Luận văn Xây dựng phương pháp định lượng azithromycin trong huyết tương

hiện trân sắc ký đồ. - Detector của thiết bị có đáp ứng như nhau đối với tất cả các thành phần có mặt trong mẫu. Do hai yêu cầu trên rất khó được đáp ứng đầy đủ nên kết quả thường không tin cậy. Để tăng độ tin cậy người ta dùng hệ số đáp ứng của detector đối với từng thành phần của mẫu. 1.4. Vài nét về HPLC với detector huỳnh quang. Quang phổ huỳnh quang ngoài việc áp dụng để định tính, định lượng các chất trên máy đo quang phổ huỳnh quang thì nó còn được dùng để chế tạo bộ phận phát hiện của máy HPLC. Detector huỳnh quang đóng vai trò như một máy huỳnh quang kết nối với sắc ký lỏng để phát hiện về phân tích định tính và định lượng các chất sau khi ra khỏi cột sắc ký. Detector huỳnh quang có độ chọn lọc và nhạy hơn (có thể đến 1000 lần) detector hấp thụ UV. HPLC-detector huỳnh quang có thể phát hiện tới 10-12g. Do có độ nhạy cao nên detector huỳnh quang được sử dụng trong phân tích vết trong kiểm soát môi trường, giám định pháp y, định lượng hoạt chất trong dịch sinh học... Tùy theo các chất cần định lượng có khả năng phát quang hay không mà tiến hành định lượng trực tiếp hay gián tiếp thông qua dẫn chất có khả năng phát quang của nó. Người ta có thể cho chất cần phân tích phản ứng với thuốc thử để tạo dẫn chất phát huỳnh quang mạnh trước khi đến detector huỳnh quang. Việc tạo dẫn xuất này có thể tiến hành trước hoặc sau khi chất cần phân tích đi qua cột sắc ký. Nếu chất cần phân tích được phản ứng với thuốc thử trước khi qua cột thì kỹ thuật này gọi là tạo dẫn xuất trước cột. Nếu chất cần phân tích được phản ứng với thuốc thử sau khi đã đi ra khỏi cột, thì được gọi là tạo dẫn xuất sau cột. 1.5. Vài nét về LC-MS. LC-MS là kỹ thuật phân tích dựa trên sự kết hợp sắc ký lỏng hiệu năng cao và phân tích khối phổ. Sự kết hợp này tạo nên một hệ thống có những ứng dụng rộng lớn trong phân tích. - Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ cho phép phân tích hỗn hợp các chất khó bay hơi như các thuốc bảo vệ thực vật, các thuốc chữa bệnh,... các độc tố, các phân tử protein có phân tử lượng lớn từ vài ngàn đến hàng trăm ngàn đơn vị dalton... [8]. - Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ có bộ kết nối phun điện được sử dụng rất hữu hiệu phân tích dược phẩm cả định tính và định lượng, ví dụ các thuốc có trong các mẫu sinh học phức tạp như HT, huyết thanh, nước tiểu... [8]. *Nguyên tắc hoạt động của máy phân tích khối phổ: Đây là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hay nguyên tử của mẫu. Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phân tích khối trước khi đến detector. Tất cả các quá trình này diễn ra trong thiết bị áp suất thấp, áp suất trong hệ dao động từ 10-3 đến 10-6 Pa. Nhiệm vụ của detector khối phổ: Chuyển các ion đã đến detector thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ. *Các bộ phận của máy phân tích khối phổ: - Bộ nạp mẫu: Có đường kết nối với đầu ra của máy sắc ký lỏng. - Bộ nguồn ion hóa: Nhiệm vụ ion hóa các phân tử, nguyên tử của mẫu. Có rất nhiều kỹ thuật ion hóa khác nhau nhưng hiện nay thường sử