Luận văn Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa kháng rầy nâu

c gen phụ hay các QTLs (Robert Koebner (2003MAS in cereals: green for maize, amber fỏ rice, still red for ưheat ADN barley (2003). Marker Asssisted selection: a fast track to encrease gêntic gain in plant ADN âniml breeding. Page: 12-17 Link:… )). Hiệu quả cải tiến cây trồng sẽ gia tăng gấp nhiều lần so với chọn giống cổ điển, nhờ thực hiện chọn lọc không cần trực tiếp trên tính trạng mong muốn, mà thông qua chỉ thị phân tử liên kết với tính trạng đó (Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (2004Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (2004). Di truyền phân tử (288-305). NXBNN, TP. HCM )). Phương pháp này cho phép thanh lọc kiểu hình với một khối lượng quần thể lớn. Thông qua chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử, người ta có thể xác định được kiểu hình kháng nhiễm ở ngay thế hệ phân ly đầu tiên ở F2, F3. Như vậy, các nhà chọn giống có thể rút ngắn thời gian đánh giá kiểu hình, tập trung chọn lọc những mục tiêu quan trọng khác có giá trị về mặt kinh tế (Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, (2002Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu (2002)Chọn tạo giống lúa có gen kháng bệnh đạo ôn nhờ Marker phân tử. Cơ sở di truyền tính khágn sâu bệnh hại cây trồng. NXB. Nông nghệp. Trang 183-195 )). Nếu so sánh với chọn lọc kiểu hình, MAS có thể giúp các nhà chọn giống tiết kiệm từ 1 đến 16,7 lần trong chọn lọc quần thể (Knap (1998 )). Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử còn là phương tiện hữu hiệu trợ giúp đắc lực cho chọn giống truyền thống nhằm khắc phục những trở ngại mà công tác chọn giống truyền thống rất khó giải quyết nhờ chọn lọc loại bỏ được các tác động gây nhiễu do các tương tác trong cùng alen hay giữa các alen gây ra – những tương tác này thường không thể phát hiện được bằng các phân tích kiều hình. Phương pháp này còn đặc biệt hiệu quả trong trường hợp cần đưa gen lặn hoặc thậm chí đưa nhiều gen khác nhau vào một nền gen ưu việt. 1.4. một số Chỉ thị phân tử thông dụng được sử dụng trong nghiên cứu genome và chọn giống thực vật 1.4.1.Chỉ thị phân tử Số lượng các chỉ thị ADN là rất lớn. Cây trồng có khỏang 108 - 1010 nucleotit trong ADN tổng số. Thậm chí, nếu chỉ tính một sai khác rất nhỏ giữa hai cá thể thể đã dẫn đến một số lượng khổng lồ các chỉ thị ADN giữa 2 cá thể đó. Về nguyên tắc, một chỉ thị ADN lý tưởng là chỉ thị thỏa mãn các yêu cầu sau: Bản chất cho đa hình cao, di truyền đồng trội, xuất hiện nhiều trong genome, tập tính chọn lọc trung tính (trình tự ADN của cơ thể nào cũng là trung tính với các điều kiện môi trừơng), dễ tiếp cận, phân tích nhanh và dễ dàng. Tuy nhiên, gần như không thể tìm thấy một CTPT nào có thể thỏa mãn tất cả những điều kiện trên. Tùy thuộc vào những nghiên cứu mà người ta sử dụng một hệ thống chỉ thị thỏa mãn được một số điều kiện trên (Nguyen Duy Bay va ctv., 2001Nguyen Duy Bay, Nguyn H.T., Bui Chi Buu ADN Bui Ba Bong (2001), Genetic markers in genome research ADN plant breeding, Chọn gióngnhowf Marker và Phân tích QTL, Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, tr: 44-58 ). Chỉ thị phân tử thường được phân thành chỉ thị dựa trên cơ sở phép lai ADN và các chỉ thị dựa trên cơ sở phản ứng PCR. 1.4.1.1. Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN a. Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism - Đa hình chiều dai đoạn phân cắt). Chỉ thị RFLP được di truyền đơn giản theo quy luật Menden. Trong kỹ thuật RFLP, enzyme giới hạn được sử dụng để cắt ADN genome thành nhiều mảnh ADN có độ dài khác nhau. Qua quá trình tiến hóa, trong phạm vi trình tự nhận biết của một loại enzym giới hạn có thể xảy ra sự tái sắp xếp ADN, các đột biến đểm, sự thêm hoặc mất đoạn ADN, điều này tạo nên sự đa hình giữa các cá thể và có thể phát hiện được đa hình này khi sử dụng kỹ thuật RFLP. Sau khi xử lý bằng enzyme giới hạn, các đoạn ADN được phân tích bằng điện di trên gen agarose và đưa lên màng lai. Những băng đặc hiệu được nhận biết bằng phương pháp lai ADN với các ADN mẫu dò đã được đánh dấu. Các ADN mẫu dò có độ dài khoảng 0,5-3,0kb, được tổng hợp từ cADN hoặc ngân hàng ADN genome. Các chỉ thị RFLP được sử dụng đầu tiên trong việc lập bản đồ di truyền và đến nay vẫn được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu về genome nhờ những ưu điểm của nó. Là 1 chỉ thị đồng trội, RFLP rất đáng tin cậy trong phân tích mối liên kết và chọn giống. Ưu điểm của phương pháp này là không những phát hiện được các cá thể dị hợp tử và đồng hợp tử mà còn phát hiện được cá thể đồng hợp tử trội và đồng hợp tử lặn. Tuy nhiên, chỉ thị RFLP có một hạn chế: kỹ thuật RFLP đòi hỏi khối lượng ADN lớn của mỗi cá thể trong mỗi thí nghiệm (Paterson, 1996Paterson C.M. ADN Kisdore G. M. (2000), Exploiting the full potential of disease – resistance to blast disease in rice within a conventional breeding progam, Rice Blast Disease, Wallingfors, United Kingdom, CAB, International, pp. 245-265. ), phương pháp tốn nhiều thời gian, công sức và tỷ lệ số băng cho đa hình thấp, điều này rất bất tiện khi lai giữa các loài có quan hệ gần gũi. (Lê Duy Thành, 2000Lê Duy Thành (2000), Cơ sở di truyền chọn giống thực vật, Nxb. DHQG Hà nội, Hà nội ) b. Chỉ thị SNP (Single nucleotide polymorphism - Đa hình của các nucleotit đơn) SNP là những biến dạng của chuỗi trình tự ADN được tìm thấy với tần suất cao nhất trong genome người. Theo phân tích chi tiết chuỗi trình tự cuả những phần nào đó trong genome, ADN từ hai các thể khác nhau phần lớn đều giống nhau với số cặp base khác biệt nhau nằm ở trong khoảng cho phép 500-1000bp. Một cặp base ở một vị trí nào đó sẽ biểu thị sự khác nhau của cá thể có tính chất phổ biến, và một cặp base khác là biến dị, ít phổ biến hơn ở cùng một vị trí. Nếu cặp base ít phổ biến hơn xuất hiện nhỏ hơn 1% trong quần thể, người ta định nghĩa vị trí cặp base đó là một SNP. Hiện nay, người ta đã công bố 3 triệu SNP trong genome người (Russell 2002) [Di truyền phân tử, tr180], nhiều hơn bất cứ chỉ thị phân tử nào đã được công bố trước đó. Kỹ thuật SNP được áp dụng vào đầu những năm 2000, từ genome người cho đến genome các sinh vật khác như cây Arabidopsis, cây lúa…. Các alen của một SNP có thể dễ dàng được xem xét bởi phân tích lai với phân tử oligonucleotit nào đó. Trong quy trình này, một đoạn ngắn oligonucleotit