Luận văn Tuyển chọn và nghiên cứu các đặc tính sinh học của một số vi sinh vật nhằm sản xuất phân vi sinh

uất một cách rất có ý nghĩa. 1.2.2. Vi sinh vật phân giải lân 11 Photpho là nguyên tố quan trọng thứ 2 trong 3 nguyên tố dinh dưỡng đa lượng chính của cây trồng (N, P,K), là thành phần của axit nucleic, phytin, photpholipit. Photpho có tác động trực tiếp đến quá trình tích lũy đường, protein, lipid, vitamin của cây trồng. Đặt biệt photpho là thành phần không thể thiếu của ATP, ADP, AMP (phân tử trao đổi năng lượng), kiểm soát, điều khiển quá trình trao đổi năng lượng của cây (hô hấp, quan hợp..). Photpho có tác dụng thúc đẩy phát triển và tăng khả năng chống chịu của cây trồng. Thiếu photpho, sự hình thành tế bào mới bị chậm lại, cây còi cọc ít phân cành, đẻ nhánh, lá có màu xanh lục bẩn, không sáng. Thiếu photpho, năng suất cây trồng bị giảm sut nghiêm trọng, ngay cả khi được cung cấp đủ nitơ. Sự xuất hiện, tồn tại và chuyển hóa của photpho trong tự nhiên diễn ra theo một quy trình khép kín gọi là vòng tuần hoàn của photpho thông qua 4 quá trình (khoáng hóa, cố định sinh học, cố định hóa học và phân giải). Theo như các nghiên cứu cây trồng chỉ có thể hấp thu 5 - 25% lượng lân được bón, số còn lại bị đất giữ lại dưới dạng hấp phụ hoặc cố định, trong đó hấp phụ thông qua trao đổi ion sẽ trở thành dạng tan, còn cố định thì không thể chuyển đổi thông qua ion trao đổi. VSV phân giải lân, VSV chuyển hóa lân (Phosphate Solubilizing Microorganisms – PSM) là các VSV có khả năng chuyển hóa hợp chất photpho khó tan thành dạng dễ tiêu cho cây trồng sử dụng. Các VSV phân giải hợp chất photpho khó tan được biết đến nay là các loài: Pseudomonas, Micrococus, Bacillus, Flavobacterium, Penicillium, Sclerotium, Aspergillus. Các VSV này không chỉ phân giải photphat canxi mà cả photphat nhôm, sắt, mangan và các dạng khác kể cả quặng. 1.2.3. Vi sinh vật phân giải xenlulo Thủy phân xenlulo bởi enzyme từ vi sinh vật là bước quan trọng trong chu trình carbon. Mặc dù có một lượng rất lớn xenlulo nhưng chỉ một phần trăm rất nhỏ vi sinh vật có khả năng phân giải vì sự cứng cáp của thành tế bào. Có ít nhất năm cơ chế riêng biệt được sử dụng ở những loài vi sinh vật khác nhau nhằm phân giải xenlulo với sự có mặt của enzyme cellulase. Không chỉ đóng góp vai trò trong chu trình carbon tự nhiên, vi sinh vật phân giải xenlulo còn có tiềm năng lớn trong việc phân hủy xenlulo trong nước ô nhiễm (Hubbe và cs 2012; Hubbe và cs 2013)[10,11] và chuyển hóa 12 xenlulo thành nhiên liệu sinh học thay thế nhiên liệu hóa thạch (Falter và cs 2015; Wang và cs 2011)[12,13]. Đã có nhiều nghiên cứu được tiến hành để phân lập dòng vi sinh vật sản sinh enzyme phân giải xenlulo và khả năng phân giải xenlulo của chúng. Các vi sinh vật phân giải xenlulo chủ yếu được phân lập từ hệ tiêu hóa động vật ăn cỏ như bò, cừu, dê (Oyeleke và Okusanmi, 2008)[14], và côn trùng như bọ cánh cứng, mối (Huang và cs 2012; Hu và cs 2014)[15,16]. Ngoài ra chúng còn được tìm ra trong phân ủ, phân hữu cơ, bùn từ nước thải (Bayer và cs 2004)[17]. Nhóm vi khuẩn phân giải xenlulo bao gồm