotein (2000µg/ml) Glucose N-acetyl D-glucosamin Nitrophenyl glucopyranoside D-galactose Transferrin Asialo- Transferrin Fetuin Asialo- Fetuin 43 N-D-galactosamine N-acetyl D- galactosamine Nitrophenyl galactopyranoside Mannose N-D-manosamine N-acetyl-D-manosamine Nitrophenyl manopyranoside D-glucosamine Xylose N-acetyl neulaminic acid Yeast mannan Porcine thyroglobulin Porcine stomach mucin Asialo- Porcine stomach mucin Porcine stomach mucin (PSM) xử lý Trypsin Tiến hành: Sử dụng đĩa 96 giếng đáy chữ V. Cho 25µl NaCl 0,85% vào các giếng. Cho 25µl dung dịch đường hoặc glycoprotein vào giếng số 1 và số 2, rồi pha loãng 2 lần theo từng hàng bắt đầu từ giếng số 2. Cho 25µl dung dịch lectin vào mỗi giếng. Lắc nhẹ và giữ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Sau 1 giờ, cho 25µl huyền phù hồng cầu thỏ đã xử lý trypsin vào mỗi giếng. Lắc nhẹ, giữ ở nhiệt độ phòng. Sau 2 giờ, đọc kết quả. Đọc kết quả: Nếu hoạt tính NKHC của lectin không thay đổi: Lectin không có khả năng liên kết với đường hoặc glycoprotein được kiểm tra. Nếu hoạt tính NKHC của lectin giảm: Lectin đã liên kết với đường hoặc glycoprotein được kiểm tra. Nồng độ nhỏ nhất của đường (mM) hoặc glycoprotein (2.000 µg/ml) mà tại đó hiện tượng NKHC do lectin gây ra bị ức chế hoàn toàn (nghĩa là lectin đã liên kết với đường hoặc glycoprotein kiểm tra), được tính theo công thức: Trong đó: Cmin: Nồng độ phản ứng nhỏ nhất của đường (mM) hoặc glycoprotein (µg/ml) mà tại đó hiện tượng NKHC do lectin gây ra bị ức chế hoàn toàn. 44 C: Nồng độ của đường và glycoprotein (Nồng độ đường: 100mM; Nồng độ glycoprotein: 2000µg/ml). HI: Giá trị nồng độ pha loãng mà tại đó hoạt tính NKHC vẫn còn bị ức chế, sau khi lectin đã liên kết với đường hoặc glycoprotein. 45 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 SÀNG LỌC HOẠT TÍNH NGƯNG KẾT HỒNG CẦU CỦA DỊCH CHIẾT TỪ RONG ĐỎ B.GELATINUS Dịch chiết thô từ rong đỏ B. gelatinus đã ngưng kết mạnh với các hồng cầu thỏ, cừu và gà đã được xử lý với enzyme trypsin, nhưng không cho thấy sự ngưng kết với các dạng hồng cầu máu người A, B và O, ngay cả khi hồng cầu được xử lý enzyme (Bảng 3.1). Bảng 3.1 Sàng lọc hoạt tính ngưng kết hồng cầu của dịch chiết thô từ rong đỏ B. gelatinus với các dạng hồng cầu khác nhau Sự chuẩn độ ngưng kết hồng cầu với các dạng hồng cầu Thỏ Cừu Gà Nhóm máu A Nhóm máu B Nhóm máu O NT P N T P N T P N T P N T P N T P - 128 128 - 128 128 - 32 32 -d - - - - - - - - N Hồng cầu tự nhiên; T Hồng cầu được xử lý enzyme trypsin; P Hồng cầu được xử lý enzyme papain; dKhông có sự ngưng kết hồng cầu. Kết quả nghiên cứu này tương thích với các kết quả nghiên cứu đã được công bố về sự ngưng kết với hồng cầu động vật ưu tiên hơn hồng cầu người của các dịch chiết lectin từ rong biển [13], [15], [35], [37], [40], [41], [46]. 3.2 CÁC ĐIỀU KIỆN ĐỂ CHIẾT LECTIN TỪ RONG B. GELATINUS 3.2.1 Tỷ lệ dung môi chiết Tiến hành chiết lectin từ rong B. gelatinus bằng dung dịch ethanol 20 % với các tỷ lệ nguyên liệu:dung môi (w/v)lần lượt là 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, ở nhiệt độ 4 oC, thời gian chiết 6 giờ. Ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch chiết. Xác định hoạt tính tổng số (HTTS) và hoạt tính riêng (HTR) của lectin. Kết quả được trình bày ở bảng 3 (phụ lục C) và hình 3.1. 46 Hình 3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi chiết đến hoạt tính tổng số và hoạt tính riêng của lectin. Hoạt tính tổng số ( ) và hoạt tính riêng ( ). Từ thí nghiệm trên, có thể nhận thấy thể tích dung môi dùng để tách chiết có ảnh hưởng đến hiệu suất tách chiết và hoạt tính NKHC của dịch chiết từ rong B. gelatinus. Nhìn chung, khi tăng thể tích dung dịch đệm thì HTTS tăng (từ 10 lên 16,8 HU) và HTR cũng tăng dần (từ 4,278 lên 7,619 HU/mg). Vì lúc này quá trình khuếch tán của protein lectin vào trong dung dịch đệm cũng tăng lên, làm tăng khả năng NKHC, nên HTTS và HTR đều tăng. Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng lượng dung dịch đệm lên quá cao (tỷ lệ nguyên liệu: dung dịch đệm (w/v) = 1:6) thì hoạt tính NKHC lại giảm, vì lúc này một lượng protein không có hoạt tính NKHCcũng sẽ khuếch tán ra ngoài và làm ảnh hưởng đến hoạt tính NKHC của dịch chiết nên HTTS và HTR đều giảm (HTTS:10,8 HU; HTR:6,780 HU/mg). Kết quả từ hình 3.1 cho ta thấy, ở tỷ lệ nguyên liệu: dung dịch đệm (w/v) là 1:5 thì HTTS và HTR đều đạt cực đại (16,8 HU và 7,619 HU/mg). Vì vậy chúng tôi chọn tỷ lệ này cho các thí nghiệm tiếp theo. 47 3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến quá trình chiết Tiến hành chiết lectin từ rong B. gelatinusvới dung môi ethanol, tỷ lệ nguyên liệu:dung môi (w/v) 1:5, nhiệt độ chiết 4 oC và thời gian chiết 6 giờ. Sau đó, ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút, thu DC. Xác định HTTS và HTR của từng DC. Kết quả được trình bày ở bảng 4 (phụ lục C) và hình 3.2. Hình 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hoạt tính tổng số và hoạt tính riêng của lectin. Hoạt tính tổng số ( ) và hoạt tính riêng ( ). Kết quả từ bảng 4 (phụ lục C) và hình 3.2 cho thấy, khi tăng dần nồng độ ethanol từ 0 % đến 20 % thì hoạt tính NKHC của DC cũng tăng lên, ở nồng độ ethanol 20 % thì HTTS và HTR đều đạt cực đại (640 HU; 264,5 HU/mg). Nếu tiếp tục tăng nồng độ ethanol lên 40 % thì HTTS giảm, HTR cũng giảm dần. Từ kết quả trên có thể thấy, để chiết protein lectin ra khỏi DC đạt hiệu quả tốt chúng tôi sẽ sử dụng ethanol 20 %. Vì ở nồng độ ethanol thấp (0- 10 %), protein lectin không có khả năng khuếch tán ra bên ngoài; trong khi đó ở nồng độ ethanol quá cao (>40 %) hàm lượng protein-lectin tan vào dung dịch sẽ giảm, dẫn đến giảm khả năng NKHC của lectin. 48 3.2.3 Ảnh hưởng của thời gian chiết Tiến hành chiết lectin từ rong B. gelatinus với các khoảng thời gian khác nhau: 2, 4, 6, 8 (giờ) bằng dung môi ethanol 20 %, tỷ lệ nguyên liệu: dung môi (w/v) 1:5 và nhiệt độ chiết 4 oC. Sau đó, ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút, thu DC. Xác định HTTS và HTR của từ