được tổng hợp sao cho nó sẽ bổ sung vào alen phổ biến nhất tại locut SNP. Phân tử oligo này được trộn với ADN mục tiêu, và mức độ lai ADN được hoàn chỉnh ở mức độ cực kỳ chính xác. SNP có những ưu điểm nổi bật sau: -SNP có tính chất “diallelic” trong quần thể và tần suất alen của nó có thể được ước đoán dễ dàng trong bất cứ quần thể nào, thông qua một loại xét nghiệm kỹ thuật - SNP là những chỉ thị phân tử có tính ổn định rất cao về mặt di truyền. - Nhiều kỹ thuật đã được nghiên cứu để tạo ra SNP theo kiểu tự động hóa với sự giúp đỡ của máy tính (Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang., 2004Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2004. Di truyền Phân tử ) 1.4.1.2. Chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản ADN bằng các kỹ thuật PCR a. Chỉ thị RAPD (RADNom Amplified Polymophic DNA - Tính đa hình các đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên). Chỉ thị RAPD là sự khuyếch đại ngẫu nhiên các đoạn ADN genome với những nhóm mồi đơn (khỏang 6-10nu) (William và ctv., 1990William J.G, et al (1990), DNA polimophism amplified by arbitrary primers ate useful aas genetic marker, Nucleic Acid Research, 18, 6531-6535. ). Trong phản ứng này, một mồi đơn gắn vào ADN genome ở 2 vị trí khác nhau trên sợi bổ trợ của ADN khuôn. Sự đa hình phát hiện đựơc khi sử dụng kỹ thuật RAPD có thể là do sự thay đổi bazơ nucleotit ở vị trí gắn mồi, hoặc sự thêm hay mất nucleotit nằm trong vùng khuyếch đại. Do đó, đa hình RAPD thường là trội, biểu hiện sự có mặt hay vắng mặt của 1 sản phẩm khuyếch đại từ một locut đơn. Ưu điểm chính của chỉ thị này là không đòi hỏi thông tin về trình tự ADN, kỹ thuật đơn giản, chi phí thấp và nhiều chỉ thị có thể được phân tích trong một thời gian ngắn. Do vậy, kỹ thuật này được sử rộng rãi trong việc lập bản đồ di truyền, phân tích và xác định mối quan hệ thân thuộc giữa các thứ cây trồng hay giữa các cá thể để phục vụ trong công tác lai tạo hoặc phân loại. Chúng được sử dụng như những CTPT để xác định những gen kiểm soát hoặc có liên quan đến một tính trạng nào đó ở cây trồng. Nhược điểm của phương pháp này là RAPD thường là các chỉ thị trội cho nên khi các sản phẩm được khuyếch đại có kiểu dị hợp tử thì không thể phân biệt đựơc và do đó nó không có ưu điểm như RAPD là chỉ thị đồng trội. Ngoài ra, độ nhạy và độ tin cậy của RAPD còn phụ thuộc vào điều kiện phản ứng. (Nguyen Duy Bay và ctv., 2001). b. Chỉ thị AFLP (Aplified Fragment Length Polymorphism - Đa hình chiều dài các đoạn ADN được nhân bản chọn lọc) Phương pháp AFLP là sự kết hợp việc sử dụng enzyme giới hạn với khuyếch đại PRC và phát hiện đa hình, được phát minh bởi Zabeau và Vos (1993) (Nguyen Duy Bay và ctv., 2001). Nguyên tắc của kỹ thuật như sau: ADN genome được cắt đồng thời với 2 loại enzyme khác nhau thành các đoạn có kích thước không giống nhau, trong số đó sẽ có một số đoạn mang một số phân đoạn mang các đầu mút giống nhau. Nếu ta sử dụng một số đoạn nối (adaptor) như nhau có gắn thêm 1 hoặc một số oligonucleoitit được chọn lọc trứớc để định hướng cho việc gắn của các cặp mồi PCR thì tất cả những đoạn ADN có đầu mút giống nhau sẽ đựơc nhân bản. Khi thay đổi số lượng và