Luận văn Xây dựng phương pháp xác định một số kháng sinh β lactam trong nước thải nhà máy dược phẩm bằng sắc ký lỏng khối phổ

S: 0212190.02 HL: 94,37% (NT) 4 Cefaclor monohydrat Chuẩn VKN Chuẩn VKN SKS: 0309042 HL: 94,71% (NT) 5 Cefotaxim natri Chuẩn VKN Chuẩn VKN SKS: QT232 010514 HL: 92,19% (NT) 6 Cefixim trihydrat Chuẩn VKN Chuẩn VKN SKS: 0105192, HL:93,16%(k), HLH2O = 10,57%, HLEtOH = 0,04% 19 7 Trimethoprim 13C3 TCCS CIL - Mỹ SKS: SDED-002 HL: 50µg/ml 8 Methanol HPLC Merck - Đức 9 Acetonitril HPLC Merck - Đức 10 Acid acetic PA Merck - Đức 11 Acid formic PA Merck - Đức 12 Acid hydrocloric AR Trung Quốc 13 Triethylamin PA Merck - Đức 15 Natri edetat PA Merck - Đức 16 Nƣớc cất Tinh khiết 2.1.2. Máy móc - trang thiết bị - Máy sắc ký lỏng khối phổ Agilent Triple Quad LC/MS 6460 (Mỹ) - Cột Agilent Zorbax Eclipse XDB - C18 (150mm x 3mm; 3,5µm), cột Agilent SB - C18 (1,8 μm; 2,1 x 50mm) - Mỹ. - Cột chiết pha rắn OASIS HLB 6cc Vac Cartridge 200mg, 6ml, lô 090A, Oasis (Mỹ) - Máy siêu âm Ultrasonic Cleaner Set, Wisd (Hàn quốc) - Máy đo pH Eutech Instruments pH 510, Cyberscan (Mỹ) - Cân phân tích Mettler Toledo AB 204 (chính xác đến 0,1mg), Thụy sỹ. - Bộ lọc hút chân không - Thiết bị đuổi dung môi bằng khí nitơ - Các dụng cụ thủy tinh trong phân tích class A (Đức) 20 2.1.3. Đối tượng nghiên cứu - Mẫu trắng: Nƣớc thải ở các cơ sở sản xuất đã đƣợc kiểm tra bằng sắc ký lỏng khối phổ không có các kháng sinh nghiên cứu. - Mẫu thử: Nƣớc thải ở các cơ sở có sản xuất kháng sinh nhóm β- lactam nghiên cứu. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp thu thập và xử lý mẫu thô trước khi tiến hành chiết tách - Lấy nƣớc thải từ nhà máy sản xuất kháng sinh. - Lọc và bảo quản mẫu sau khi lấy ở 2 - 8 oC và tiến hành phân tích trong 24h hoặc ở -30oC trong 1 tháng. 2.2.2. Phương pháp chiết tách β-lactam từ nước thải Do mẫu có tính chất phức tạp và lƣợng chất phân tích trong mẫu (nếu có) rất nhỏ, lựa chọn xử lý mẫu bằng phƣơng pháp chiết pha rắn. Để tìm đƣợc quy trình tối ƣu chiết tách và làm giàu mẫu với các kháng sinh β- lactam nghiên cứu, tiến hành khảo sát các nội dung sau: - Loại dung môi rửa giải: tiến hành khảo sát so sánh với 3 loại dung môi khác nhau - Thể tích mẫu chiết: tiến hành khảo sát với hai mức thể tích mẫu thử: 100 ml, 200 ml 2.2.3. Xây dựng phương pháp định lượng bằng LCMS/MS Tiến hành khảo sát theo các nội dung sau: a. Lựa chọn chuẩn nội: Qua tham khảo các tài liệu [20][22][26][27], sử dụng chuẩn nội là Trimethoprim 13C3 để đảm bảo phân tách tốt và phù hợp với các chất phân tích (có tính chất tƣơng tự với các chất phân tích). b. Khảo sát điều kiện khối phổ: 21  Tiến hành phân tích trên thiết bị có bộ phân tích khối dạng tứ cực chập ba. Tiến hành lựa chọn nguồn ion, thế ion hóa, ion mẹ, điều kiện phân mảnh và các ion con để phân tích đƣợc đồng thời các kháng sinh trong hỗn hợp. Tiến hành khảo sát, tìm điều kiện khối phổ phân tích đồng thời 06 kháng sinh: Amoxicilin, cefadroxil, cefotaxim, cefaclor, cephalexin và cefixim.  