Luận văn Xây dựng quy trình định lượng CYTOMEGALOVIRUS (CMV) trong máu và nước tiểu bằng phương pháp Real-Time PCR

ng đến hiệu quả và độ chuyên biệt của phản ứng PCR. Nguyên tắc thiết kế primer: - Hàm lương GC từ 50-60%. - Nhiệt độ nóng chảy (Tm) từ 50-65 0C. Giá trị Tm được tính bằng phương pháp lân cận gần nhất với giá trị của 50mM nồng độ muối và 300nM nồng độ oligonucleotide. - Tránh cấu trúc thứ cấp. - Tránh lặp lại base G, C hơn 3 lần. - Thiết kế base G và C ở đầu và cuối primer. Thành phần 5 nucleotide cuối cùng ở đầu 3’ không nên có hơn 2G hoặc C nhằm tránh hiện tượng nhân bản ký sinh trong phản ứng PCR. - Kiểm tra trình tự của primer xuôi và ngược để đảm bảo không có sự bắt cặp ở đầu 3’( tránh tạo ra primer-dimer). - Kiểm tra sự đặc hiệu bằng những công cụ như Basic Local Alignment Search Tool (  Thiết kế TaqMan probe: Nguyên tắc thiết kế TaqMan probe: - TaqMan probe có nhiệt độ nóng chảy cao hơn primer 5-100C (vì ở giai đọan 600C là nhiệt độ bắt cặp tối ưu của TaqMan probe, TaqMan probe sẽ bắt cặp vào sợi đích trước, rồi primer mới bắt cặp) . - Ngắn hơn 30 nucleotide và không có base lọai G ở đầu 5’ bởi vì nó có thể hấp thụ tín hiệu hùynh quang ngay cả khi TaqMan probe bị cắt đứt. - Trình tự TaqMan probe cần có hàm lượng GC từ 30-80% và TaqMan probe phải có nhiều base C hơn base G. - Vị trí bắt cặp ở đầu 5’ của TaqMan probe nhưng không kéo dài đầu 3’ của primer, cách vị trí 3’ của primer bắt cặp trên cùng sợi đích khoảng 2-5 base. - Quan trọng là lựa chọn chất phát và chất hấp thụ hùynh quang . Đề tài chọn kiểu phản ứng singleplex, cho nên probe sẽ chọn chất FAM (6- carboxyfluorescin) làm chất phát huỳnh quang, và TAMRA (6-carboxytetra-methylrhodamine) làm chất hấp thụ huỳnh quang vì giá thành thấp, có sẵn, hiệu quả tốt và tín hiệu có thể phát ra bởi bất kỳ thiết bị nào hiện có.  Cách tiến hành thiết kế hệ primers và TaqMan probe  Cách sử dụng phần mềm ClustalX Sau khi chạy ClustalX các đoạn gene UL123 tải về, so sánh trình tự và xác định vùng bảo tồn (vùng có các trình tự tương đồng của tất cả các đoạn gene), và dựa vào các cặp primer và TaqMan probe đã được công bố trên các bài báo uy tín quốc tế [26], [42], [48], [56], [58], [69] để chọn primer và TaqMan probe, chạy ClustalX các đoạn gene UL123 với từng primer xuôi, primer ngược và TaqMan probe, đánh giá mức độ tương đồng của các đoạn trên.  Mở chương trình ClustalX đã gióng cột.  Vào file/ append sequenses/ trong hộp append khai báo file primer/open. Hình 2.4: Minh họa cách gióng cột primer trong ClustalX  Ta được: Hình 2.5: Primer được nối vào cột ClustalX  Tiếp tục vào menu alignment/ Do complete alignment/ khai báo địa chỉ lưu/OK ta được kết quả sắp gióng cột primer xuôi, primer ngược, và TaqMan probe (mẫu dò) (hình 3.1, hình 3.2, hình 3.3).  Cách sử dụng phần mềm Blast Sau bước đánh giá mức độ tương đồng của các đoạn trên, ta phân tích và đánh giá hệ primers, probe về Tm, %GC, hairpin (kẹp tóc), self–dimer, hetero– dimer, độ tương đồng, kích thước sản phẩm PCR tạo thành bằng các chương trình BLAST, Annhyb4-922, Oligo Analyzer 3,0 của IDT ( analyzer/oligocal,asp). Vào  Chọn nucleotide blast  Trong vùng : Choose Search Set, dòng database : chọn nucleotide colletion  Trong vùng : Program Selection, chọn Optimize for Somewhat similar sequences (blastn).  