dụng kỹ thuật ion hóa bằng phun điện tử (ESI) và ion hóa hóa học ở áp suất thường (APCI) Trong đề tài này chúng tôi sử dụng kỹ thuật ESI. ESI có vai trò chuyển ion từ pha lỏng sang pha khí. Kỹ thuật này được mô tả như sau: Các phân tử dung môi và hóa chất sau khi ra khỏi cột sắc ký sẽ được đưa vào một ống mao quản cao thế 2 đến 5 KV (điện thế dương ở đầu kim tạo ion dương, điện thế âm ở đầu kim tạo ion âm và được quyết định tùy chất khảo sát). Dưới tác động của điện thế cao có sự tạo thành những hạt nhỏ mang điện. Sau khi qua ống mao quản dưới tác động của luồng khí nitơ nóng các phân tử dung môi từ từ bay hơi, các hạt mang điện tích nhỏ dần. Sau đó các ion dương hay âm tạo thành được đưa vào bộ phận tách ion qua một cửa rất nhỏ, dung môi và khí nitơ bị bơm hút ra ngoài [21]. - Bộ phân tích khối: có nhiệm vụ tách các ion có trị số m/z khác nhau thành từng phần riêng biệt. - Bộ phận phát hiện ion: Có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ. -Bộ xử lý dữ liệu: Tín hiệu điện được khuyếch đại trước khi chuyển thành tín hiệu phục vụ sử lý dữ liệu theo yêu cầu khác nhau: Ghi phổ, định lượng... * Một số kỹ thuật LC-MS - Kỹ thuật phân tích toàn thang (full scan) Là kỹ thuật phân tích mà phổ khối sẽ đưa ra toàn bộ ion sinh ra từ ion gốc, ta có một sắc đồ toàn ion (Total Ion Chromatogram). Kỹ thuật này có độ nhiễu đường nền rất lớn nên độ nhạy kém [9]. - Kỹ thuật phân tích chọn lọc ion (SIM) Đây là kỹ thuật ngay từ đầu chỉ cho phổ kế nhận diện một ion và ghi sắc đồ theo thời gian. Lúc này sắc đồ chỉ ghi tất cả các mũi có chứa ion đó. Kỹ thuật này có tác dụng làm giảm bớt nhiễu đường nền và do đó làm tăng độ nhạy (tăng tỷ lệ tín hiệu /nhiễu đường nền). Kỹ thuật này thuận lợi để phân tích dư lượng một chất đã biết trong một mẫu phức tạp [9]. - Kỹ thuật MS/MS Kỹ thuật này chọn một ion ở chế độ MS lần 1, ion đó sẽ được phân tích tiếp bằng cách tạo ra mảnh ion nhỏ hơn đặc trưng cho ion trước đó, được phân tích MS lần 2. Nếu tiếp tục chọn ion và bẻ gãy ion ta có kỹ thuật MSn (n là số lần bẻ gẫy ion) [21] Chương 2: Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu. 2.1.Đối tượng nghiên cứu Để xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích AZI trong HT người, chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên các đối tượng sau: - Mẫu trắng: là HT người của viện Huyết học và truyền máu trung ương. - Mẫu chuẩn: là mẫu trắng được thêm AZI với nồng độ xác định. - Mẫu thử: là HT người có sử dụng AZI. 2.2. Hoá chất và thiết bị * Hoá chất : Bảng 2.1: Danh mục hóa chất- thuốc thử- chất chuẩn Tên chất Nguồn gốc Tiêu chuẩn Hàmlượng Hóa chất thuốc thử Diethyl ether Merck - Đức P.A 99,5% Acetonitril Baker - Mỹ HPLC nhà sản xuất 99,9% Methanol Baker - Mỹ HPLC nhà sản xuất 99,8% Natri carbonat Vel - Bỉ P.A Acid boric Vel - Bỉ P.A Kali clorid Vel - Bỉ P.A Amoni acetat Vel - Bỉ P.A FMOC-Cl Aldrich-Mỹ P.A Chất chuẩn Azithromycin Viện kiểm nghiệm TƯ - VN 97,27% Roxithromycin Viện kiểm nghiệm TƯ - VN 97,73% Clarithromycin Viện kiểm nghiệm TƯ - VN 97,82% Chế phẩm HT người Viện huyết học và truyền máu TƯ -VN Viên nén Zithromax Pfizer-USA 