Một yêu cầu quan trọng của hệ primers và TaqMan probe là nó phải khuếch đại đúng trình tự
mục tiều cần quan tâm. Ngoài trình tự mục tiêu của loài đang khảo sát, primer và probe không được
bắt cặp lên các trình tự của loài khác. Do đó việc xác định khả năng nhân bản chọn lọc của primer
luôn luôn được đòi hỏi. Việc xác định này phải được thực hiện trên cả lý thuyết và thực nghiệm.
Trên lý thuyết, chúng tôi sử dụng phần mềm Annhyb 4.942 để kiểm tra sự bắt cặp của primer
trên genome của một số loài cùng họ như HSV1, HSV2, EBV và một số loài khác HBV, HCV,
HPV, MTB .
Trên thực nghiệm đối với mỗi tác nhân, chúng tôi tiến hành song song hai phản ứng Real-Time PCR. Một chúng tôi dùng hệ primers và TaqMan probe đã thiết kế chạy với những mẫu bệnh
phẩm nhiễm HSV1, HSV2, EBV, HBV, HCV, HPV,MTB đã được khẳng định dương tính. Một
phản ứng với các cặp primer-TaqMan probe đặc hiệu cho từng tác nhân.
89 trang |
Chia sẻ: maiphuongdc | Lượt xem: 4610 | Lượt tải: 2
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận văn Xây dựng quy trình định lượng CYTOMEGALOVIRUS (CMV) trong máu và nước tiểu bằng phương pháp Real-Time PCR, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
ng đến hiệu quả và độ chuyên biệt của
phản ứng PCR.
Nguyên tắc thiết kế primer:
- Hàm lương GC từ 50-60%.
- Nhiệt độ nóng chảy (Tm) từ 50-65
0C. Giá trị Tm được tính bằng phương pháp lân cận
gần nhất với giá trị của 50mM nồng độ muối và 300nM nồng độ oligonucleotide.
- Tránh cấu trúc thứ cấp.
- Tránh lặp lại base G, C hơn 3 lần.
- Thiết kế base G và C ở đầu và cuối primer. Thành phần 5 nucleotide cuối cùng ở đầu
3’ không nên có hơn 2G hoặc C nhằm tránh hiện tượng nhân bản ký sinh trong phản ứng PCR.
- Kiểm tra trình tự của primer xuôi và ngược để đảm bảo không có sự bắt cặp ở đầu 3’( tránh
tạo ra primer-dimer).
- Kiểm tra sự đặc hiệu bằng những công cụ như Basic Local Alignment Search Tool
(
Thiết kế TaqMan probe:
Nguyên tắc thiết kế TaqMan probe:
- TaqMan probe có nhiệt độ nóng chảy cao hơn primer 5-100C (vì ở giai đọan 600C là nhiệt
độ bắt cặp tối ưu của TaqMan probe, TaqMan probe sẽ bắt cặp vào sợi đích trước, rồi primer mới
bắt cặp) .
- Ngắn hơn 30 nucleotide và không có base lọai G ở đầu 5’ bởi vì nó có thể hấp thụ tín hiệu
hùynh quang ngay cả khi TaqMan probe bị cắt đứt.
- Trình tự TaqMan probe cần có hàm lượng GC từ 30-80% và TaqMan probe phải có nhiều
base C hơn base G.
- Vị trí bắt cặp ở đầu 5’ của TaqMan probe nhưng không kéo dài đầu 3’ của primer, cách vị
trí 3’ của primer bắt cặp trên cùng sợi đích khoảng 2-5 base.
- Quan trọng là lựa chọn chất phát và chất hấp thụ hùynh quang .
Đề tài chọn kiểu phản ứng singleplex, cho nên probe sẽ chọn chất FAM (6-
carboxyfluorescin) làm chất phát huỳnh quang, và TAMRA (6-carboxytetra-methylrhodamine) làm
chất hấp thụ huỳnh quang vì giá thành thấp, có sẵn, hiệu quả tốt và tín hiệu có thể phát ra bởi bất kỳ
thiết bị nào hiện có.
Cách tiến hành thiết kế hệ primers và TaqMan probe
Cách sử dụng phần mềm ClustalX
Sau khi chạy ClustalX các đoạn gene UL123 tải về, so sánh trình tự và xác định vùng bảo tồn
(vùng có các trình tự tương đồng của tất cả các đoạn gene), và dựa vào các cặp primer và TaqMan
probe đã được công bố trên các bài báo uy tín quốc tế [26], [42], [48], [56], [58], [69] để chọn
primer và TaqMan probe, chạy ClustalX các đoạn gene UL123 với từng primer xuôi, primer ngược
và TaqMan probe, đánh giá mức độ tương đồng của các đoạn trên.