Coppy cấu trúc primer vào vùng Enter Query Sequence, và click nút blast, kết quả tương đồng giữa primer và probe giúp ta xác định độ đặc hiệu của primer và probe được thiết kế so với gen CMV.  Cách sử dụng phần mềm Annhyb 4.942 AnnHyb 4.942 (Annealing and Hybridization) là phần mềm miễn phí dùng để phân tích trình tự nucleotide với các đặc trưng như chuyển đổi qua lại giữa các định dạng trình tự, dịch mã, phân tích bảng đồ cắt giới hạn, tìm motif, khung đọc mở. Mở phần mềm Annhyb 4.942  Vào Menu Oligo, chọn New Oligo  Phần Name: Nhập tên đoạn Oligo vào  Note: Chọn màu đoạn primer, hoặc TaqMan probe  Seq, 5’: Nhập trình tự primer hoặc TaqMan probe vào  Ta vào Menu Oligo, chọn Align Oligo with Sequences. Ta có kết quả Align của primer và trình tự.  Cách sử dụng Oligo Analyzer 3.0 của IDT  Vào  Vùng : Sequence nhập trình tự mối và probe theo chiều 5’- 3’,  Để kiểm tra cấu trúc thứ cấp nào thì ta chọn vùng đó, sau đó click nút submit  Để kiểm tra đặc tính ta chọn analyze. Từ đó chọn cặp primers, TaqMan probe tốt nhất để chạy phản ứng Real - Time PCR. Gởi công ty IDT (Intergrated DNA Technologies) của Mỹ thiết kế. 2.3.2. Phương pháp tách chiết DNA –CMV Có thể tách chiết DNA-CMV từ nhiều dịch sinh học khác nhau như máu, nước tiểu, hoặc dịch sinh học khác. Và cũng có nhiều phương pháp khác khau để tách chiết DNA như phương pháp BOOM, CTAB, hoặc phenol-chloroform. Mỗi phương pháp sẽ có một nguyên tắc riêng, nhưng nguyên tắc chung là: 1. Phá vỡ tế bào, màng và phân hủy protein để giải phóng DNA. 2. Xử lý bằng nhiệt để phá hủy hoàn toàn protein, giải phóng DNA ra khỏi nhân. 3. Tách DNA ra khỏi đệm tách và bào quản DNA ở 4 đến 200C. Riêng đề tài này chúng tôi chọn phương pháp tách chiết bằng phenol chloroform [2]. Nguyên tắc: mẫu bệnh phẩm khi trộn với dung dịch phenol /chloroform /Izoamyl alcohol(P/C/I=25:24:1) thì các protein trong mẫu sẽ bị phenol làm biến tính và vón cục lại. Khi ly tâm, nhờ có sự hiện diện của chloroform, các vón cục sẽ bị tách ra và tập trung trong lớp phân cách giữa nước và P/C/I (Chloroform thường đi kèm với phenol có tác dụng bổ sung và làm mất hoàn toàn dấu vết của phenol, Chloroform cũng làm biến tính protein nhưng yếu hơn phenol). Pha nước chứa DNA sẽ được lấy ra và làm kết tủa trong izopropanol có bổ sung chất trợ tủa (chất trợ tủa có tác dụng bắt các phân tử DNA, nhưng không ức chế phản ứng PCR). Khi thực hiện với sự có mặt của chất trợ tủa, quá trình tủa có thể xảy ra ở nhiệt độ phòng với thời gian ngắn (10 phút). Trong điều kiện không có chất trợ tủa, quá trình tủa phải thực hiện ở - 200C trong ít nhất 1 giờ. DNA sau khi được tủa sẽ rửa lại 1 lần với ethanol 70% và cuối cùng được bảo quản trong TE1X (T: Tris có vai trò ổn định pH và E: EDTA bắt các ion Mg2+ làm cho DNase không hoạt động). 2.3.2.1. Quy trình xử lý nước tiểu và tách chiết DNA trong nước tiểu [17], [18], [19], [25], [26], [34],[35], [37], [40], [43], [44], [61]. Phương pháp này sử dụng proteinase K để thủy giải toàn bộ proteine có trong mẫu nước tiểu. Bước 1: Lấy 6 ml nước tiểu cho vào fancol 15ml, ly tâm tốc độ 4000v/p trong 30phút Bước 2: Đổ bỏ dịch nổi, thu cặn và cho vào 200µl TE1X (0,1M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA- pH=8,0) +0,1% SDS và 40µg proteinase K, ủ ở 370C trong 3 giờ, tốt nhất là ủ qua đêm. Sau đó có thể đun nóng mẫu ở 1000C trong vài phút để bất hoạt proteinase K còn lại. Mẫu thử lúc này có thể sẵn sàng để tách chiết DNA. Bước 3: Lấy 200 µl mẫu tiến hành tách chiết DNA bằng tủa phenol : cloroform: isoamylalcool (25:24:1) giống quy trình tách chiết DNA trong huyết thanh. 