Clostridium, Bacteroides sucinogenes, Butyrivibrio fibrisolvens, Ruminococcus albus, Methanobrevibacter ruminatium, Siphonobacter aquaeclarae, Cellulosimicrobium funkei, Paracoccus sulfuroxidans, Ochrobactrum cytisi, Ochorobactrum haematophilum, Kaistia adipata, Desvosia riboflavia, Labrys neptuniae, Ensifer adhaerens, Shinella zoogloeoides, Citrobacter freundii, và Pseudomonas nitroreducens. Các loài này phần lớn thuộc nhóm vi sinh vật kị khí, chúng được phân lập chủ yếu từ ruột của những loài động vật sử dụng gỗ làm nguồn thức ăn (Huang và cs 2012; Milala và cs 2005; Schwarz 2001)[18,19]. Trong đất người ta cũng phân lập được các dòng vi khuẩn Gram (+) hiếu khí như Brevibacllus, Paenibacillus, Bacillus, và Geobacillus. Đối với các dòng ưa ấm, pH và nhiệt độ tối thích cho enzyme carbonmethyl cellulase của chúng hoạt động là 5,5 và 55 oC, còn đối với các dòng ưa nhiệt là pH 5,0 và nhiệt độ 75oC (Rastogi và cs, 2009)[20]. Xạ khuẩn (Actinomycetes) là vi khuẩn Gram (+) có dạng sợi như nấm. Chúng là vi sinh vật hiếu khí có mặt khắp nơi trong tự nhiên. Xạ khuẩn rất giàu G+C chiếm 57-75 % (Lo và cs, 2002)[21] chúng chiếm ưu thế trong đất phèn khô (Jeffrey, 2008)[22]. Xạ khuẩn còn được biết đến nhiều bởi các sản phẩm chuyển hóa bậc hai, nổi bật là các loại kháng sinh như streptomycin, gentamicin, rifamycin và erythomycin. Ngoài ra, xạ khuẩn còn có vai trò quan trọng trong công nghiệp dược phẩm cũng như trong nông nghiệp. Streptomyces là giống chủ đạo trong xạ khuẩn, đây cũng là vi sinh vật sản sinh cellulase được quan tâm nghiên cứu. Một số loài đáng chú ý thuộc giống này như Streptomyces reticuli, Streptomyces drozdowiczii, 13 Streptomyces lividans (Kluepfel và cs, 1986; Schrempf và Walter, 1995)[. Thermoactimnomyces được tìm thấy trong trầm tích đại dương, Streptosporangium trong quặng apatit cũng là những loài có khà năng phân hủy xenlulo (Chang và cs, 2009; Veiga và cs,1983)[23,24]. Nấm là sinh vật có cơ chế sinh hóa độc đáo trong phân giải cơ chất tạo những sản phẩm bậc hai đặc biệt, đây là nhóm được nghiên cứu nhiều nhất trong lĩnh vực phân hủy xenlulo. Các cellulase từ nấm thường có hoạt lực cao và dường như không có các dạng vật lý phức tạp như enzyme này từ vi khuẩn. Acremonium spp., Chaetomium spp., Trichoderma reesei, Trichoderma viride, penicillium pinophilum, Phanerochaete chrysosporium, Fusarium solani, Talaromyces emersonii, Trichoderma koningii, Fusarium oxysporium, Aspergillus niger, Aspergillus terreus and Rhizopus oryzae có vai trò quan trọng trong quy trình phân hủy xenlulo ở nhiều môi trường khác nhau (Yang và cs, 2011; Shahriarinour và cs, (2011)[25,26]. 1.2.4. Vi sinh vật sinh hocmon sinh trưởng thực vật Một số nghiên cứu cho thấy có sự tổng hợp ACC deaminase (1- aminocyclopropane-l-carboxylate deaminase) từ các vi khuẩn kích thích sinh truởng thực vật ở vùng rễ như: Methylobacterium sp., Alcaligenes spp. Bacillus pumilus, Enterbacer cloacae, burkholderia cepacia, Pseudomonas putida, Pseudomonas spp.và Variovoraxparadoxus . Cơ chế này đuợc lý giải là do ACC có khả năng làm giảm ethylen trong rễ mà ethelen này ức