Khảo sát điều kiện sắc ký: cột sắc ký, thành phần và tỷ lệ pha động, tốc độ dòng, thể tích tiêm ... để có thể tách và phát hiện đồng thời các kháng sinh β-lactam nghiên cứu, sắc ký đồ sắc nét và thời gian phân tích không quá dài. c. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu: - Khảo sát loại dung môi rửa giải - Khảo sát thể tích mẫu sử dụng 2.2.4. Thẩm định quy trình phân tích đã xây dựng Tiến hành thẩm định phƣơng pháp trên mẫu tự tạo chứa các kháng sinh nghiên cứu với các chỉ tiêu: - Độ đặc hiệu của phƣơng pháp - Độ thích hợp của hệ thống - Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng - Độ tuyến tính và khoảng xác định - Độ đúng của phƣơng pháp - Độ lặp lại - Hiệu suất chiết SPE. 2.2.5. Lấy mẫu, phân tích một số β-lactam trong thực tế Mẫu nƣớc thải đƣợc lấy ở một số xí nghiệp Dƣợc có số đăng ký kháng sinh β-lactam để đánh giá sự có mặt và hàm lƣợng của các kháng sinh nghiên cứu theo quy trình đã xây dựng đƣợc ở trên. Lấy mẫu ngẫu nhiên ở 22 các cơ sở sản xuất và ở các thời điểm khác nhau: ngày cuối tuần và các ngày trong tuần. Tiến hành lấy mẫu nƣớc thải đầu vào và đầu ra của hệ thống xử lý nƣớc thải. 2.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu - Phần mềm Microsoft Excel để tính toán và xử lý thống kê. - Nồng độ dƣ lƣợng kháng sinh trong mẫu thực đƣợc tính dựa vào phƣơng trình hồi quy tuyến tính biểu diễn mối tƣơng quan giữa tỷ số diện tích pic chất phân tích với diện tích chuẩn nội và nồng độ chất phân tích với hệ số tƣơng quan không nhỏ hơn 0,99. 23 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Xây dựng phƣơng pháp phân tích đồng thời các kháng sinh β- lactam trong nƣớc thải công nghiệp dƣợc 3.1.1. Khảo sát và lựa chọn các điều kiện khối phổ 3.1.1.1. Điều kiện khối phổ Để phân tích các kháng sinh β-lactam bằng sắc ký lỏng khối phổ hai lần, cần xác định đƣợc ion mẹ và ion con của các chất nghiên cứu. Với kỹ thuật ion hóa ESI (+), các ion mẹ thƣờng đƣợc tạo thành bằng cách thêm một photon vào phân tử của chất đó, tạo ra ion (M+H)+. Tiếp sau đó, cần phải xác định đƣợc các ion con tạo thành từ ion mẹ trên để định tính và định lƣợng. Sử dụng dung dịch các kháng sinh có nồng độ 10 mg/L tiêm không qua cột với hệ dung môi Acetonitril - Nƣớc (1 : 1) có chứa acid formic 0,1% vào hệ thống MS để xác định ion mẹ và hai ion con đối với mỗi kháng sinh. Dùng ion con có tín hiệu lớn và ổn định hơn làm ion định lƣợng, ion con còn lại dùng để định tính. Các điều kiện phân mảnh ion nhƣ thế đầu vào (Fragment voltage: Frag), năng lƣợng bắn phá (CE) đƣợc tối ƣu hóa tự động theo thiết bị khối phổ. Các kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.1. Bảng 3.1. Các điều kiện khối phổ để phân tích các kháng sinh nghiên cứu TT Tên kháng sinh Ion mẹ (m/z) Ion định lƣợng Ion định tính Ion (m/z) CE (eV) Frag (V) Ion (m/z) CE (eV) Frag (V) 1 Cefotaxim 456,1 167,1 17 130 396,2 9 130 2 Cefixim 454,0 284,9 9 125 125,9 