Mở chương trình ClustalX đã gióng cột.
Vào file/ append sequenses/ trong hộp append khai báo file primer/open.
Hình 2.4: Minh họa cách gióng cột primer trong ClustalX
Ta được:
Hình 2.5: Primer được nối vào cột ClustalX
Tiếp tục vào menu alignment/ Do complete alignment/ khai báo địa chỉ lưu/OK ta
được kết quả sắp gióng cột primer xuôi, primer ngược, và TaqMan probe (mẫu dò) (hình 3.1, hình
3.2, hình 3.3).
Cách sử dụng phần mềm Blast
Sau bước đánh giá mức độ tương đồng của các đoạn trên, ta phân tích và đánh giá hệ
primers, probe về Tm, %GC, hairpin (kẹp tóc), self–dimer, hetero– dimer, độ tương đồng, kích
thước sản phẩm PCR tạo thành bằng các chương trình BLAST, Annhyb4-922, Oligo Analyzer 3,0
của IDT ( analyzer/oligocal,asp).
Vào
Chọn nucleotide blast
Trong vùng : Choose Search Set, dòng database : chọn nucleotide colletion
Trong vùng : Program Selection, chọn Optimize for Somewhat similar sequences
(blastn).
Coppy cấu trúc primer vào vùng Enter Query Sequence, và click nút blast, kết quả tương
đồng giữa primer và probe giúp ta xác định độ đặc hiệu của primer và probe được thiết kế so với
gen CMV.
Cách sử dụng phần mềm Annhyb 4.942
AnnHyb 4.942 (Annealing and Hybridization) là phần mềm miễn phí dùng để phân tích trình
tự nucleotide với các đặc trưng như chuyển đổi qua lại giữa các định dạng trình tự, dịch mã, phân
tích bảng đồ cắt giới hạn, tìm motif, khung đọc mở.
Mở phần mềm Annhyb 4.942
Vào Menu Oligo, chọn New Oligo
Phần Name: Nhập tên đoạn Oligo vào
Note: Chọn màu đoạn primer, hoặc TaqMan probe
Seq, 5’: Nhập trình tự primer hoặc TaqMan probe vào
Ta vào Menu Oligo, chọn Align Oligo with Sequences. Ta có kết quả Align của primer và
trình tự.
Cách sử dụng Oligo Analyzer 3.0 của IDT
Vào
Vùng : Sequence nhập trình tự mối và probe theo chiều 5’- 3’,
Để kiểm tra cấu trúc thứ cấp nào thì ta chọn vùng đó, sau đó click nút submit
Để kiểm tra đặc tính ta chọn analyze.
Từ đó chọn cặp primers, TaqMan probe tốt nhất để chạy phản ứng Real - Time PCR.
Gởi công ty IDT (Intergrated DNA Technologies) của Mỹ thiết kế.
2.3.2. Phương pháp tách chiết DNA –CMV
Có thể tách chiết DNA-CMV từ nhiều dịch sinh học khác nhau như máu, nước tiểu, hoặc
dịch sinh học khác. Và cũng có nhiều phương pháp khác khau để tách chiết DNA như phương pháp
BOOM, CTAB, hoặc phenol-chloroform. Mỗi phương pháp sẽ có một nguyên tắc riêng, nhưng
nguyên tắc chung là:
1. Phá vỡ tế bào, màng và phân hủy protein để giải phóng DNA.
2. Xử lý bằng nhiệt để phá hủy hoàn toàn protein, giải phóng DNA ra khỏi nhân.
3. Tách DNA ra khỏi đệm tách và bào quản DNA ở 4 đến 200C.
Riêng đề tài này chúng tôi chọn phương pháp tách chiết bằng phenol chloroform [2].
Nguyên tắc: mẫu bệnh phẩm khi trộn với dung dịch phenol /chloroform /Izoamyl
alcohol(P/C/I=25:24:1) thì các protein trong mẫu sẽ bị phenol làm biến tính và vón cục lại. Khi ly
tâm, nhờ có sự hiện diện của chloroform, các vón cục sẽ bị tách ra và tập trung trong lớp phân cách
giữa nước và P/C/I (Chloroform thường đi kèm với phenol có tác dụng bổ sung và làm mất hoàn
toàn dấu vết của phenol, Chloroform cũng làm biến tính protein nhưng yếu hơn phenol).