trình tự các oligonucleoitit được chọn lọc ở các đầu nối ta có thể nhận lại được những đoạn ADN đựơc nhân bản khác nhau. Kỹ thuật này được đánh giá là nhanh chóng và có hiệu quả trong việc xác định tính đa dạng ở cây trồng, tách dòng và lập bản đồ phân tử. Tuy nhiên, đa hình AFLP là do sự có mặt hay vắng mặt của vị trí gắn mồi và là chỉ thị có bản chất trội nên nó không có lợi khi dùng để lập bản đồ các quần thể phân ly. (Nguyen Duy Bay và ctv., 2001) (Lê Duy Thành, 2000Lê Duy Thành (2000), Cơ sở di truyền chọn giống thực vật, Nxb. DHQG Hà nội, Hà nội ). c. Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeats – Sự lặp lại của trình tự đơn giản) SSR là những đoạn lặp lại, đơn vị lặp lại gồm từ 2 đến 6 nucleotit, kích thước mỗi locut là 20-100bp. ở thực vật, trình tự AT/TA được nhắc lại nhiều nhất, sau đó là GA/CT, trong khi đó thì trình tự CA/GT lại phổ biến ở động vật. Chúng được sử dụng như những chỉ thị ADN trong lập bản đồ di truyền. Đa hình vi vệ tinh được phát hiện thông qua sự nhân bội ADN hệ gen nhờ sử dụng 2 đoạn mồi bổ trợ với trình tự gần kề hai đầu của vùng lặp lại. Microsatllites, phương pháp vi vệ tinh hay còn gọi là kỹ thuật SSR là phương pháp tốt nhất để nghiên cứu ADN fingerpringting bởi vì sự đa dạng ở mức độ cao từ rất nhiều vùng tương ứng, bao phủ rộng khắp hệ gen của chúng và là chỉ thị đồng trội. Khi nghiên cứu các chỉ thị vi vệ tinh, người ta có thể xác định được vị trí cuả chúng trên nhiễm sắc thể nào của loài nghiên cứu. Do chỉ thị vi vệ tinh có thể dễ dàng phân tích bằng PCR, nên kỹ thuật này chỉ cần một lượng nhỏ mẫu và không tốn kém. Đến nay, hơn 2500 cặp mồi SSR của lúa đã được phổ biến. Nhược điểm cơ bản của chỉ thị này là quá trình thiết kế mồi rất tốn kém mà mỗi loại mồi chỉ đặc trưng cho một loài. d. Chỉ thị STS (Sequence Tagged Site – Vùng đã biết trước trình tự) STS là một đoạn ADN ngắn gồm khoảng 60-1000bp và có thể phát hiện đựơc bằng kỹ thuật PCR. Hai đoạn mồi được thiết kế dựa trên các trình tự nucleotit đã biết giúp ta xác định được vùng ADN cần tìm kiếm. Các đoạn mồi STS thường chứa khoảng 20 nuleotit (dài hơn mồi của RAPD) nên có tính đặc hiệu cao. Mỗi một STS được xác định tại một điểm trên bản đồ như là một mốc trong genome. ở cây lúa, các STS được coi như là mốc chuẩn. Kỹ thuật này cũng rất thuận lợi cho việc nghiên cứu mối quan hệ họ hàng giữa các loài ((Lê Duy Thành, 2000Lê Duy Thành (2000), Cơ sở di truyền chọn giống thực vật, Nxb. DHQG Hà nội, Hà nội )). e. Chỉ thị RGA (Resistance Gene Analog – Vùng tương đồng gen kháng) Khi so sánh trình tự ADN của những gen kháng đã phân lập từ nhiều loài thực vật khác nhau, các nhà khoa học đã thấy rằng những gen này có chung những vùng lặp lại, ví dụ như vùng nhắc lại giàu leucin (Leucine Rich Repeat: LRR), vùng vị trí liên kết nucleotit (Nucleotit Binding Site: NBS) và vùng protein Kinaza (PK) (Grant và ctv., 1995Grant M. R., et al. (1995), Structure of the Arabidopsis RPM1 gene enabling dual specificity disease resistance, Science, 269, 269, 843-846. thể phân ly, còn đối với chỉ thịphân tử, h ). Những vùng này đã được sử dụng trong việc xây dựng một kỹ thuật dựa trên PCR, đó là kỹ thuật RGA. Bản chất cuả kỹ thuật RGA là những cặp mồi ADN được xây dựng dựa vào những vùng bảo tồn nằm trong gen kháng. Bởi vậy, sản phẩm “nhận dạng” ADN có thể là một vùng hoặc toàn bộ gen kháng. Kỹ thuật RGA đã được dùng để tách, lập bản đồ gen kháng và mô tả đa dạng di truyền. (Chen và ctv., 1998Chen D., Dela Vina M., et al (1999), Molecular mapping of the blast resistance gene, Pi-44(t), in a line derived from a durably resistance rice cultivar, Theor. Appl. Genet, 97, 345-355 ) . 