20 125 3 Cefaclor 368,1 174,0 5 86 191,0 5 86 4 Amoxicilin 366,1 113,8 17 110 348,9 5 110 5 Cefadroxil 364,1 113,9 13 86 207,9 1 86 24 6 Cephalexin 348,0 157,9 5 100 139,9 20 100 7 Trimethoprim 13C3 (IS) 294,0 233,0 21 154 126,0 21 154 Sau khi đã khảo sát và lựa chọn đƣợc điều kiện phân mảnh, tiếp tục khảo sát và lựa chọn điều kiện của nguồn ion hóa. Tiến hành tiêm dung dịch chuẩn nồng độ 10mg/L không qua cột vào MS nhƣ trên, tốc độ dòng 0,3ml/phút. Tiến hành lựa chọn các thông số: Thế nguồn ion hóa, nhiệt độ khí, tốc độ khí phun, áp suất đầu phun để tối ƣu hóa tín hiệu thu đƣợc. Các thông số lựa chọn đƣợc trình bày ở bảng 3.2. Bảng 3.2. Các thông số hoạt động của nguồn ion hóa Thông số (đơn vị) Giá trị tối ƣu Nhiệt độ khí phun (oC) 300 Tốc độ khí (l/phút) 11 Áp suất đầu phun (psi) 25 Thế nguồn ion hóa (V) 4000 Nhận xét: các điều kiện ion hóa và điều kiện phân mảnh ở bảng 3.1 và bảng 3.2 đã xác định đƣợc điều kiện MS/MS để phân tích các kháng sinh nghiên cứu và chất chuẩn nội. Trong đó, mỗi chất đƣợc xác định bằng một ion mẹ và hai ion con dùng để định lƣợng và định danh. Kết quả này đáp ứng yêu cầu hiện nay đối với phƣơng pháp phân tích bằng LCMS/MS của các tổ chức quốc tế với số điểm nhận dạng (IP) là 4. 25 Hình 3.1. Phổ đồ của 6 kháng sinh nhóm β-lactam Cephalexin Cefaclor Amoxicilin Cefadroxil Cefixim Cefotaxim 26 3.1.1.2. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký Để khảo sát điều kiện sắc ký, từ các dung dịch chuẩn gốc 1mg/ml tiến hành pha hỗn hợp các kháng sinh nghiên cứu có nồng độ 100ng/ml và IS có nồng độ 10ng/ml, sử dụng hỗn hợp dung môi methanol - nƣớc (1 : 1). Tiến hành tiêm 10µl vào hệ thống sắc ký.  Cột sắc ký Cột sắc ký có vai trò phân tách các chất và các thành phần khác nhau trong mẫu. Trong nghiên cứu này, cột pha đảo C18 đƣợc lựa chọn để sử dụng vì là loại cột phổ biến, phù hợp với các chất phân tích trong nghiên cứu. Tiến hành khảo sát hai loại cột là: Cột Agilent SB - C18 (50mm x 2,1mm; 1,8µm) (cột 1) và cột Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18 (150mm x 3mm; 3,5µm) (cột 2). Sử dụng cùng hệ pha động. Sắc ký đồ tổng hợp của các kháng sinh nghiên cứu sử dụng hai loại cột trên đƣợc trình bày ở hình 3.2. Hình 3.2a. Sắc ký đồ các 6 kháng sinh β-lactam (cột Agilent SB - C18 (50mm x 2,1mm; 1,8µm)) Cefotaxim Cefixim Amoxicilin Cefaclor Cefadroxil Cephalexin 27 Hình 3.2b. Sắc ký đồ các 6 kháng sinh β-lactam (Cột Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18 (150mm x 3mm; 3,5µm)) Nhận xét: từ kết quả sắc ký đồ của các kháng sinh cho thấy: cả hai cột đều cho kết quả tách tốt đối với các chất phân tích. Sử dụng cột 1 cho thời gian phân tích các kháng sinh ngắn hơn so với cột 2, vì vậy ít tốn dung môi hơn. Tuy nhiên, với cùng một thể tích tiêm 5µl, cột thứ 2 cho pic cân đối hơn và đáp ứng lớn hơn. Do các chất phân tích trong mẫu có nồng độ nhỏ nên ƣu tiên lựa chọn cột 2 (có dung lƣợng cột lớn hơn) để phân tích. Ngoài ra, detector khối