Pha nước chứa DNA sẽ được lấy ra và làm kết tủa trong izopropanol có bổ sung chất trợ tủa
(chất trợ tủa có tác dụng bắt các phân tử DNA, nhưng không ức chế phản ứng PCR). Khi thực hiện
với sự có mặt của chất trợ tủa, quá trình tủa có thể xảy ra ở nhiệt độ phòng với thời gian ngắn (10
phút). Trong điều kiện không có chất trợ tủa, quá trình tủa phải thực hiện ở - 200C trong ít nhất 1
giờ.
DNA sau khi được tủa sẽ rửa lại 1 lần với ethanol 70% và cuối cùng được bảo quản trong
TE1X (T: Tris có vai trò ổn định pH và E: EDTA bắt các ion Mg2+ làm cho DNase không hoạt
động).
2.3.2.1. Quy trình xử lý nước tiểu và tách chiết DNA trong nước tiểu [17], [18], [19],
[25], [26], [34],[35], [37], [40], [43], [44], [61].
Phương pháp này sử dụng proteinase K để thủy giải toàn bộ proteine có trong mẫu nước tiểu.
Bước 1: Lấy 6 ml nước tiểu cho vào fancol 15ml, ly tâm tốc độ 4000v/p trong 30phút
Bước 2: Đổ bỏ dịch nổi, thu cặn và cho vào 200µl TE1X (0,1M NaCl, 10 mM Tris-HCl,
1mM EDTA- pH=8,0) +0,1% SDS và 40µg proteinase K, ủ ở 370C trong 3 giờ, tốt nhất là ủ qua
đêm. Sau đó có thể đun nóng mẫu ở 1000C trong vài phút để bất hoạt proteinase K còn lại. Mẫu thử
lúc này có thể sẵn sàng để tách chiết DNA.
Bước 3: Lấy 200 µl mẫu tiến hành tách chiết DNA bằng tủa phenol : cloroform:
isoamylalcool (25:24:1) giống quy trình tách chiết DNA trong huyết thanh.
2.3.2.2. Quy trình tách chiết DNA trong máu hoặc huyết thanh, nước tiểu (hình 2.6):
Bước 1: Đánh dấu các tube 1,5ml vô trùng bằng ký hiệu mẫu.
Bước 2: Cho 200l mẫu vào 1 tube vô trùng có sẵn 900l dung dịch 1 (triozol), vortex 30s,
để yên 10 phút, thêm vào 200l dung dịch 2 (chloroform), trộn đều, để yên 10 phút. Ly tâm 13000
vòng /phút trong 10 phút.
Bước 3: Thu 600l dung dịch nổi có chứa DNA (chỉ thu dịch nổi) vào 1 tube vô trùng khác
có sẵn 600l dung dịch 3 (izopropanol) (trộn đều dd3 trước khi sử dụng). Trộn đều dịch trong tube,
để yên trong tủ lạnh 10 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
Bước 4: Loại bỏ dịch nổi, thu cặn màu xanh ( tránh loại bỏ luôn phần cặn), cho từ từ 900l
dung dịch 4 (ethanol) vào, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút.
Bước 5: Thu cặn màu xanh, để khô ở 600C trong 10-15 phút, cho 50l dung dịch 5 (TE 1X)
vào và đặt phản ứng.
Bước 6: Nếu chưa đặt phản ứng phải bảo quản mẫu ở -200C.
Mẫu
QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT DNA/RNA
Vào eppendorf chứa 900
µl dung dịch 1
Ly tâm 13.000
vòng/phút, 10 phút
Hút 200 µl µl mẫu
(Mẫu bệnh lao hút 100 µl)
Vortex
Trộn đều
Thêm vào 200 µl dung
dịch 2
Hút 600 µl dung dịch
nổ i vào eppendorf có
sẵn 600 µl dung dịch 3
Làm lạnh 10 phút
Ly tâm 13.000
vòng/phút, 10 phút
Để yên 10 phút
Đổ dung dịch nổi
Thu cặn màu xanh
Thêm vào 900 µl dung
dịch 4
Ly tâm 13.000
vòng/phút, 5 phút
Đổ dung dịch nổi thu
cặn màu xanh
Thấm vào
giấy cho ráo
Sấy khô ở 60 oC
Cho vào 50 µl dung
dịch TE 1X
Mẫu lao cho vào 100
µl dung dịch TE 1X
Bảo quản
lạnh -20 oC
Mẫu RNA cho vào
50 µl dung dịch
DEPC
Hình 2.6: Quy trình tách chiết DNA trong huyết thanh (xem thêm phụ lục)
2. 3.3. Phương pháp Real-Time PCR
Phản ứng Real-Time PCR sử dụng TaqMan probe được thiết lập với 5 µl DNA-CMV với 20
µl master mix pha từ iTaq DNA Polymerase (Bio-Rad), phản ứng Real-Time PCR sử dụng PCR
Amp/Cycle Graph với FAM-490.