250mg * Thiết bị - dụng cụ - Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu 10A-VP - Detector huỳnh quang. - Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ Thermo-Finnigan LCQ Advantage Max. - Bộ lọc dung môi (màng lọc 0,45μm), bộ lọc mẫu (màng lọc 0,2μm) - Máy lắc siêu âm (Brasonic - Mỹ). - Cân phân tích (Sartorius - Đức) - Máy đo pH (Metrohm - Thụy Sĩ). - Máy ly tâm (Jouan - Pháp) - Máy siêu li tâm (Sartorius - Đức) - Tủ lạnh sâu (Frigo - Đan Mạch). - Máy lọc nước siêu sạch (Elga -Anh). - Máy lắc (Labinco - Hà Lan). - Nồi cách thủy. - ống nghiệm lấy máu chứa EDTA, - ống nghiệm teflon dung tích 30ml. - Bình định mức chính xác, pipet chính xác và các dụng cụ thủy tinh khác. 2.3. Phương pháp nghiên cứu Định lượng AZI trong HT là quá trình phân tích phức tạp yêu cầu phương pháp phân tích phải có tính chọn lọc tốt, độ nhạy, độ chính xác cao. Sau khi tìm hiểu sâu về đối tượng nghiên cứu, mục tiêu của đề tài và tham khảo tài liệu chúng tôi đã lựa chọn hai phương án để tiến hành khảo sát đó là: HPLC với detector huỳnh quang và LC-MS. 2.3.1. Khảo sát quy trình định lượng AZI trong dung môi bằng HPLC detector huỳnh quang. *Chuẩn bị dung dịch: - Dung dịch chuẩn AZI nồng độ lần lượt là 5, 10, 25, 50, 100 mg/ml trong methanol - Dung dịch nội chuẩn CLA (IS) 50 mg/ml - Dung dịch dẫn xuất huỳnh quang FMOC-Cl: 0,5mg/ml - Dung dịch đệm Borat 0,1M pH 7,4 * Khảo sát điều kiện chạy sắc ký. Khảo sát về cột, nhiệt độ cột, pha động, tốc độ dòng, detector huỳnh quang (bước sóng kích thích, bước sóng phát xạ) * Khảo sát điều kiện tạo dẫn xuất huỳnh quang. - Khảo sát nhiệt độ phản ứng tạo dẫn xuất: Giữ nguyên các điều kiện phản ứng khác, chỉ thay đổi nhiệt độ từ 30 đến 70oC, cách 10oC - Khảo sát thời gian phản ứng: Giữ nguyên nhiệt độ phản ứng tối ưu là 50oC, thay đổi thời gian phản ứng trong khoảng từ 30 đến 60 phút, cách 10 phút. * Đánh giá một số thông số kỹ thuật của phương pháp. - Tính chọn lọc. - Tính phù hợp của hệ thống sắc ký. - Khoảng tuyến tính. - Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ). 2.3.2. Khảo sát xây dựng quy trình định lượng AZI trong HT bằng LC-MS. 2.3.2.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn. Để giảm các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phân tích và tăng độ chính sác chúng tôi chọn phương pháp nội chuẩn. Sau khi tìm hiểu, tham khảo một số tài liệu chúng tôi chọn hai chất có cùng cấu trúc phân tử là CLA và ROXI để tiến hành khảo sát chọn làm chuẩn nội. - Pha dung dịch chuẩn gốc AZI: cân chính xác chất chuẩn AZI, hòa tan trong methanol để được dung dịch gốc. Từ đó pha thành các dung dịch chuẩn thứ cấp có nồng độ 0,2- 20mg/ml trong methanol. 