chế sự sinh trưởng của rễ) do đó kích thích rễ phát triển. Phytohormone tác động kích thích lên sinh trưởng thực vật. Phytohormone phổ biến nhất là auxin indole-3-acetic acid (IAA), đã có nhiều nghiên cứu về sự sản xuất auxin này ở các loài vi khuẩn như: Azospirillum brasilense, Aeromonas veronii, Agrobacterium sp., Alcaligenes piechaudii, Bradyrhizobium spp., Comamonas acidovorans, Enterobacter sp., và Rhizobium leguminosarưm. Một số quan sát cho thấy rằng vi khuẩn Methylobacterium sống cộng sinh trên thực vật mà không gây bệnh cho cây chủ, nguợc lại chúng còn có khả năng hỗ trợ cây chủ phát triển rất tốt. Năm 2004, Omer và cộng sụ đã khảo sát sự hiện diện của IAA trong môi truờng chứa dịch nuôi cấy vi khuẩn 14 biến dưỡng methyl. Qua đó, phát hiện thấy có 3 trong 16 chủng phân lập có phản ứng duơng tính với với thuốc thử Salkowski. Điều này đuợc chứng minh rõ hơn bằng phương pháp sắc lý lỏng cao áp (HPLC) kết hợp với phân tích phổ NMR (nuclear Mangnetic Radiation: cộng hưởng từ hạt nhân). Ba chủng tạo ra IAA có hàm luợng phytohormone từ 6 - 13,3 mg/1 nếu bổ sung L-tryptophan (L-TRP). Khi không bổ sung L-TRP thì nồng độ IAA tạo ra chỉ từ 1.1-2,4 mg/1. Các kết quả này đã gây đuợc sụ chú ý lớn. 1.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU, ĐỊNH DANH VI SINH VẬT Định danh vi sinh vật cần phải khảo sát các đặc điểm hình thái và các đặc điểm sinh lí, sinh hóa của vi sinh vật. Đồng thời, phương pháp sinh học phân tử giải trình tự đoạn gen đặc trưng của vi sinh vật cũng được tiến hành để cho kết quả nhanh chóng và chính xác. Phương pháp truyền thống: Việc phân loại vi khuẩn được thực hiện đầu tiên vào năm 1987, khi Ferdinad Cohn phân nhóm vi khuẩn dựa vào hình dạng tế bào. Mặc dù phưomg pháp phân loại dựa vào hình thái sớm cho thấy không có hiệu quả trong phân loại, nhưng hình thái và đặc điểm cấu trúc hiển vi vẫn có vai trò quan trọng trong định danh vi sinh vật, đặc biệt là trong việc định danh các chủng mới. Phương pháp truyền thống để định danh vi sinh vật thường dựa vào các chỉ tiêu phân loại như: đặc điểm hình thái, sinh lý, đặc điểm biến dưỡng năng lượng. Trong đó các thử nghiệm để xác định các đặc điểm sinh lý, sinh hóa là các chỉ tiêu quan trọng nhất. Thông thường để định danh các loài vi khuẩn mục tiêu theo phương thức truyền thống, người ta thường dựa vào các khóa phân loại, trong đó khóa phân loại Prokaryote đầy đủ nhất, được sử dụng rộng rãi là khóa phân loại Bergey (Bergey ’s Manual of Systematic Bacteriology)[27]. Riêng đối với nấm men việc định danh theo phương thức truyền thống rất phức tạp. Từ trước đến nay có rất nhiều khóa phân loại nấm men của nhiều tác giả khác nhau. Hansen là người đưa ra khóa phân loại nấm men đầu tiên. Trong khóa phân loại này, Hansen chia nấm men thành 8 giống. Sau Hansen, Klocker (1907), Guilliermond (1920) cũng đã tiến hành chỉnh sữa khóa phân loại của Hansen, nhưng chưa được hoàn thiện. Đến năm 1952, J. Lodder và Kreger-van rij đã tổng kết lại một cách khá hoàn thiện vấn đề 15 phân loại nấm men và xuất bản một tài liệu rất có giá trị (J. Lodder and N.J.W.Kreger-Van Rij, 