Chương trình luân nhiệt được tiến hành như sau:
1 Chu kỳ 95,0ºC 15 phút
40 Chu kỳ 95,0ºC 15 giây
57,0ºC 1 phút
72,0ºC 20 giây
Việc phân tích kết quả sau phản ứng luân nhiệt được thực hiện với phần mềm iCycler (Bio-
rad) theo đúng hướng dẫn sử dụng.
2.3.4. Phương pháp khảo sát tối ưu hóa điều kiện phản ứng Real-Time PCR [1], [15].
2.3.4.1. Khảo sát nhiệt độ lai:
Nhiệt độ lai là một chỉ tiêu quan trọng ảnh hưởng lớn đến kết quả của phản ứng PCR. Nhiệt
độ lai quá cao hay quá thấp đều ảnh hưởng không tốt đến hiệu quả nhân bản của phản ứng PCR.
Nhiệt độ lai quá thấp so với nhiệt độ biến tính của cặp primer sử dụng dễ tạo nên các sản phẩm ký
sinh không mong muốn trong phản ứng, còn nhiệt độ lai quá cao sẽ cản trở sự bắt cặp của primer
vào DNA bản mẫu, do đó hiệu quả nhân bản sẽ không cao.
Công thức tính nhiệt độ lai:
1. Công thức chính xác với primer dài không quá 20nu:
Tm= [4(G+C)+2(A+T)]
0C. Đây là công thức Wallace chung nhất hay được sử dụng, xác định
gốc phân tử lai oligonucleotide, được thực hiện trong 1M NaCl, ở nồng độ muối thấp.
2. Công thức này dùng cho primer có độ dài 14-70nu:
Tms={81,5+16,6(log10[J
+]+0,41(%G+C)-(600/l)}0C
[J+] là nồng độ phân tử của cation hóa trị đơn và l= độ dài oligonucleotide,
(%G+C) là giá trị thực chứ không phải giá trị phân số (ví dụ: (%G+C)=90% là 90 chứ không
phải 0,90).
3. Công thức này dùng cho primer có độ dài 20-35nu:
Tmp={22+1,46[2(G+C)+(A+T)]
0C
Nhiệt độ primer tính theo lý thuyết là nhiệt độ tham khảo, nhiệt độ bắt cặp thực sự có thể cao
hơn 3-120C so với nhiệt tính toán.
Chúng tôi tiến hành khảo sát nhiệt độ lai của từng cặp primers trên một gradient nhiệt độ,
khảo sát ở các giếng khác nhau trong khoảng 55-650C, và đọc kết quả so sánh.
2.3.4.2. Khảo sát nồng độ MgCl2+ [4], [15]
Trong dung dịch đệm quan trọng nhất là ion Mg
2+
làm tăng nhiệt độ nóng chảy (Tm-melting
temperature) của DNA mạch đôi, tạo ra phức chất tan với dNTPs để hình thành cơ chất mà enzyme
polimerase có thể nhận ra, điều này rất cần thiết cho quá trình liên kết của các dNTP.
Nồng độ Mg
2+
trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng biến đổi từ 0,5-5,5mM (nồng độ này có thể
thay đổi khi cần thiết). Nồng độ Mg
2+
quá thấp sẽ làm giảm khả năng tổng hợp của enzyme
polymerase, hiệu suất thu sản phẩm thấp hoặc không có sản phẩm, còn nếu nồng độ quá cao sẽ tạo
ra những phân đoạn không đặc hiệu (primer sai vị trí).
Nhìn chung, nồng độ MgCl
2
có ảnh hưởng nhiều tới hiệu quả và tính đặc thù của phản ứng.
Ngoài Mg
2+
còn một số chất khác trong dung dịch đệm như AMSO, DMSO, formamide được thêm
vào như các chất phụ gia nhằm tạo ra các sản phẩm PCR có kích thước lớn.
Chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ MgCl2 với một dãy nồng độ từ 2-5 mM.
2.3.4.3. Khảo sát nồng độ primer và TaqMan probe [1]
* Thăm dò nồng độ primer
Lượng primer đưa vào phản ứng PCR phải phù hợp với lượng DNA cần tổng hợp. Nếu nồng
độ primer quá thấp thì primer sẽ hết trước khi số chu kì kết thúc, còn nồng độ primer quá cao thì sẽ
dễ làm tăng sản phẩm không đặc hiệu. Nồng độ primer không được cao quá, vì các phân tử Mg 2+ bị
cặp hết làm giảm hoạt tính enzym, thể tích mẫu không vượt quá 1/10 thể tích. Trên 200M, thì phải
tối ưu lại Mg, tránh sử dụng đệm EDTA vì EDTA bắt kẹp Mg2+.