1.4.2. ứng dụng của chỉ thị phân tử trong chọn giống 1.4.2.1. Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử trong chọn giống (MAS) Với sự ra đời của chỉ thị phân tử, phương pháp chọn lọc bằng chỉ thị phân tử là một cách tiếp cận mới giúp tránh được những vấn đề gặp phải ở chọn giống truyền thống, bằng cách thay đổi hình thức chọn lọc từ kiểu hình sang chọn lọc kiểu gen một cách trực tiếp hay gián tiếp. Ưu điểm của chỉ thị phân tử so với chỉ thị hình thái Chỉ thị phân tử rõ ràng không bị ảnh hưởng bởi tác động môi trường và điều kiện sống của cây trong tất cả các giai đoạn sinh trưởng E. Franci và ctv. (2005Di đặt vấn đề thực hiện đề tài IRRIuan tâm các cá thể phân ly ở trong cùng một quần thể phân ly, còn đối với chỉ thịphân tử, hE. Francia, G. Taccomi, C. Crosatti, D. Barabschi, D. Bulgarelli, E. Dall’Aglio& G. Vale. (2005) Marker assisted selection in crop plants. Plant Cell, Tissue ADN Orrgan Culture. 82: 317-342 ). So với chỉ thị hình thái, chọn lọc bằng chỉ thị phân tử có những ưu thế sau: 1. Kiểu gen của các locut chỉ thị phân tử có thể được xác định tại bất kỳ giai đoạn nào và ở bất cứ mức độ nào: tế bào, mô hay toàn bộ cơ thể 2. Số lượng các chỉ thị phân tử là cực kỳ lớn, trong khi số lượng của chị thị hình thái là hạn chế. 3. Các alen khác nhau của chị thị phân tử thường không liên kết với những hiệu ứng có hại, trong khi sự đánh giá của chỉ thị hình thái thường hay đi kèm với hiệu ứng kiểu hình không mong muốn. 4. Các alen của các chỉ thị phân tử phần lớn là đồng trội, vì thế cho phép phân biệt mọi kiểu gen ở bất kỳ thế hệ phân ly nào, còn các alen của các chỉ thị hình thái thường tương tác theo kiểu trội-lặn, do đó bị hạn chế sử dụng trong nhiều tổ hơp lai. 5. Đối với chỉ thị hình thái, các hiệu ứng lấn át thường làm sai lệch việc đánh giá các cá thể phân ly ở trong cùng một quần thể phân ly, còn đối với chỉ thị phân tử, hiệu ứng lấn át hoặc cộng tính rất hiếm gặp. Điều kiện để ứng dụng MAS Theo E. Franci và ctv. (2005E. Francia, G. Taccomi, C. Crosatti, D. Barabschi, D. Bulgarelli, E. Dall’Aglio& G. Vale. (2005) Marker assisted selection in crop plants. Plant Cell, Tissue ADN Orrgan Culture. 82: 317-342 ) và R. Babu1 và ctv. (2004), sự thành công của hệ thống chọn giống nhờ MAS phụ thuộc vào 3 yếu tố chính: - Bản đồ di truyền với một số lượng hợp lý các chỉ thị đa hình tại các vùng tương đồng (uniformly-spaced polymorphic markers)) để định vị chính xác QTLs hay gen quan tâm. - Mối liên kết chặt giữa chỉ thị và các gen kháng hay các QTLs. - Sự tái tổ hợp thích hợp giữa các chỉ thị và phần còn lại của bộ gen. (Adequate recombination between the markers and rest of the genome) (R. Babu1 và ctv. (2004)). - Khả năng đánh giá một số lượng lớn cá thể trong một thời gian và giá thành hiệu quả (E. Franci và ctv. (2005E. Francia, G. Taccomi, C. Crosatti, D. Barabschi, D. Bulgarelli, E. Dall’Aglio& G. Vale. (2005) Marker assisted selection in crop plants. Plant Cell, Tissue ADN Orrgan Culture. 