1952), được xuất bản lần thứ hai năm 1957. Năm 1970, J. Lodder bổ sung sửa chữa lại và in tái bản lần thứ nhất năm 1970, lần thứ hai 1971. Đây là tài liệu phân loại nấm men rất có giá trị và và là khóa phân loại thông dụng nhất hiện nay trên thế giới. Hệ thống phân loại này dựa trên kiểu phân chia tế bào, hình thái bào tử nang và đã xác định 349 loài nấm men thuộc 39 chi khác nhau. Phương pháp hiện đại: Ngày nay, sự phát triển của các kỹ thuật sinh học hiện đại đã đưa việc phân loại, định danh vi sinh vật lên một bước phát triển mới. Phương pháp hiện đại trong định danh vi sinh vật dựa trên vật liệu di truyền có thể cho kết quả chính xác trong một thời gian ngắn. Tuy nhiên, phương pháp phân loại hiện đại này đòi hỏi phải có trang thiết bị hiện đại và hóa chất đắt tiền. Năm 1967, Zucker Kank và Pauling đã cho rằng các phân tử sinh học có thể là “tài liệu của lịch sử tiến hóa”, là “thước đo tiến hóa”. Phân tử rRNA 16S ở prokaryote và 18S ở eukaryote (riêng nấm men thì trình tự đoạn D1/D2 26s rRNA và vùng ITS 5.8S rRNA được sử dụng phổ biến để xây dựng cây phát sinh chủng loài) là một công cụ hữu ích trong phân loại và định danh vi sinh vật. Ngoài đặc điểm là hiện diện trong tất cả các sinh vật, có chức năng không đổi, phân tử rRNA 16S còn có ưu điểm là có nhiều bản sao trong tế bào, có tính bảo tồn cao nhưng vẫn có những vùng trình tự khác biệt giữa các loài và trình tự đặc trưng từng nhóm vi sinh vật; đặc biệt là thích hợp với mục tiêu phân loại nhờ có kích thước vừa phải (khoảng 1500 ribonucleotide), thuận tiện cho việc giải trình tự. Phương pháp hiện đại dùng đế định danh vi sinh vật bên cạnh việc dựa vào trình tự rRNA, các trình tự rDNA (trình tự mã hóa cho rRNA) cũng thường được sử dụng, vì DNA là vật liệu dễ thu nhận và có tính bền cao hơn RNA. Một số phương pháp phân loại dựa vào vật liệu di truyền đang được sử dụng hiện nay: dùng mẫu dò kết hợp vói phương pháp lai in-situ phát huỳnh quang (Fluorescence ỉn-sừu Hybridazation - FISH). Mẫu dò là một trình tự acid nucleic, thường là một đoạn mạch đơn của acid nucleic (DNA) được gắn với một nhân tố nhận biết là phóng xạ hay chất phát huỳnh quang, dùng đế nhận biết trình tự nucleotide đặc trưng (trình tự nhận diện) của một chủng vi sinh vật đã biết trước. Phân tích dữ liệu các trình tự 16 ssu rRNA (Small Subunit rRNA) đã biết sẽ cho phép xác định các trình tự nhận diện chuyên biệt cho từng giới. Một số trình tự nhận diện cho một nhóm chuyên biệt chuyên biệt trong giới, thậm chí một giống, một loài cũng đã được xác định. Trong tương lai, nhiều trình tự tương tự được xác định và sẽ rất hữu dụng trong việc nhận diện, định danh một vi sinh vật mới. Các trình tự nhận diện chuyên biệt cho vi khuẩn có thể được tổng hợp, đánh dấu bằng chất phát huỳnh quang và dùng để phát hiện chuyên biệt các giới này. Các mẫu dò này được gọi là “mẫu dò phát sinh chủng loại” (phylogenic prode). Bằng việc xử lý mẫu chứa vi sinh vật bằng một tác nhân thích hợp làm tăng tính thấm của màng, cho phép mẫu dò vào bên trong tế bào, thực hiện phương pháp lai phân tử (lai in-situ, tức là lai trực tiếp trên tế bào mẫu), và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang, người ta có thể xác định trực tiếp chủng thuần thuộc giới nào hay quần xã vi sinh vật hiện diện trong một mẫu tự nhiên gồm những giới nào. Kỹ thuật lai và phát hiện này được gọi là phương pháp lai in-situ huỳnh quang (FISH). 