Nồng độ primer thường 0,2M là đủ cho các primer tương tự, cũng có thể sử dụng đến 3M,
nhưng tỷ lệ giữa primer và khuôn cao có thể cho kết quả khuyếch đại không đặc hiệu và tạo ra cấu
trúc nhị phân primer.
Nồng độ primer trong mỗi phản ứng PCR phải được tính toán tối ưu bằng thực nghiệm. Nồng
độ primer thích hợp để tiến hành phản ứng PCR là từ 0,1-0,5μM.
* Thăm dò nồng độ TaqMan probe để có cường độ huỳnh quang là cao nhất, không phải
hàm lượng TaqMan cao là cho cường độ phát huỳnh quang cao, ngược lại sẽ làm các phân tử
TaqMan probe quá gần nhau nên huỳnh quang phát ra từ đầu reporter của TaqMan probe được thủy
giải sẽ bị các quencher của các TaqMan probe khác hấp phụ. Thông thường từ 2-5pm cho mỗi thể
tích phản ứng.
Vì vậy, chúng tôi chọn phổ nồng độ TaqMan probe từ 100nM-500nM.
2.3.5. Phương pháp khảo sát độ nhạy và khả năng nhân bản chọn lọc của primer và
TaqMan probe.
2.3.5.1. Khảo sát độ nhạy
Bất kỳ phương pháp nào, các đối tượng mục tiêu cũng chỉ có thể được phát hiện ở một nồng
độ giới hạn của chúng trong mẫu. Một phương pháp tốt khi nó có thể phát hiện được đối tượng quan
tâm ở nồng độ càng thấp càng tốt. Do đó, đây là một chỉ tiêu quan trọng dùng để đánh giá mức độ
hiệu quả của phương pháp.
Trong nghiên cứu này, để xác định độ nhạy của primer, chúng tôi tiến hành pha loãng bậc 10
liên tiếp mẫu ban đầu (đã biết trước nồng độ) thành nhiều nồng độ khác nhau. Ở mỗi nồng độ chúng
tôi tiến hành khảo sát với những điều kiện tối ưu đã được khảo sát từ các thí nghiệm trên. Từ đó
chúng tôi sẽ xác định nồng độ thấp nhất mà phương pháp vẫn cho kết quả rõ ràng và chính xác.
2.3.5.2. Khảo sát khả năng nhân bản chọn lọc của primer và TaqMan probe
Một yêu cầu quan trọng của hệ primers và TaqMan probe là nó phải khuếch đại đúng trình tự
mục tiều cần quan tâm. Ngoài trình tự mục tiêu của loài đang khảo sát, primer và probe không được
bắt cặp lên các trình tự của loài khác. Do đó việc xác định khả năng nhân bản chọn lọc của primer
luôn luôn được đòi hỏi. Việc xác định này phải được thực hiện trên cả lý thuyết và thực nghiệm.
Trên lý thuyết, chúng tôi sử dụng phần mềm Annhyb 4.942 để kiểm tra sự bắt cặp của primer
trên genome của một số loài cùng họ như HSV1, HSV2, EBV và một số loài khác HBV, HCV,
HPV, MTB…..
Trên thực nghiệm đối với mỗi tác nhân, chúng tôi tiến hành song song hai phản ứng Real-
Time PCR. Một chúng tôi dùng hệ primers và TaqMan probe đã thiết kế chạy với những mẫu bệnh
phẩm nhiễm HSV1, HSV2, EBV, HBV, HCV, HPV,MTB đã được khẳng định dương tính. Một
phản ứng với các cặp primer-TaqMan probe đặc hiệu cho từng tác nhân.
2.3.6. Phương pháp giải trình tự (sequencing)
Để biết sản phẩm khuyếch đại thu được là đặc hiệu của vùng gen UL123–CMV đã
thiết kế theo gene bank, sản phẩm phải được gửi đi giải trình tự nucleotide, ở công ty Macrogenn
Inc (Hàn quốc).
Nguyên tắc đoạn DNA cần được giải được chạy Real-Time PCR, sau đó mỗi mạch của phân
tử DNA sẽ bắt cặp với một primer, thường là mổi sử dụng trong phản ứng Real-Time PCR, xảy ra
với sự có mặt của dideoxyribonucleotide đã được đánh dấu bằng mỗi màu khác nhau.