2.3.2.2. Sử lý mẫu Từ các tính chất lý hóa của AZI và theo các tài liệu đã công bố, chúng tôi chọn xây dựng quy trình sử lý mẫu theo phương pháp chiết lỏng - lỏng. 2.3.2.3. Khảo sát điều kiện để định lượng AZI. Tiến hành chạy thử trên từng mẫu AZI, chuẩn nội (IS) và hỗn hợp AZI và IS trong dung môi pha động để: * Khảo sát điều kiện khối phổ. - Kỹ thuật MS một lần: phân tích toàn thang để xác định ion phân tử. - Kỹ thuật SIM sử dụng ion phân tử để định lượng. * Khảo sát điều kiện sắc ký. - Cột sắc ký: khảo sát khả năng tách của AZI và IS trên các cột: Thermo C18 (50 x 2,1mm; 5mm) và Zorbax C18 SB (150 x4,6; 5mm). - Pha động: dựa vào các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát trên hệ pha động acetonitril : amoni acetat 0,05M với tỷ lệ khác nhau và chạy chế độ đẳng dòng hay gradient. - Tốc độ dòng: thay đổi lưu lượng pha động từ 0,2 – 0,6ml/phút để xác định được tốc độ phù hợp cho thời gian lưu tối ưu. - Tiêm mẫu tự động 25ml 2.3.2.4 Thẩm định phương pháp phân tích * Tính chọn lọc Chuẩn bị mẫu: - HT trắng. - HT có AZI. - HT có IS. - HT có AZI và IS. Xử lý mẫu và tiến hành phân tích * Tính phù hợp của hệ thống sắc ký Chuẩn bị mẫu chuẩn có AZI và IS trong pha động. Tiến hành sắc ký 6 lần liên tiếp, xác định độ lệch chuẩn tương đối của các thông số: thời gian lưu, tỷ số diện tích pic. * Khoảng nồng độ tuyến tính, hàm đáp ứng Chuẩn bị các mẫu HT trắng, thêm AZI và IS tạo thành các mẫu có nồng độ AZI từ 0,02 - 2 mg/ml, xử lý mẫu theo sơ đồ hình 3.1 và tiến hành phân tích. *LOD và LOQ LOD là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có thể xác định được nhưng không nhất thiết phải định lượng được trong điều kiện thí nghiệm cụ thể. LOD được coi là nồng độ chất phân tích gây nên sự tăng tín hiệu đáp ứng 3 lần so với đáp ứng tín hiệu của mẫu trắng (S/N=3). LOQ là nồng độ thấp nhất của chất cần phân tích có thể định lượng được với độ đúng và độ chính xác phù hợp. LOQ được chấp nhận nếu đáp ứng của chất phân tích phải ít nhất gấp 10 lần đáp ứng của mẫu trắng. Trong phương pháp sắc ký độ nhiễu của đường nền có thể thay cho tín hiệu của mẫu trắng. Tiến hành xử lý các mẫu HT trắng và mẫu chuẩn có nồng độ AZI thấp dần và tiến hành phân tích. * Độ đúng Chuẩn bị các mẫu AZI trong HT trắng ở 3 nồng độ khảo sát, mỗi nồng độ làm 5 mẫu, xử lý mẫu và tiến hành phân tích, so sánh giá trị trung bình giữa các lần định lượng của mỗi nồng độ với giá trị thực có trong mẫu, tính theo lượng chuẩn đã cân và thể tích đã pha. *Độ chính xác. Chuẩn bị các mẫu AZI trong HT trắng ở 3 nồng độ, mỗi nồng độ làm 5 mẫu và xử lý như trong phần xác định độ đúng, sau khi tiến hành sác ký, đánh giá độ lệch chuẩn tương đối của các mẫu theo từng nồng độ. 2.3.2.5. Xác định hiệu suất chiết Chuẩn bị các mẫu AZI trong HT trắng ở 3 nồng độ khảo sát, mỗi nồng độ làm 3 mẫu, song song tiến hành sắc ký các mẫu chuẩn pha trong pha động ở 3 nồng độ tương ứng. Đánh giá hiệu suất chiết thông qua so sánh chỉ số diện tích pic trung bình trong HT so với trong pha động ở từng nồng độ tương ứng. 2.3.3. Định lượng thăm dò AZI trong HT người uống AZI Tiến hành lấy máu định lượng AZI trong HT 2 người tình nguyện sử dụng chế phẩm có chứa AZI ( uống 2 viên nén Athromax hàm lượng 250 mg). Mỗi người được lấy máu ở 2 thời điểm, sau uống thuốc 1 giờ và 1,75 giờ. Lấy máu tĩnh mạch cánh tay vào ống nghiệm có chứa EDTA, ly tâm lấy HT thêm chuẩn nội, xử lý mẫu và tiến hành phân tích. 2.3.4. Phân tích số liệu thực nghiệm Tính toán các số liệu: giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, độ lệch chuẩn tương