17 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU - Mẫu đất thu thập tại các ruộng lúa, ruộng mía ở tỉnh Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh. - Các môi trường sử dụng phân lập và nuôi cấy vi sinh vật. - Các cặp mồi 27F (GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG) và 1495R (CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA) 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phân lập và lưu giữ các chủng vi sinh vật từ mẫu đất - Phân lập, lưu giữ các chủng vi sinh vật có ích từ mẫu đất thu thập tại các tỉnh Thanh Hóa, Nghệ An, Hà tĩnh. 2.2.2. Tuyển chọn và đánh giá các hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật có ích - Xác định định tính hoạt tính CMC- aza (Williams, 1983) đối với chủng vi sinh vật có khả năng phân giải xenlulo. - Xác định khả năng cố định nitơ của vi sinh vật: Định lượng khả năng cố định Nitơ bằng phương pháp Kjeldahl (theo Ridvan Kizilkaya, 2009). - Xác định định tính khả năng phân hủy phốtpho vô cơ (theo TCVN 8565:2010), lựa chọn sơ bộ dựa trên độ lớn và độ trong của vòng phân hủy. - Xác định khả năng tạo IAA thổ của các chủng vi sinh vật theo phương pháp đo màu được tạo thành với thuốc thử Van Urk Salkowski trong phương pháp của Salkowski. 2.2.3. Định danh chủng vi sinh vật phân giải xenlulo - Sử dụng sinh học phân tử để định danh chủng vi sinh phân giải xenlulo dựa trên kết quả giải trình tự của gen 16S rRNA đặc trưng cho loài. 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Phương pháp phân lập và lưu trữ các chủng vi sinh vật 18 Pha loãng mẫu và cấy trên môi trường đĩa thạch: Bước 1: Cân 10 g mẫu (phân compost, rác thải, đất) cho vào cối sứ nghiền nhỏ, sau đó cho vào bình tam giác chứa 90 ml nước muối sinh lý đã được khử trùng. Bước 2: Lắc trên máy lắc trong thời gian 30 phút, sau đó để lắng. Ta có dung dịch mẫu pha loãng 10-1 lần. Bước 3: Dùng pipetman hút 1ml dịch huyền phù ở độ pha loãng10-1 đưa vào ống nghiệm chứa 9 ml nước cất vô trùng. Trộn đều ta có dịch pha loãng 10-2 lần. Bước 4: Dùng pipetman hút 0,1 ml (100 µl) dịch huyền phù ở độ pha loãng10-2 đưa vào ống epppendorf chứa 0,9 ml nước cất vô trùng. Trộn đều ta có dịch pha loãng 10-3 lần. Tiếp tục làm như trên, ta có một loạt độ pha loãng dịch mẫu khác nhau như ý. Bước 5: Lấy 0,1 ml dịch ở các nồng độ từ 10-4 đến 10-6 nhỏ và dàn đều trên đĩa petri chứa môi trường GauzeI và Hans. Để trong tủ ấm ở nhiệt độ 28oC, 37oC hoặc cao hơn (nếu muốn phân lập VSV chịu nhiệt) trong 24h-48h sao cho có thể thấy rõ các khuẩn lạc riêng biệt. Bước 6: Các khuẩn lạc có hình dạng, màu sắc khác nhau được tách riêng, làm thuần và giữ trong ống nghiệm để sử dụng cho các thí nghiệm sau. Các môi trường nuôi cấy trong nghiên cứu: Môi trường NA: Meat extract 1g; Yeast extract 5g; pepton 5g; NaCl 5g. Môi trường Ashby: Glucoze 20g ; K2HPO4 0,2g ; MgSO4.7H2O 0,2g ; NaCl 0,2g ; K2SO4 0,1g ; CaCO3 5g; Thạch 20g ; Nước cất 1000ml ; pH 7 - 7,2. Môi trường King B: Yeast extract 5g; pepton 20g; glyxerin 5 ml; K2HPO4 (12,5%) 12 ml; MgS04.7H20 (6,25%) 25 ml; nước cất 1000 ml. pH 7. Môi trường Pikovskaia: Glucoza 10g; yeast extract 0,5g; K2HPO4 o,5g; MgSO4 0,3g; Ca3(PO4)2 5g; dung dịch vi lượng 2ml; nước cất 1000ml. pH 7. 