2.3.7. Phương pháp xây dựng đường chuẩn (Standard curve)
Đường cong chuẩn được xây dựng với các mẫu chuẩn đã có nồng độ DNA-CMV biết
trước. Sau đó, hàm lượng sản phẩm PCR của mẫu xét nghiệm sẽ được xác định bằng cách so
sánh với hàm lượng sản phẩm PCR từ các mẫu chuẩn được nhân bản cùng lúc thông qua
đường cong chuẩn vừa xây dựng này [2].
CHƯƠNG 3:
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Kết quả xây dựng quy trình
3.1.1. Kết quả thiết kế hệ primers và TaqMan probe trên lý thuyết
Việc lựa chọn vùng trình tự mục tiêu để thiết kế primer để phát hiện CMV cho đến nay vẫn
chưa có kết quả nào xác định vùng trình tự tối ưu trong số các gen như: UL54(được sử dụng trong
kit Cobas Amplicor CMV monitor- Roche Diagnotics), UL55 (gB), UL123 (IE), UL83 (pp65),
US17.
Theo kết quả mới nhất của công trình nghiên cứu Nada Madi & cs – 2007 [56], và một số tác
giả khác [49], [53]), [61] chúng tôi chọn vùng bảo tồn của gen UL 123-CMV.
3.1.1.1. Trình tự sản phẩm khuyếch đại một đoạn của gen UL 123-CMV
Đầu tiên, chúng tôi tiến hành download tất cả các trình tự gen UL 123 của CMV trên
NCBI, gồm có 12 trình tự với mã gen như sau:
1. GI:222354438- mã FJ 616285,1
2. GI:219879708- mã FJ 527563,1
3. GI:39841729- mã GQ 466044
4. GI:52139287- mã NC 006273
5. GI:254771140- mã GQ 396663
6. GI:254770974- mã GQ 396662
7. GI:39841819- mã GQ 221974
8. GI:242345887- mã GQ 221975
9. GI:242345721- mã GQ 221973
10. GI:39842122- mã AY 446894
11. GI:239909470- mã GQ 121041
12. GI:27808742-mã BK 000394
Sau khi tải xong 12 trình tự gen trên, sử dụng chương trình ClustalX để tìm vùng bảo tồn
cao nhất, và kiểm tra bằng phần mềm Annhyb, trình tự DNA đích được chọn là một đoạn trình tự
dài 98bp thuộc vùng UL123 (dài khoảng 1760bp) của bộ gen CMV.
Kết quả trình tự sản phẩm khuyếch đại
Vị trí 974- gen UL123–CMV
3’ATCCACATCTCCCGCTTATCCTCAGGTACAATGTAGTTCTCATACATGCTCTGCATAGT
TAGCCCAATACACTTCATCTCCTCGAAAGGCTCATGAAC5’- vị trí 1071-gen UL123–CMV
3.1.1.2. Trình tự nucleotide của hệ primers và TaqMan probe
Dựa trên phần mềm ClustalX và sự tương đồng giữa các gen UL 123 của bộ gen CMV
đã tải về, chúng tôi đã thiết kế trình tự cặp primers và TaqMan probe (bảng 3.1)
Bảng 3.1: Trình tự nucleotide của primers và TaqMan probe
Tên Trình tự nucleotit
Vị trí trên
gen UL123
Primer xuôi 5’-ATCCACATCTCCCGCTTATCC-3’ 974-993
Primer ngược ® 5’-TCCTCGAAAGGCTCATGAAC-3’ 1052- 1071
TaqMan probe
5’TCTCATACATGCTCTGCATAGTTAGCC
CAA3’
1011- 1040
Kết quả chạy ClustalX hệ primers –TaqMan probe vừa thiết kế
Với primer xuôi:
Hình 3.1: Kết quả của việc tìm độ tương đồng của primer xuôi
Nhận xét: Tỷ lệ tương đồng giữa primer xuôi và các đoạn gen UL123-CMV là 100% .
Với primer ngược:
Hình 3.2: Kết quả của việc tìm độ tương đồng của primer ngược
Nhận xét: Tỷ lệ tương đồng giữa primer ngược và các đoạn gen UL123-CMV cũng là 100%
.
Với TaqMan probe:
Hình 3.3: Kết quả của việc tìm độ tương đồng của TaqMan probe
Nhận xét: Tỉ lệ tương đồng của probe với 12 đoạn gene UL123 là 100%.
Kết quả chạy Annhyb cho hệ primers – TaqMan probe
Đối với Gen GI:219879708: trình tự primer xuôi, TaqMan probe, và primer ngược được thể
hiện hình 3.4:
Hình 3.4: Kết quả của việc đánh giá primer, TaqMan probe bằng Annhyb
Kết quả khảo sát trên Blast: (kết quả blast sẽ được trình bày ở phần phụ lục).