đối, phương trình hồi quy và hệ số tương quan hồi quy bằng chương trình phần mềm Microsoft Excel. Chương 3: Kết quả 3.1. Xây dựng quy trình xử lý mẫu Từ các tính chất lý hóa của AZI và theo các tài liệu đã công bố, trên cơ sở điều kiện hiện có chúng tôi xây dựng quy trình chiết AZI từ HT theo phương pháp chiết lỏng-lỏng. - Kiềm hóa bằng Na2CO3 0.05M - Dung môi chiết: Diethyl ether - Thể tích dung môi:10ml - Thời gian lắc xoáy: 3 phút - Nhiệt độ cô bay hơi dung môi: 45oC Quy trình xử lý mẫu được trình bày cụ thể tại hình 3.1  0,5ml HT+ 0,1ml IS Hỗn hợp chiết Lắc xoáy 30 giây HT đã kiềm hóa + Kiềm hóa bằng 0,4ml đệm Carbonat 0,05M + Lắc xoáy 30 giây Dịch chiết + Dung môi chiết (10ml) + Lắc xoáy 5 phút + Siêu ly tâm 10phút (12.500 vòng/phút) + Hút 7 ml dung môi Cắn khô Bốc hơi cách thủy 45oC Dung dịch trong Dịch lọc + 0,7 ml pha động + Lắc xoáy 60 giây Lọc qua màng lọc có đường kính lỗ lọc 0,2mm Chạy sắc ký Hình 3.1. Sơ đồ quy trình chiết AZI trong HT 3.2. Khảo sát quy trình định lượng AZI trong dung môi bằng HPLC detector huỳnh quang. Định lượng AZI trong nền mẫu HT bằng phương pháp HPLC với detector huỳnh quang đòi hỏi trải qua quá trình xử lý mẫu phức tạp và quá trình dẫn xuất hóa để tạo chất phát huỳnh quang. Trước hết, tiến hành khảo sát trên mẫu AZI chuẩn pha trong acetonitril. Để hạn chế các sai số có thể gặp phải chúng tôi lựa chọn sử dụng chất nội chuẩn. Qua quá trình khảo sát chúng tôi chọn CLA là một chất có nhiều tính chất tương đồng với AZI làm chất nội chuẩn. *Chuẩn bị dung dịch chuẩn: - Dung dịch chuẩn gốc AZI: Cân chính xác một lượng chất chuẩn AZI pha trong acetonitril sao cho thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1000 mg/ml. Từ dung dịch chuẩn gốc AZI pha loãng bằng acetonitril để thu được các dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ lần lượt là 5, 10, 25, 50, 100 mg/ml - Dung dịch nội chuẩn CLA 50 mg/ml trong acetonitril *Dung dịch dẫn xuất huỳnh quang FMOC-Cl: 0,5mg/ml pha trong acetonitril *Dung dịch đệm Borat 0,1M pH 7,4 (0,625g acid boric và 0,750 KCl pha trong 100ml nước, chỉnh pH tới 7,4). 3.2.1.Điều kiện chạy sắc ký để định lượng AZI Qua khảo sát các điều kiện phân tích, chúng tôi đã chọn lựa điều kiện phân tích như sau: Cột: C18 (150 mm x 4,6 mm x 5 m) của Symmestry Waters Nhiệt độ cột: 400C Pha động: Acetonitril: Đệm phosphat 0,1M pH 7,7 (76:24) Tốc độ dòng: 1,5ml/phút Tiêm mẫu: 50ml Detector huỳnh quang: Bước sóng kích thích: 270 nm Bước sóng phát xạ: 317 nm 3.2.2. Khảo sát điều kiện tạo dẫn xuất huỳnh quang Dẫn xuất hóa với FMOC-Cl để tạo dẫn xuất phát huỳnh quang Theo các nghiên cứu trước đây, nhiều tác giả đã sử dụng FMOC-Cl để tạo dẫn xuất huỳnh quang cho định lượng nhiều chất thuộc nhóm Macrolid, trong đó có AZI. Chúng tôi triển khai nghiên cứu các điều kiện phản ứng cho tối ưu với điều kiện ở phòng thí nghiệm. Dung dịch dẫn xuất hóa FMOC-Cl được pha trong acetonitril với nồng độ giữ cố định 0,5mg/ml và phản ứng được thực hiện ở pH 7,4 [10]. Hai thông số chúng tôi khảo sát thêm là nhiệt độ tiến hành phản ứng và thời gian phản ứng. *Chuẩn bị dung dịch chuẩn tiến hành dẫn xuất