82: 317-342 )). Thành công của MAS còn phụ thuộc vào vị trí cuả chỉ thị so với gen quan tâm. Có 3 kiểu quan hệ giữa chỉ thị và gen quan tâm cần phải được làm rõ (R. Babu1 và ctv. (2004)): (i) Chỉ thị phân tử được định vị ngay trong phạm vi gen quan tâm. Đây là trường hợp lý tưởng nhất cho MAS, nhưng rất khó tìm thấy loại chỉ thị này. (ii) Chỉ thị linkage disequilibrium (LD) với gen quan tâm. Đây là nhóm chỉ thị có khuynh hướng di truyền cùng nhau. Mối quan hệ này tìm thấy khi gen và chỉ thị có khoảng cách vật lý gần nhau. Chọn lọc dựa trên chỉ thị này gọi là LD-MAS. (iii) Chỉ thị có mối cân bằng liên kết (linkage equilibrium (LE)) với gen quan tâm. Đây là trường hợp khó tiến hành ứng dụng trong MAS . Khi đề cập đến ứng dụng chỉ thị PCR trong chọn giống, Kangle Zheng (1995Kangle Zheng, Ning Huang, John Bennett, ADN Gudev S. Khush, 1995, PCR-based marker-assisted selection in rice breeding, IRRI discussion paper series No.12, IRRI, Philippines., 14-21. ) cũng cho rằng mức chính xác của MAS phu thuộc vào mối liên kết chặt giữa gen quan tâm và chỉ thị phân tử. Mặc dù chỉ thị và gen có mối liên hệ về di truyền, nhưng mối liên kết này có thể bị phá vỡ do có sự tái tổ hợp giữa chúng. Khoảng cách di truyền phản ánh tỷ lệ tái tổ hợp giữa gen quan tâm và chỉ thị. Vì thế, để có độ tin cậy cao, làm giảm sự tái tổ hợp giữa gen quan tâm và chỉ thị là điều cần thiết. Điều này có thể thực hiện khi áp dụng MAS với những chỉ thị cách gen quan tâm không quá 5cM và với những nhóm marker nằm về cả 2 phía của gen. Theo lý thuyết, với những chỉ thị cách gen trong khoảng 5cM, độ chính xác thu được khi sử dụng MAS là 99.75% hoặc có thể cao hơn. Tuy nhên, trong đa số các trường hợp, dặc biệt đối với các tính trạng đa gen, các gen hay QTL quan tâm đa phần chưa được nhận dạng chi tiết ở mức độ phân tử. Vì thế, những vùng gen được chọn để ứng dụng MAS thường là các đoạn nhiễm sắc thể chứa gen hay QTL. Hiệu quả chọn lọc sẽ tốt hơn nếu có 2 chỉ thị đa hình flanking với gen quan tâm , hoặc chỉ thị nằm trong QTL (nếu đoạn nhiễm sắc thể có kích thước lớn hơn 20cM) để hạn chế khả năng tái tổ hợp hai lần giữa hai chỉ thị flanking. ứng dụng của MAS E. Francia, G. Taccomi, C. Crosatti, D. Barabschi, D. Bulgarelli, E. Dall’Aglio& G. Vale. (2005) Marker assisted selection in crop plants. Plant Cell, Tissue ADN Orrgan Culture. 82: 317-342 Đối với các nhà chọn giống, ứng dụng quan trọng nhất của MAS là sử dụng những chỉ thị phân tử cho 3 mục đích sau: - Phát hiện gen quan tâm trong các quần thể. - Phân lập nhanh các cá thể cần quan tâm trong các quần thể dựa trên thành phần của gen hay các chỉ thị liên kết với các alen quan tâm đối với các locut mong muốn. - Chuyển một vùng gen, đối với những tính trạng quan tâm được quy đinh bởi đơn gen hay bởi một gen chịu trách nhiệm phần lớn việc biểu hiện kiểu hình của tính trạng. Trong chọn giống lúa, MAS ngày càng được sử dụng rộng rãi để rút ngắn các quá trình