Kết quả khảo sát trên Blast (ó giá trị E-value là một
thông số thể hiện mức độ tin cậy về sự tương đồng giữa hai trình tự. Giá trị này càng nhỏ hoặc bằng
0 thì sự tương đồng giữa các trình tự càng có ý nghĩa.
Qua kết quả chúng tôi thấy trong tất cả các trường hợp đều có giá trị E-value rất thấp trong
khoảng từ 3x10-7 - 0,048. Với giá trị E-value này thì sự tương đồng giữa các trình tự rất có ý nghĩa.
Bên cạnh giá trị E-value thì phần trăm tương đồng giữa sản phẩm PCR mà chúng tôi thu được
với các trình tự thuộc UL123-CMV là 100%. Kết quả trên cho phép chúng tôi có thể nhận định đoạn
trình tự mà chúng tôi nhân bản được là đặc hiệu của Humanherpesvirus 5, gen mã hóa protein
immediate-early, exon4, chúng tôi thấy rằng trình tự primer hầu hết đều tương đồng với CMV và
không xuất hiện trình tự nào khác. Điều này chứng tỏ hệ primers-TaqMan probe do chúng tôi thiết
kế có độ chuyên biệt cao về mặt lý thuyết.
Nhận xét: Tỷ lệ tương đồng giữa hệ primers–TaqMan probe với gen UL123-CMV –
exon 4 là 100%.
3.1.1.3. Kết quả khảo sát đặc tính của primer và TaqMan probe
Để kiểm tra đặc tính của primer và TaqMan probe về nhiệt độ lai, kích thước primer, các cấu
trúc thứ cấp, chúng tôi sử dụng phần mềm Annhyb và phần mềm trực tuyến oligo Analyzer 3.0 của
IDT.
Kết quả đại diện trên oligo Analyzer 3.0 của IDT
(
Hình 3.5 : Kết quả trên IDT đoạn primer xuôi
Kết quả đại diện trên Annhyb
Hình 3.6: Kết quả Annhyb khảo sát đặc tính primer xuôi .
Trên kết quả khảo sát của các phần mềm, chúng tôi tóm tắt các đặc tính của hệ primers và
TaqMan probe (bảng 3.2).
Bảng 3.2: Các đặc tính của primers và TaqMan probe
Yếu tố kiểm tra
Kết quả kiểm tra
Primer xuôi Primer ngược TaqMan Probe
Kích thước 21 bp 20 bp 30 bp
% GC 52,4% 50 % 43,3 %
Nhiệt độ nóng chảy 55,6
0C 54 0C 61 0C
(Tm)
Cấu trúc kẹp tóc
hairpin loop
(kcal/mole)
ΔG= 2,48 ΔG= -0,78 ΔG= -1,44
Cấu trúc Self-dimer
(kcal/mole)
ΔG= -3,61 ΔG= -8,53 ΔG= -7,05
Cấu trúc hetero-
dimer(kcal/mole)
Primer ngược
ΔG= -4,74
Với primer xuôi :
ΔG= -4,74
Với primer xuôi :
ΔG= -4,74
Với probe :
ΔG=-4,74
Với probe :
ΔG= -6,6
Với primer ngược
ΔG= -6,6
Dựa trên kết quả khảo sát đặc tính primers, TaqMan Probe (bảng 3.2), chúng tôi nhận thấy:
Về mặt kích thước, cả 2 primers và TaqMan probe trên đạt yêu cầu về chiều dài tốt nhất
của primer (20 – 30bp).
Về thành phần %GC, các primers-TaqMan probe trên có %GC nằm trong tỉ lệ tốt nhất
(40% - 60%).
Nhiệt độ lai của primer và TaqMan probe thỏa mãn điều kiện thiết kế (TaqMan probe
có nhiệt độ nóng chảy cao hơn primer 5-100C, ở giai đọan 600C là nhiệt độ bắt cặp tối ưu của
TaqMan probe, TaqMan probe sẽ bắt cặp vào sợi đích trước, rồi primer mới bắt cặp).
Cấu trúc thứ cấp thể hiện ở phần phụ lục: bao gồm hairpin loop (cấu trúc kẹp tóc), self
dimer (oligonucleotide tự bắt cặp với chính nó), hetero dimer (sự bắt cặp giữa hai oligonucleotide
khác nhau). Trong phản ứng PCR, nếu cấu trúc bậc hai này càng bền vững bao nhiêu thì hiệu quả
nhân bản càng giảm đi bấy nhiêu.