hóa Chuẩn bị 5 ống nghiệm thủy tinh có nắp kín và tiến hành theo bảng sau: Bảng 3.1: Quy trình tạo dãy mẫu chuẩn và dẫn xuất hóa ống Chuẩn 1 2 3 4 5 AZI 5mg/ml 0,1ml AZI 10mg/ml 0,1ml AZI 25mg/ml 0,1ml AZI 50mg/ml 0,1ml AZI 100mg/ml 0,1ml CLA 50mg/ml 0,1ml 0,1ml 0,1ml 0,1ml 0,1ml Thổi khô bằng khí Nitơ ở nhiệt độ < 500C Dung dịch FMOC-Cl 0,5mg/ml 0,8ml 0,8ml 0,8ml 0,8ml 0,8ml Dung dịch đệm Borat pH 7,4 0,2ml 0,2ml 0,2ml 0,2ml 0,2ml Lắc xoáy 30s Phản ứng ở 500C trong 40 phút Làm lạnh, lọc qua màng lọc 0,45mm và bơm vào HPLC Nồng độ chuẩn AZI/dung dịch (mg/ml) 0,5 1,0 2,5 5,0 10,0 * Khảo sát nhiệt độ phản ứng: Giữ nguyên các điều kiện phản ứng khác, chỉ thay đổi nhiệt độ từ 30, 40, 50, 60, 70o C. Kết quả được thể hiện theo biểu đồ sau: Hình 3.2. Kết quả khảo sát nhiệt độ phản ứng tạo dẫn xuất huỳnh quang Kết quả cho thấy ở nhiệt độ 500C là nhiệt độ mà phản ứng đạt được hiệu suất tốt nhất * Khảo sát thời gian phản ứng Giữ nguyên nhiệt độ phản ứng tối ưu là 50oC, thay đổi thời gian phản ứng trong khoảng từ 30 đến 60 phút. Kết quả thu được theo biểu đồ sau: Hình 3.3. Kết quả khảo sát thời gian phản ứng tạo dẫn xuất huỳnh quang Kết quả cho thấy phản ứng xảy ra tốt nhất trong vòng khoảng 40 phút, do đó chúng tôi quyết định chọn thời gian phản ứng là 40 phút và phản ứng ở 50 0C. Tổng kết các điều kiện dẫn xuất hóa: + Nồng độ thuốc thử FMOC-Cl: 0,5mg/ml, pH 7,4. + Nhiệt độ 500C + Thời gian 40 phút 3.2.3. Kết quả đánh giá một số chỉ tiêu thẩm định. *Tính chọn lọc: Chuẩn bị: Mẫu trắng Mẫu có AZI Mẫu có CLA Mẫu có AZI và CLA Tiến hành dẫn xuất hóa và chạy sắc ký. Hình 3.4: Sắc ký đồ mẫu trắng Hình 3.5: Sắc ký đồ mẫu có AZI Hình 3.6: Sắc ký đồ mẫu có CLA Hình 3.7: Sắc ký đồ mẫu có AZI và CLA Nhận xét: trên sắc ký đồ mẫu trắng tại các vị trí tương ứng với thời gian lưu của các pic AZI và CLA đã dẫn xuất hóa không xuất hiện pic lạ, các pic AZI và CLA cân đối, sắc nét, tách riêng biệt. Từ các kết quả trên cho thấy phương pháp có tính chọn lọc tốt. *Tính phù hợp của hệ thống HPLC: Chuẩn bị mẫu chuẩn có Azi nồng độ 10mg/ml và CLA nồng độ 5mg/ml và tiến hành phản ứng dẫn xuất hóa và phân tích theo điều kiện sắc ký đã xác định. Tiến hành sắc ký 6 lần liên tiếp, xác định độ lệch chuẩn tương đối của các thông số: thời gian lưu, tỷ số diện tích pic. Bảng 3.2.: Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống HPLC Lần tiêm Thời gian lưu AZI(phút) Diện tích pic AZI(Volts*s) Thời gian lưu CLA(phút) Diện tích pic CLA (Volts*s ) Tỷ số dt AZI/CLA 1 12,94 1709837 10,61 244582 6,99 2 13,21 1774072 10,87 236838 7,49 3 13,24 1787837 10,75 256497 6,97 4 13,13 1770982 10,70 243870 7,26 5 12,87 1761861 10,54 244921 7,19 6 13,01 1771063 10,72 243981 7,26 TB 13,07 1766,11 7,19 SD 0,15 4299,78 0,19 RSD (%) 1,15 1,06 2,70 Nhận xét: độ lệch chuẩn tương đối của các thông số phân tích đều nhỏ hơn 3%, điều này chứng tỏ hệ thống sắc ký có tính thích hợp chấp nhận được. *Khoảng tuyến tính: Chuẩn bị các mẫu có nồng độ AZI từ 0,5 – 10,0 mg/ml và CLA có nồng độ cố định 5,0mg/ml, tiến hành dẫn xuất huỳnh quang, phân tích theo quy trình đã xác định. Bảng 3.3: Sự phụ thuộc giữa