19 Môi trường AT: CaCO3 20g; Glucoza 20g; K2HPO4 0,8g; MgSO- 4.7H2O 0,5g; KH2PO4 0,2g; FeCl3.6H2O 0,1g; Na2MoO4.2H2O 0,05g; nước cất 1000ml. pH 7. Môi trường Hans: K2HPO4: 0,5g; KH2PO4: 0,5g; (NH4)2SO4: 1g; MgSO4.7H2O: 0,1g; CaCl2: 0,1g; NaCl: 6g; Cao nấm men: 0,1g; CMC: 0,1g; Thạch: 12g; H2O: 1.000ml; pH=7. Môi trường Gauze I: để phân lập và nhân sinh khối xạ khuẩn phân giải xenlulo K2HPO4: 0,5g; KH2PO4: 0,5g; MgSO4.7H2O: 0,5g; NaCl: 0,5g; KNO3: 1g; FeSO4.7H2O: 0,01g; Tinh bột tan: 20g; thạch: 12g; H2O: 1000ml; pH=7. Môi trường gluco peptone agar (GPA): 1000ml; NaCl: 5g; Pepton: 10g; pH= 7,5. Môi trường PDA: Glucoza: 20.0 g; Khoai tây: 200.0 g; Thạch: 15 g nước cất 1000 ml; pH=7. Môi trường CMC đặc: CMC: 1g; Thạch: 12g; H2O: 1.000ml. Dung dịch nước muối sinh lý: NaCl: 0,85g; nước cất: 100ml 2.3.2. Phương pháp xác định định tính hoạt tính CMC- aza (Williams, 1983). Sinh khối các chủng vi sinh vật sau khi nuôi cấy 48h được li tâm lắng gạn bỏ phần cặn lắng và nhỏ 1ml vào các lỗ thạch đã được chuẩn bị sẵn trên các đĩa Petri chứa môi trường CMC đặc (CMC: 1g; Thạch: 12g; H2O: 1.000 ml). Lưu giữ đĩa thạch trong tủ ấm 24 h, sau đó lấy ra và tráng bề mặt thạch bằng dung dịch lugol. Hoạt tính sinh học được xác định bằng kích thước vòng phân giải, vòng tròn trong suốt bao quanh lỗ thạch ((hiệu số giữa đường kính vòng tròn trong suốt (D) và đường kính lỗ thạch (d). 2.3.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính cố định nitơ của vi sinh vật Phương pháp so màu với thuốc thử Nessler theo Lê Văn Khoa (1996). Phương pháp xác định khả năng cố định nitơ của vi sinh vật: Định lượng khả năng cố định N bằng phương pháp Kjeldahl (theo Ridvan 20 Kizilkaya, 2009), sau khi nuôi cấy vi khuẩn Azotobacter trên môitrường Ashby dịch thể trong 72 giờ. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm nuôi cấy và hình thái theo Nguyễn Lân Dũng (1998). 2.3.4. Phương pháp tuyển chọn vi sinh vật phân giải phốt pho Lấy 10 g mẫu cho vào cối sứ nghiền nhỏ và đưa vào bình tam giác có chứa 90 ml nước cất vô trùng (độ pha loãng 10-1) lắc bằng máy lắc ở tốc độ 100 vòng/phút trong 15 phút. Hút 0,5 ml dịch cho vào ống nghiệm có chứa 4,5 ml nước cất vô trùng ta được nồng độ pha loãng 10-2. Tiếp tục làm như vậy cho tới khi thu được độ pha loãng thích hợp. Lấy pipet vô trùng hút 0,1 ml dịch huyền phù từ các ống nghiệm có độ pha loãng thích hợp cho vào đĩa Petri có chứa môi trường Pikowskia. Gạt đều và ủ ở 30oC trong vài ngày cho tới khi xuất hiện khuẩn lạc. Với mỗi độ pha loãng cấy ra 3 đĩa. Sau khi xuất hiện khuẩn lạc trên các đĩa, đếm số khuẩn lạc vi sinh vật có vòng bao quanh. Đây chính là các vi sinh vật có khả năng phân giải các hợp chất phốt pho vô cơ khó tan. Đồng thời đếm tổng số VSV có trên các môi trường tổng số để tính tần số bắt gặp vi sinh vật có khả năng phân giải các hợp chất phốt pho vô cơ khó tan. Các khuẩn lạc này chưa đảm bảo thuần khiết về mặt di truyền và giữ mức độ ổn định hoạt tính cho nên cần phải giữ chúng trong các ống nghiệm giữ giống để làm sạch.