phục hồi các dòng bố mẹ tái tục trong các chương trình lai trở lại. Khi so sánh với lai trở lại trong chọn giống truyền thống, vai trò trợ giúp của chỉ thị phân tử có thể cải thiện hiệu quả chọn giống ở 3 điểm sau: - Đối với các tính trạng khó đánh giá kiểu hình, chọn lọc đối với một chỉ thị alen cây bố mẹ cho gen tại vị trí locut gần với gen quan tâm có thể làm tăng hiệu quả và độ chính xác của chọn lọc. - Sử dụng chỉ thị để chọn lọc quần thể lai trở lại nhằm hạn chế số lượng gen nằm ngoài vùng quan tâm và để chọn lọc quần thể lai hiếm tạo ra từ việc taí tổ hợp gần gen quan tâm, vì thế hạn chế đối đa tác động của các yếu tố cản trở có liên quan. - Chuyển các gen lặn bằng phương pháp truyền thống và chọn lọc trong các quần thể tự phối sau mỗi lần lai trở lại. (Chuyển các gen lặn trong chọn giống truyền thống đòi hỏi phải có các thế hệ tự phối sau mỗi lần lai trở lại, quá trình này làm kéo dài thời gian chọn giống và ảnh hưởng đến mục đích thương mại cuả chọn giống. Với sự trợ giúp của MAS, quá trình này đã được rút ngắn lại nhờ kiểm tra được sự có mặt của alen lặn trong con lai). Các giả thuyết mô hình MAS Trong những năm gần đây, một vài mô hình MAS đã được các nhà khoa học đưa ra và được phân tích cặn kẽ (Frisch và ctv., 1999a, 1999b, Hospital, Charcosset, 1997; Visscher và ctv., 1996; Xie và Xu, 1998). Theo một số mô hình, chỉ cần tiến hành lai trở lại qua 4 thế hệ, chứ không cần đến 6 thế hệ, ngay cả khi quần thể chọn lọc có kích thước nhỏ và các giữ liệu về chỉ thị phân tử bị hạn chế (Frisch và ctv., 1999b, Hospital, 1992). Trong một số trường hợp thuận lợi, đôi khi các nhà chọn giống chỉ cần lai trở lại 3 thế hệ là có thể đạt được mục tiêu của mình. Hơn thế nữa, Frisch và ctv., (1999b) đã đưa ra chiến lược “chọn lọc hai giai đoạn” để áp dụng trong trường hợp chưa biết các thông tin về bản đồ liên kết của các chỉ thị phân tử. Theo R. Babu1 và ctv. (2004), những tính toán dựa trên cơ sở máy tính để so sánh các chiến lược chọn lọc 2 bước, 3 bước và 4 bước (stage) về tỷ lệ kiểu gen bố mẹ phục hồi (recurrent parent genotype) cho thấy: - Với chiến lược lấy mẫu 4 bước và quần thể từ 50-100 cá thể, tỷ lệ kiểu gen giống bố mẹ (RPG) có thể đạt 96% với độ tin cậy 90%. Trong khi chọn giống truyền thóng phải cần tới 6 thế hệ và với rủi ro lớn hơn. - Việc tăng số lượng chỉ thị để đánh giá kiểu gen ở mỗi thế hệ có rất ít tác dụng. Khi ngưỡng 1 chỉ thị / 20cM đạt được, việc thêm chỉ thị nữa là không cần thiết (ngoại trừ các chỉ thị xung quanh locut quan tâm). Tỷ lệ tái tổ hợp chứ không phải số lượng chỉ thị là yếu tố hạn chế trong việc giảm các cản trở liên kết. Điều đó cho thấy rằng, việc lấy mẫu quần thể lớn hơn với ít chỉ thị hơn có nghĩa hơn việc làm ngược lại. 1.4.2.2. ứng dụng chỉ thị phân tử trong quy tụ gen kháng ở lúa Cho đến nay, MAS tỏ ra có hiệu quả đối với các tính trạng đơn giản được điều khiển bởi một số lượng hạn chế các gen như các tính kháng sâu, bệnh…(E. Franci và ctv, 2006). Trong chọn giống kháng ở lúa, MAS có thể cung cấp những lợi thế: cho phép có phản ứng nhanh hơn với sự đổ vỡ tính kháng, dồn nhanh nhiều gen từ các nguồn kháng đa dạng, quy tụ gen kháng, và chọn lọc những tổ hợp gen kháng có liên kết chặt (Michelmore, 2003). Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử đã trở thành chiến lược chọn giống của nhiều quốc gia và được tiến hành ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới (P. Kaushal và ctv (2004P. Kaushal, D. R. Malaviya ADN A. K. Roy. 2004. Prospects for breeding apomictic rice: A reassessment. Current Science, Vol. 87, NO. 3, pp: 292-296 )) (MADNy Christopher và ctv. (2004). Cho đến nay, nhiều chương trình trong chiến lược chọn giống bằng MAS ở lúa tập trung vào quy tụ gen kháng bệnh, đặc biệt là các gen kháng bệnh bạc lá và đạo ôn (Robert Koebner (2003MAS in cereals: green for maize, amber fỏ rice, still red for ưheat ADN barley (2003). Marker Asssisted selection: a fast track to encrease gêntic gain in plant ADN âniml breeding. Page: 12-17 Link:… )). Triển vọng to lớn khi ứng dụng MAS trong chọn giống đa gen kháng đã được chứng minh khi các nhà khoa học Nhật Bản cho ra đời hai giống lúa Indonesia được quy tụ gen kháng xa5 vào giống có nền gen xa4 (Toennissen và ctv. 2003Toenniesssen G.H., O’Toole J.C., DeVries j. 2003. Advances in plant biôtechnology ADN its adôptin in developing coủnties. Curr Opin Plant Biol 6: 191-198. ). Trước đó, cũng đã có những báo cáo về quy tụ gen kháng bạc lá xa4,xa5, xa13 và xa21(HUANG và ctv. (1997); Sanchez và ctv. (2000); Sing và ctv. (2001) và quy tụ 3 gen kháng đạo ôn Pi1, Piz-5 và Pita; (Hittalmant và ctv. (2000)). MAS cũng đã được ứng dụng thành công trong tạo các dòng lúa kháng bạc lá, sâu đục thân vàng và sheath blight (Datta và ctv. (2002)). Trong hội nghị lúa Quốc tế lần thứ 5 tại IRRI,2005, Các nhà khoa học Trung Quốc đã báo cáo quy tụ thành công các gen kháng đạo ôn và bạc lá trong chọn giống lúa lai. Li-yong Cao và ctv. (2005Li-yong Cao, Zhuang Jie-yun, Zhan Xiao-deng, Zhou Hai-peng, Cheng Shi-hua. 2005. Pyramiding of bacterial blight ADN blast resistance genes in rice by molecular marker-assisted selection. 5th International Rice Genetics Symposium ADN 3rd International Rice Functional Genomics Symposium. IRRI. ) ) đã chuyển thành công gen kháng đạo ôn Pi25 (t) vào dòng lúa lai R8006 mang gen kháng bạc lá Xa21 nhờ chỉ thị phân tử, dòng lúa này cho khả năng kháng đạo ôn, kháng bạc lá tốt và đang được trồng thử nghiệm . Feng Wang và ctv. (2005) đã ứng dụng chọn lọc nhờ các chỉ thị SSR trong quy tụ thành công 2 gen kháng đạo ôn Pi-1 và Pi-2 vào dòng lúa khử đực mẫn cảm nhiệt độ BL122. 1.5. Những nghiên cứu xác định chỉ thị phân tử liên kết gen kháng rầy nâu và ứng dụng trong chọn tạo giống kháng rầy nâu Cho đến năm 2004, có khoảng 4000 chỉ thị phân tử ở lúa được phát hiện (P. Kaushal và ctv (2004P. Kaushal, D. R. Malaviya ADN A. K. Roy. 2004. Prospects for breeding apomictic rice: A reassessment. Current Science, Vol. 87, NO. 3, pp: 292-296 ). Tuy nhiên, những nghiên cứu chỉ thị phân tử liên kết gen kháng rầy nâu ở lúa mới chỉ được bắt đầu chưa đầy một thập kỷ và vẫn đang được tiến hành. Năm 1994, Ishii và ctv. đã tiến hành nghiên cứu xác định chỉ thị liên kết gen kháng rầy nâu được đưa từ loài lúa hoang O. australiensis vào lúa trồng O. sativa (IR65482-4-136-2-2), kháng với rầy nâu biotype 1, 2 và 3, đã được chọ