tỷ số diện tích pic và nồng độ AZI Nồng độ AZI (mg/ml) Diện tích pic AZI(Volts*s) Diện tích pic CLA(Volts*s) Tỷ số diện tích píc 0,5 68486 255288 0,26827 1,0 143670 254804 0,563845 2,5 412723 244074 1,690975 5,0 849246 230574 3,683182 10,0 1796312 250506 7,170734 Phương trình hồi qui: Y=0,7315X – 0,0982 Hệ số tương quan : R2= 0,9993 Trong đó : Y là tỷ số diện tích pic (AZI/CLA) X là nồng độ AZI Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa tỷ số diện tích pic và nồng độ AZI Nhận xét: Từ các kết quả trên cho thấy có sự phụ thuộc tuyến tính giữa tỷ số diện tích pic (AZI/CLA) và nồng độ AZI. Đường chuẩn hồi quy có dạng thẳng và hệ số tương quan lớn hơn 0,999 chứng tỏ có sự tương quan tuyến tính chặt giữa tỷ số diện tích pic (AZI/CLA) và nồng độ AZI ở trong khoảng nồng độ khảo sát. *LOD và LOQ: Tại nồng độ 0,5mg/ml dựa vào sắc ký đồ và theo kết quả tính toán ta thấy tỷ lệ S/N 10. Vậy ta có: LOQ = 0,5 mg/ml LOD = 0,5/3,3 = 0,15 mg/ml Hình 3.9: Sắc ký đồ AZI 0,5mg/ml và CLA 5,0mg/ml Nhận xét: Với LOQ là 0,5 mg/ml, rất khó có thể áp dụng phương pháp HPLC với detector huỳnh quang đã khảo sát trên để phân tích AZI trong HT vì theo một số nghiên cứu thì AZI có Cmax = 0,33238±0,09012mg/ml trong HT[16], Cmax= 0,3942±0,1339mg/ml trong huyết thanh[10], khi uống 2 viên Zithromax(Pfizer,USA) 250mg. Vì vậy chúng tôi chuyển sang khảo sát xây dựng quy trình định lượng AZI trong HT bằng LC-MS để đạt được độ nhạy phù hợp. 3.3. Khảo sát xây dựng chương trình LC-MS để định lượng AZI trong HT 3.3.1.Khảo sát lựa chọn chất chuẩn nội Bơm trực tiếp lần lượt dung dịch AZI, CLA và ROXI có nồng độ 500ng/ml trong acetonitril : amoni acetat 0,05M (1:1) vào hệ thống khối phổ với tốc độ 5μl/phút, với chế độ phun điện tử ion dương ( +ESI). Phổ khối của AZI, CLA và ROXI được ghi ở hình 3.10, 3.11 và 3.12. Hình3.10.Phổ khối AZI Hình3.11.Phổ khối CLA Hình3.12.Phổ khối ROXI Sau khi khảo sát chúng tôi chọn ROXI làm chất chuẩn nội vì có mảnh khối mẹ m/z= 837,7 khác nhiều so với mảnh mẹ của AZI, trong khi đó CLA có mảnh khối quá gần AZI (chỉ khác nhau 1 đơn vị) 3.3.2. Xác định điều kiện khối phổ *Tối ưu hóa điều kiện bắt ion phân tích ( ion mẹ m/z) Để xác định điều kiện khối phổ, trước tiên chúng tôi pha từng chất trong pha động, sau đó bơm trực tiếp bằng syringe và chạy chương trình Tune để điều chỉnh các thông số khối phổ. Quá trình tiến hành như sau: - Pha dung dịch chuẩn AZI và ROXI riêng rẽ trong acetonitril : amoni acetat 0,05M (1:1) có nồng độ 500ng/ml. - Bật máy khối phổ, khởi động phần mềm điều khiển trên màn hình windows (Instrument Setup) vào Tune Plus, xuất hiện cửa sổ Tune Plus, chọn chế độ +ESI. - Bơm dung dịch AZI 500ng/ml vào hệ thống khối phổ với tốc độ 5μl/phút, sau một thời gian sẽ xuất hiện mảnh ion mẹ có m/z= 749,3. Nhấn vào biểu tượng Tune trên màn hình sẽ xuất hiện cửa sổ chạy chế độ Automatic Tune, trong ô Mass (m/z) đánh số 749 để Tune cho mảnh mẹ, máy sẽ tự động điều chỉnh và tối ưu hóa các thông số sao cho bắt ion m/z= 749 tốt và nhạy nhất. Quá trình này diễn ra trong khoảng 5 phút. Sau khi máy đã tự động điều chỉnh sẽ cho tín hiệu của ion