2.3.2.2. Quy trình tách chiết DNA trong máu hoặc huyết thanh, nước tiểu (hình 2.6): Bước 1: Đánh dấu các tube 1,5ml vô trùng bằng ký hiệu mẫu. Bước 2: Cho 200l mẫu vào 1 tube vô trùng có sẵn 900l dung dịch 1 (triozol), vortex 30s, để yên 10 phút, thêm vào 200l dung dịch 2 (chloroform), trộn đều, để yên 10 phút. Ly tâm 13000 vòng /phút trong 10 phút. Bước 3: Thu 600l dung dịch nổi có chứa DNA (chỉ thu dịch nổi) vào 1 tube vô trùng khác có sẵn 600l dung dịch 3 (izopropanol) (trộn đều dd3 trước khi sử dụng). Trộn đều dịch trong tube, để yên trong tủ lạnh 10 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút. Bước 4: Loại bỏ dịch nổi, thu cặn màu xanh ( tránh loại bỏ luôn phần cặn), cho từ từ 900l dung dịch 4 (ethanol) vào, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút. Bước 5: Thu cặn màu xanh, để khô ở 600C trong 10-15 phút, cho 50l dung dịch 5 (TE 1X) vào và đặt phản ứng. Bước 6: Nếu chưa đặt phản ứng phải bảo quản mẫu ở -200C. Mẫu QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT DNA/RNA Vào eppendorf chứa 900 µl dung dịch 1 Ly tâm 13.000 vòng/phút, 10 phút Hút 200 µl µl mẫu (Mẫu bệnh lao hút 100 µl) Vortex Trộn đều Thêm vào 200 µl dung dịch 2 Hút 600 µl dung dịch nổ i vào eppendorf có sẵn 600 µl dung dịch 3 Làm lạnh 10 phút Ly tâm 13.000 vòng/phút, 10 phút Để yên 10 phút Đổ dung dịch nổi Thu cặn màu xanh Thêm vào 900 µl dung dịch 4 Ly tâm 13.000 vòng/phút, 5 phút Đổ dung dịch nổi thu cặn màu xanh Thấm vào giấy cho ráo Sấy khô ở 60 oC Cho vào 50 µl dung dịch TE 1X Mẫu lao cho vào 100 µl dung dịch TE 1X Bảo quản lạnh -20 oC Mẫu RNA cho vào 50 µl dung dịch DEPC Hình 2.6: Quy trình tách chiết DNA trong huyết thanh (xem thêm phụ lục) 2. 3.3. Phương pháp Real-Time PCR Phản ứng Real-Time PCR sử dụng TaqMan probe được thiết lập với 5 µl DNA-CMV với 20 µl master mix pha từ iTaq DNA Polymerase (Bio-Rad), phản ứng Real-Time PCR sử dụng PCR Amp/Cycle Graph với FAM-490. Chương trình luân nhiệt được tiến hành như sau: 1 Chu kỳ 95,0ºC 15 phút 40 Chu kỳ 95,0ºC 15 giây 57,0ºC 1 phút 72,0ºC 20 giây Việc phân tích kết quả sau phản ứng luân nhiệt được thực hiện với phần mềm iCycler (Bio- rad) theo đúng hướng dẫn sử dụng. 2.3.4. Phương pháp khảo sát tối ưu hóa điều kiện phản ứng Real-Time PCR [1], [15]. 2.3.4.1. Khảo sát nhiệt độ lai: Nhiệt độ lai là một chỉ tiêu quan trọng ảnh hưởng lớn đến kết quả của phản ứng PCR. Nhiệt độ lai quá cao hay quá thấp đều ảnh hưởng không tốt đến hiệu quả nhân bản của phản ứng PCR. Nhiệt độ lai quá thấp so với nhiệt độ biến tính của cặp primer sử dụng dễ tạo nên các sản phẩm ký sinh không mong muốn trong phản ứng, còn nhiệt độ lai quá cao sẽ cản trở sự bắt cặp của primer vào DNA bản mẫu, do đó hiệu quả nhân bản sẽ không cao. Công thức tính nhiệt độ lai: 1. Công thức chính xác với primer dài không quá 20nu: Tm= [4(G+C)+2(A+T)] 0C. Đây là công thức Wallace chung nhất hay được sử dụng, xác định gốc phân tử lai oligonucleotide, được thực hiện trong 1M NaCl, ở nồng độ muối thấp. 2. Công thức này dùng cho primer có độ dài 14-70nu: Tms={81,5+16,6(log10[J +]+0,41(%G+C)-(600/l)}0C [J+] là nồng độ phân tử của cation hóa trị đơn và l= độ dài oligonucleotide, (%G+C) là giá trị thực chứ không phải giá trị phân số (ví dụ: (%G+C)=90% là 90 chứ không phải 0,90). 