Để làm sạch dùng que cấy vô trùng lấy một vòng que cấy sinh khối của giống cần làm sạch cho vào ống nghiệm chưa 4,5 ml nước cất vô trùng. Trộn đều và pha loãng tiếp cho đến khi đạt được độ pha loãng thích hợp. Hút 0,1 ml dịch huyền phù từ các độ pha loãng thích hợp nhỏ vào đĩa pettri có chứa môi trường Pikowskia gạt đều và ủ cho đến khi xuất hiện khuẩn lạc. Giữ các khuẩn lạc riêng rẽ có vòng trong bao quanh trong ống nghiệm giữ giống và tiếp tục làm sạch cho đến khi thu được giống thuần khiết. Cấy truyền những khuẩn lạc có vòng phân hủy sang ống nghiệm thạch nghiêng để giữ giống. Đánh giá hoạt tính phân giải phốt phát của vi sinh vật (theo TCVN 8565:2010), Lựa chọn sơ bộ dựa trên độ lớn và độ trong của vòng phân hủy. Cấy các chủng đã phân lập được trên môi trường dịch thể có thành phần giống như thành phần môi trường phân lập không có thạch. Mỗi chủng 21 cấy vào 1 ống nghiệm chứa 5ml môi trường với một lượng cấy tương đối bằng nhau (1 vòng que cấy), nuôi cấy trên máy lắc 24h. Dùng micropipet cấy dịch vi sinh vật trên môi trường thạch có thành phần giống như môi trường phân lập thành những giọt nhũ riêng rẽ. Nuôi cấy trong tủ ấm và quan sát vòng phân hủy. Lựa chọn những chủng có vòng phân hủy to và rõ. 2.3.5. Phương pháp phân lập vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vật Bước 1: Cân 10 g mẫu (đất) cho vào cối sứ nghiền nhỏ, sau đó cho vào bình tam giác chứa 90 ml nước muối sinh lý đã được khử trùng. Bước 2: Lắc trên máy lắc trong thời gian 30 phút, sau đó để lắng. Ta có dung dịch mẫu pha loãng 10-1 lần. Bước 3: Dùng pipetman hút 1ml dịch huyền phù ở độ pha loãng10-1 đưa vào ống nghiệm chứa 9 ml nước cất vô trùng. Trộn đều ta có dịch pha loãng 10-2 lần. Bước 4: Dùng pipetman hút 0,1 ml (100 µl) dịch huyền phù ở độ pha loãng10-2 đưa vào ống epppendorf chứa 0,9 ml nước cất vô trùng. Trộn đều ta có dịch pha loãng 10-3 lần. Tiếp tục làm như trên, ta có một loạt độ pha loãng dịch mẫu khác nhau như ý. Bước 5: Lấy 0,1 ml dịch ở các nồng độ từ 10-4 đến 10-6 nhỏ và dàn đều trên đĩa petri chứa môi trường KingB. Để trong tủ ấm ở nhiệt độ 280C, 370C trong 24h-48h sao cho có thể thấy rõ các khuẩn lạc riêng biệt. Bước 6: Các khuẩn lạc có hình dạng, màu sắc khác nhau được tách riêng, làm thuần và giữ trong ống nghiệm để sử dụng cho các thí nghiệm sau. Xác định khả năng sinh tổng hợp IAA thô: Đo hoạt tính kích thích sinh trưởng thực vật của các chủng vi sinh vật phân lập bằng phương pháp Salkowski cải tiến (Misra và cs, 1989) sử dụng để xác định khả năng sinh tổng hợp IAA thô. + Vi sinh vật được nuôi cấy kỵ ánh sáng trên máy lắc tốc độ 150 vòng/phút ở nhiệt độ 300C trong 48h trên môi trường nuôi cấy chuẩn có bổ sung tryptophan 0,1% (1g/1000ml môi trường). 