m/z lớn hơn ban đầu. Lưu file Tune này với tên AZI.LCQ Tune. - Tiến hành như trên với dung dịch ROXI, mảnh ion mẹ có m/z= 837 lưu lại file Tune với tên ROXI.LCQ Tune * Tối ưu hóa điều kiện bắt ion phân tích dưới điều kiện tốc độ dòng của sắc ký lỏng. - Gọi chương trình Tune Plus và phương pháp Tune như đã nêu, gọi file AZI.LCQ Tune. - Tiếp tục điều chỉnh tối ưu hóa điều kiện khối phổ ở điều kiện thực tế của sắc ký lỏng (tốc độ dòng 0,5ml/ phút). Tiến hành bơm AZI nồng độ 500ng/ml vào hệ thống khối phổ với tốc độ 5ml/phút và được trộn với dòng dung môi sắc ký qua bộ trộn hình chữ T (T Union). Lượng dung môi theo dòng sắc ký lúc này là 0,5ml/phút gấp 100 lần lúc trước (5ml/phút), do đó cần thiết phải dùng khí để bay hơi dung môi, chọn Sheath gas=30; Auxilary gas=20. Sau một thời gian sẽ xuất hiện mảnh khối m/z 749, quá trình Tune tiếp tục được tiến hành tương tự như đã nêu ở trên sau đó lưu lại file Tune với tên AZI Flow 0,5mlph.LCQ Tune. - Tiến hành tương tự với ROXI ghi lại file Tune với tên ROXI flow 0,5mlph.LCQ Tune. Như vậy ngoài các thông số được lựa trọn tối ưu tự động cần thiết lập một số thông số sau: - MS chế độ SIM: + Chọn ion có m/z từ 748-750 (để xác định AZI), + Chọn ion có m/z từ 836- 838 (để xác định ROXI). - Sheath Gas: 30 - Auxilary Gas: 20 3.3.3. Xác định chương trình sắc ký. *Khảo sát cột sắc ký: Pha dung dịch chuẩn AZI 1mg/ml và dung dịch chuẩn ROXI 10mg/ml trong pha động, chạy LC-MS chế độ SIM, pha động acetonitril : amoni acetat 0,05M(5:5). (AZI) (ROXI) Hình 3.13. Sắc ký đồ AZI và ROXI chạy cột Thermo C18(50x2,1mm; 5mm) (AZI) (ROXI) Hình 3.14: Sắc ký đồ AZI và ROXI chạy cột Zorbax C18 SB (150x4,6; 5mm) Cột Thermo cho pic xấu, kéo đuôi thời gian lưu của AZI và ROXI gần trùng nhau. Chúng tôi chọn sử dung cột Zorbax C18 SB (150 x4,6; 5mm) vì cho pic tương đối đẹp với thời gian lưu hợp lý. *Pha động: Khảo sát hệ pha động acetonitril : amoni acetat 0,05M với các tỷ lệ (9:1),(8:2), (7:3) ,(6:4) và (5:5). Kết quả khảo sát cho thấy với tỷ lệ (6:4) có khả năng tách tốt nhất, cho 2 pic sắc nét tách rời nhau, chân pic gọn, cân đối và có thời gian phân tích hợp lý. Khảo sát chạy pha động theo chế độ gradient như sau: Pha động kênh A ( NH4CH3COO 50mM), kênh B(MeCN) Chạy chế độ Gradient bắt đầu 40% B thay đổi tuyến tính tới 90%B trong 1,5 phút. Sau đó duy trì 90%B trong 0,5 phút rồi trở lại tỷ lệ ban đầu nhưng kết quả pic thu được không tốt bằng chạy chế độ đẳng dòng, pic bị kéo đuôi và rất tù. Do vậy, trong quá trình xây dưng phương pháp, chúng tôi chọn hệ dung môi này với tỷ lệ 6:4 và không sử dụng chế độ trộn tự động. - Tốc độ dòng: qua khảo sát lưu lượng dòng từ 0,2 – 0,6ml/phút cho thấy lưu lượng dòng là 0,5 ml/phút là tối ưu vì vẫn có khả năng tách riêng AZI và ROXI, lại có thời gian phân tích hợp lý. - Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng - Thể tích tiêm: tiêm tự động với thể tích 25ml. - Điều kiện phân tích khối phổ: theo các thông số đã được thiết lập ở trên. Hình 3.15: Sắc ký đồ AZI và ROXI chạy chế độ đẳng dòng 0,5ml/phút hệ dung môi acetonitril : amoni acetat 0,05M(6:4) 3.3.4. Kết quả thẩm định p