Độ bền vững của các cấu trúc thứ cấp được đo bằng chỉ số năng lượng tự do (∆G, kcal/mole),
chỉ số này phải lớn hơn -9kcal (theo hãng IDT) vì ∆G càng lớn bao nhiêu thì cấu trúc càng kém bền
bấy nhiêu, do đó sẽ không ảnh hưởng đến hoạt động của PCR.
Kết quả khảo sát trên phần mềm trực tuyến IDT oligo analyzer cho thấy, tất cả cấu trúc thứ
cấp của hệ primers – mẫu dò đều có ∆G > -9kcal, nằm trong khoảng cho phép chấp nhận được.
Kết luận, về mặt lý thuyết hệ primers và TaqMan probe của chúng tôi có thể chấp
nhận.
3.1.2. Kết quả hệ primers và TaqMan probe bằng thực nghiệm
3.1.2.1. Kiểm tra khả năng hoạt động của hệ primers–TaqMan probe bằng Real -
Time PCR
Chúng tôi chạy thử nghiệm hệ primers - TaqMan probe trên mẫu bệnh phẩm đã được khẳng
định dương tính bằng Real-Time PCR từ kit CMV của Roche (Light Cycler® CMV Quant kit-04-
845-854-001 ở trung tâm Y khoa Medic (thông tin mẫu ở phần phụ lục có mã số 5089) với kit của
chúng tôi thiết kế. Mẫu được tách chiết DNA-CMV trong huyết thanh.
Quá trình này nhằm mục đích kiểm tra khả năng bắt cặp, khuếch đại và phát tín hiệu huỳnh
quang của hệ primers – probe trên gene UL123 của CMV. Để kiểm tra hiện tượng ngoại nhiễm có
thể xảy ra trong quá trình thí nghiệm, chúng tôi bố trí thêm một mẫu chứng âm với những thành
phần phản ứng không đổi nhưng thay nguồn DNA bằng nước cất vô trùng.
Kết quả chạy thực nghiệm: (hình 3.7)
Hình 3.7: Đường cong biểu diễn sự hoạt động của hệ primers – TaqMan probe bằng thực
nghiệm.
Kết quả chạy Real-Time PCR cho thấy, hệ primers và TaqMan probe hoạt động tốt, mẫu
dương tính ở chu kỳ ngưỡng 33,9, tương đương 3x103 copies virus/ml mẫu thử, phù hợp kết quả xét
nghiệm của trung tâm y khoa Medic . Đường cong PCR lên đều và đẹp, không có hiện tượng nhiễu
tín hiệu huỳnh quang.
Chứng âm cho kết quả âm tính chứng tỏ mọi hoạt động trong quy trình thử nghiệm đều tốt,
không có hiện tượng ngoại nhiễm.
Như vậy, hệ primers-TaqMan probe CMV được thiết kế hoạt động hiệu quả trong
phản ứng Real-Time PCR.
UL123_-CMV- mẫu 5089
Chứng âm
3.1.2.2. Kết quả khảo sát khả năng nhân bản chọn lọc của hệ primers và probe được
thiết kế
Trên lý thuyết, bằng phần mềm Annhyb 4,942 và trình tự genome của các tác nhân HSV1,
HSV2, VZV, EBV, HBV, HCV, HPV, vi khẩn lao từ Genbank, chúng tôi tiến hành khảo sát khả
năng bắt cặp của hệ primers – TaqMan probe, kết quả khảo sát (bảng 3.3).
Bảng 3.3: Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của hệ primers – TaqMan probe thiết kế với một số
loài virus khác
Tên chủng
HSV1 HSV2 VZV EBV HBV HCV HPV MTB
Phần
trăm
(%)
bắt
cặp
Primer
xuôi 61,9 58,1 54,3 54,3 53,3 48,1 49,5 59,5
Primer
ngược
50,5 56 61 52 42 51,5 45 61,5
Probe
39 39,7 47,7 41 31,7 38,7 37,7 44,3
Qua kết quả bảng 3.3, chúng tôi thấy phần trăm bắt cặp giữa hệ primers-TaqMan probe của
CMV trên genome của các loài HSV-1, HSV-2, VZV, EBV, HBV, HCV, HPV, vi khẩn lao đều
không cao, đối với primer xuôi dao động trong khoảng 48,1% đến 61,9%, với primer ngược trong
khoảng 42%-61,5%, còn với probe nằm trong khoảng 39%-44,3% khẳng định hệ primers-TaqMan
probe được thiết kế là đặc hiệu cho CMV.
Trên thực nghi
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- LVSHVSV019.pdf