22 + Lấy 2ml dịch vi khuẩn đã ly tâm 3000 vòng/phút và bổ sung thêm 8ml thuốc thử Salkowski cải tiến. Quan sát thấy thuốc thử Salkowski cải tiến sẽ cho màu hồng nhạt đến đỏ phụ thuộc hàm lượng IAA thô được sinh ra. Thuốc thử Salkowski: FeCl3 0,5M: 15ml H2SO4 98%: 300ml Nước cất: 500ml Định lượng xác định hàm lượng IAA thô được sinh ra: Hàm lượng IAA thô sinh ra được xác định theo phương pháp so màu ở bước sóng 530 nm với đồ thị chuẩn IAA. + Vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp IAA thô (đã xác định theo phương pháp định tính ở trên) được nuôi cấy kỵ ánh sáng trên máy lắc tốc độ 150 vòng/phút ở nhiệt độ 300C trên môi trường nuôi cấy chuẩn có bổ sung tryptophan 0,1%. Nuôi cấy và theo dõi hàm lượng IAA sinh ra sau thời gian là 2, 3, 4, 5 ngày. + Dịch nuôi cấy vi sinh vật sau các thời gian nuôi cấy (2, 3, 4, 5 ngày) được ly tâm 3000 vòng/phút trong 25 phút. Sau ly tâm để yên dịch trong 20 phút rồi hút dịch đã ly tâm vào các lọ penicilin đã khử trùng và giữ trong tủ lạnh sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. + Dựng đồ thị chuẩn IAA: Cân 0.025g IAA cho vào cốc đong có chứa sẵn 50ml nước cất và đun cho tan IAA. Chuẩn bị các ống nghiệm có chứa sẵn 10ml nước cất trong mỗi ống. Hút ở mỗi ống nghiệm lần lượt 0, 50, 100, 200, 400, 600,..., 1400, 1600 l nước cất đồng thời bổ sung lượng IAA tương ứng với lượng nước cất hút ra ở mỗi ống nghiệm. Đối chứng là 2ml nước cất bổ sung 8ml thuốc thử. Dựa vào chỉ số OD (mật độ quang) và nồng độ IAA trong dung dịch để dựng đồ thị chuẩn IAA tinh khiết. + Xác định hàm lượng IAA sinh ra: Thêm 2ml dung dịch vi sinh vật đã ly tâm vào ống nghiệm đã có sẵn 8ml thuốc thử. Đối chứng là 2ml môi trường và 8ml thuốc thử. So màu trên máy so màu bước sóng 530 nm và tính kết quả theo đồ thị chuẩn IAA tinh khiết. 23 2.3.6. Phân loại vi sinh vật Phân loại vi sinh vật bằng phương pháp giải trình tự: Sử dụng chương trình BLASTđể phát hiện những trình tự tương đồng với các trình tự nucleotit nghiên cứu đã được công bố trong ngân hàng dữ liệu trình tự gen (NCBI). Kết quả việc so sánh này sẽ chỉ ra loài vi sinh vật nghiên cứu thuộc chi, loài nào. Phương pháp tiến hành: Tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn bằng: Tách chiết DNA tổng số từ vi sinh vật: chủng đơn vi sinh vật được làm sạch và nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng tổng sổ để đạt được mật độ tế bào cao. Sử dụng 2-3 ml dịch vi sinh vật để tiến hành tách chiến DNA tổng số bằng bộ kit GeneJET Genomic DNA Purification (K0721) của hãng Thermo. Sử dụng cặp mồi 16S, 18S rRNA để tiến hành phản ứng PCR với bộ kit PCR super mix (10572014). Sản phẩm PCR sau đó được gửi đi giải mã trình tự. Xác định tên loài, chi của vi sinh vật bằng cách so sánh đoạn trình tự nhân được với các trình tự đã công bố trên ngân hàng dự liệu gen NCBI để đánh giá sự tương đồng. 24 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. PHÂN LẬP VÀ LƯU GIỮ CÁC CHỦNG VI SINH VẬT TỪ MẪU ĐẤT Từ các mẫu đất thu thập ở ruộng lúa, ruộng mía tại tỉnh Hà Tĩnh; Nghệ An và từ Thanh Hóa đã phân lập được các chủng vsv thuộc các nhóm hoạt tính phân giải xenlullo, cố định nitơ, phân g