phổ có ƣu điểm là phân tích các chất dựa trên tỷ số khối lƣợng trên điện tích các ion (m/z) nên đạt đƣợc hiệu quả tách các chất cao mà không phụ thuộc vào thời gian lƣu của chúng. Hình 3.2 cho thấy sắc ký đồ mảnh ion của cefotaxim và cefixim tách hoàn toàn nhờ khối phổ mặc dù có thời gian lƣu rất gần nhau (4,727 phút và 4,733 phút). Cefotaxim Cefixim Amoxicilin Cefaclor Cefadroxil Cephalexin IS 28  Pha động Pha động trong sắc ký lỏng khối phổ đƣợc sử dụng với hai mục đích: phân tách các chất khi đƣa chất phân tích qua cột sắc ký và tác động vào quá trình ion hóa của các chất phân tích. Trong kỹ thuật ion hóa ESI (+), các chất cung cấp photon (ví dụ: acid formic, acid acetic, amoni acetat) thƣờng đƣợc thêm vào pha động để tăng khả năng ion hóa các chất phân tích. Trong đa số các nghiên cứu đã đƣợc thực hiện để phân tích hỗn hợp kháng sinh bằng LCMS/MS, pha động chứa acid formic 0,1% trong hỗn hợp Acetonitril và Nƣớc đƣợc sử dụng để phân tách các kháng sinh. Hệ pha động chứa các thành phần nhƣ trên đã đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này. Sử dụng hỗn hợp kháng sinh nồng độ 100ng/ml và IS 10ng/ml ở trên để tiếp tục khảo sát pha động. Tiến hành khảo sát với các thông số khác nhƣ sau: - Cột: Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18 (150mm x 3mm; 3,5µm) - Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng - Thể tích tiêm: 10µl - Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút - Các điều kiện khối phổ theo bảng 3.1 và 3.2 - Thời gian giữa các lần phân tích (postrun): 5 phút - Pha động A: Acid formic 0,1% trong nƣớc Pha động B: Acid formic 0,1% trong acetonitril Các điều kiện pha động khảo sát và kết quả đƣợc tổng hợp ở bảng 3.3 29 Bảng 3.3. Điều kiện khảo sát pha động và kết quả TT Điều kiện gradient Nhận xét Thời gian (phút) Pha động A (%) Pha động B (%) 1 0 – 1 95 5 Các pic cân đối, thời gian phân tích trong khoảng từ 4 đến 5 phút 1 – 5 95 → 0 5 → 100 5 – 8 0 100 8 – 8,5 0 → 95 100 → 5 8,5 – 9 95 5 2 0 – 1 95 5 Các pic có độ rộng chân pic lớn hơn, sắc ký đồ của cefadroxil có nhiều pic tạp hơn so với chƣơng trình gradient 1 1 – 5 95 → 5 5 → 95 5 – 8 5 95 8 – 8,5 5 → 95 95 → 5 8,5 – 9 95 5 Hình 3.3a. SKĐ các KS theo gradient 1, tốc độ 0,5ml/phút, thể tích tiêm10µl Cefotaxim Cefixim Amoxicilin Cefaclor Cefadroxil Cephalexin IS 30 Hình 3.3b. Sắc ký đồ các kháng sinh theo gradient 2 tốc độ 0,5ml/phút, thể tích tiêm10µl Các kết quả ở bảng 3.3 cho thấy gradient 1 cho kết quả sắc ký đồ tốt nhất. Vì vậy điều kiện pha động theo gradient này đƣợc sử dụng trong nghiên cứu tiếp theo.  Tốc độ dòng pha động Trong kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ, tốc độ dòng pha động phải phù hợp với lƣợng khí phun và áp suất đầu phun. Nếu tốc độ dòng quá thấp, thời gian phân tích sẽ dài và ảnh hƣởng đến hình dạng pic. Ngƣợc lại, nếu tốc độ dòng quá cao, mẫu dễ bị mất do chƣa kịp ion hóa và có thể lẫn nhiều tạp dung môi. Sử dụng dung dịch chuẩn hỗn hợp các kháng sinh nghiên cứu ở nồng độ 100ng/ml và IS nồng độ 10ng/ml tiêm vào hệ thống sắc ký với các điều kiện cột, pha động, thể tích tiêm và nhiệt độ cột nhƣ trên. Tiến hành khảo sát với ba tốc độ dòng: 0,3 ml/phút; 0,5 ml/phút và 0,6ml/phút. Kết quả sắc Cefotaxim Cefixim Amoxicilin Cefaclor Cefadroxil Cephalexin IS 31 ký đồ các kháng sinh khi phân tích với các tốc độ dòng khác nhau đƣợc thể hiện ở hình 3.3a; hình 3.4 Hình 3.4a. Sắc ký đồ phân tích các kháng sinh với tốc độ dòng 0,3ml/phút Hình 3.4b. Sắc ký đồ phân tích các kháng sinh với tốc độ dòng 0,6ml/phút Nhận xét: Sắc ký đồ thu đƣợc với các tốc độ dòng khác nhau cho thấy: với tốc độ dòng 0,3 ml/phút, sắc ký đồ thu đƣợc có các pic tách nhau Cefotaxim Cefixim Amoxicilin Cefaclor Cefadroxil Cephalexin IS Cefotaxim Cefixim Amoxicilin Cefaclor Cefadroxil Cephalexin 32 tốt nhƣng độ rộng chân pic lớn hơn so với tốc độ dòng 0,5ml/phút, một số pic không cân xứng. Ngƣợc lại, tốc độ dòng 0,6 cho sắc ký đồ có các pic không rõ ràng do nhiễu đƣờng nền lớn, pic xấu. Sắc ký đồ với tốc độ dòng 0,5ml/phút cho các pic tách tốt, nhiễu nền nhỏ. Vì vậy, chọn tốc độ dòng 0,5ml/phút để tiến hành phân tích.  Thể tích tiêm Thể tích tiêm mẫu quyết định lƣợng mẫu đƣợc đƣa vào cột. Vì vậy, cần chọn thể tích tiêm mẫu phù hợp để thu đƣợc các pic cân xứng và có giới hạn phát hiện phù hợp. Tiến hành tiêm vào hệ thống sắc ký hỗn hợp dung dịch các kháng sinh với các thể tích tiêm 5; 10 và 20 µl. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.3a; hình 3.5. Hình 3.5a. Sắc ký đồ các kháng sinh với thể tích tiêm 5µl Cefotaxim Cefixim Amoxicilin Cefaclor Cefadroxil Cephalexin IS 33 Hình 3.5b. Sắc ký đồ các kháng sinh với thể tích tiêm 20µl Nhận xét: Với thể tích tiêm 5µl, các pic thu đƣợc cân xứng, độ rộng chân pic nhỏ nhƣng đồng thời, diện tích pic thu đƣợc nhỏ hơn. Với thể tích tiêm 20µl, sắc ký đồ của Amoxicilin và Cefadroxil có pic tạp lớn. Vì vậy chọn thể tích tiêm 10µl. Ngoài ra, việc lựa chọn chuẩn nội đồng vị Trimethoprim 13C3 giúp đảm bảo hạn chế tối đa ảnh hƣởng của nền mẫu do đây là chất không có trong tự nhiên, do đó không có trong mẫu thực lấy để phân tích. Đây cũng là chuẩn nội lần đầu tiên đƣợc sử dụng để xác định dƣ lƣợng kháng sinh trong mẫu nƣớc thải tại Việt Nam. 3.1.2. Khảo sát và lựa chọn điều kiện xử lý mẫu Qua tham khảo các tài liệu, chúng tôi chọn sử dụng cột chiết pha rắn Oasis HLB (200mg, 6ml). Tiến hành chiết SPE với mẫu tự tạo gồm một thể tích xác định mẫu không chứa kháng sinh phân tích đƣợc thêm 100µl dung dịch chuẩn hỗn hợp các kháng sinh nồng độ 500 ng/ml và 20µl dung dịch chuẩn nội Trimethoprim 13C3 nồng độ 500 ng/ml (mẫu tự tạo chứa 50ng từng kháng sinh nghiên cứu và 10ng IS). Cefotaxim Cefixim Amoxicilin Cefaclor Cefadroxil Cephalexin IS 34 Tiến hành chiết pha rắn theo các bƣớc sau: Bƣớc 1: Hoạt hóa cột: Cho qua cột lần lƣợt 6ml methanol, 6ml hỗn hợp methanol - nƣớc (1 : 1) và 6 ml nƣớc đƣợc acid hóa tới pH 2 bằng dung dịch