3. Công thức này dùng cho primer có độ dài 20-35nu: Tmp={22+1,46[2(G+C)+(A+T)] 0C Nhiệt độ primer tính theo lý thuyết là nhiệt độ tham khảo, nhiệt độ bắt cặp thực sự có thể cao hơn 3-120C so với nhiệt tính toán. Chúng tôi tiến hành khảo sát nhiệt độ lai của từng cặp primers trên một gradient nhiệt độ, khảo sát ở các giếng khác nhau trong khoảng 55-650C, và đọc kết quả so sánh. 2.3.4.2. Khảo sát nồng độ MgCl2+ [4], [15] Trong dung dịch đệm quan trọng nhất là ion Mg 2+ làm tăng nhiệt độ nóng chảy (Tm-melting temperature) của DNA mạch đôi, tạo ra phức chất tan với dNTPs để hình thành cơ chất mà enzyme polimerase có thể nhận ra, điều này rất cần thiết cho quá trình liên kết của các dNTP. Nồng độ Mg 2+ trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng biến đổi từ 0,5-5,5mM (nồng độ này có thể thay đổi khi cần thiết). Nồng độ Mg 2+ quá thấp sẽ làm giảm khả năng tổng hợp của enzyme polymerase, hiệu suất thu sản phẩm thấp hoặc không có sản phẩm, còn nếu nồng độ quá cao sẽ tạo ra những phân đoạn không đặc hiệu (primer sai vị trí). Nhìn chung, nồng độ MgCl 2 có ảnh hưởng nhiều tới hiệu quả và tính đặc thù của phản ứng. Ngoài Mg 2+ còn một số chất khác trong dung dịch đệm như AMSO, DMSO, formamide được thêm vào như các chất phụ gia nhằm tạo ra các sản phẩm PCR có kích thước lớn. Chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ MgCl2 với một dãy nồng độ từ 2-5 mM. 2.3.4.3. Khảo sát nồng độ primer và TaqMan probe [1] * Thăm dò nồng độ primer Lượng primer đưa vào phản ứng PCR phải phù hợp với lượng DNA cần tổng hợp. Nếu nồng độ primer quá thấp thì primer sẽ hết trước khi số chu kì kết thúc, còn nồng độ primer quá cao thì sẽ dễ làm tăng sản phẩm không đặc hiệu. Nồng độ primer không được cao quá, vì các phân tử Mg 2+ bị cặp hết làm giảm hoạt tính enzym, thể tích mẫu không vượt quá 1/10 thể tích. Trên 200M, thì phải tối ưu lại Mg, tránh sử dụng đệm EDTA vì EDTA bắt kẹp Mg2+. Nồng độ primer thường 0,2M là đủ cho các primer tương tự, cũng có thể sử dụng đến 3M, nhưng tỷ lệ giữa primer và khuôn cao có thể cho kết quả khuyếch đại không đặc hiệu và tạo ra cấu trúc nhị phân primer. Nồng độ primer trong mỗi phản ứng PCR phải được tính toán tối ưu bằng thực nghiệm. Nồng độ primer thích hợp để tiến hành phản ứng PCR là từ 0,1-0,5μM. * Thăm dò nồng độ TaqMan probe để có cường độ huỳnh quang là cao nhất, không phải hàm lượng TaqMan cao là cho cường độ phát huỳnh quang cao, ngược lại sẽ làm các phân tử TaqMan probe quá gần nhau nên huỳnh quang phát ra từ đầu reporter của TaqMan probe được thủy giải sẽ bị các quencher của các TaqMan probe khác hấp phụ. Thông thường từ 2-5pm cho mỗi thể tích phản ứng. Vì vậy, chúng tôi chọn phổ nồng độ TaqMan probe từ 100nM-500nM. 2.3.5. Phương pháp khảo sát độ nhạy và khả năng nhân bản chọn lọc của primer và TaqMan probe. 2.3.5.1. Khảo sát độ nhạy Bất kỳ phương pháp nào, các đối tượng mục tiêu cũng chỉ có thể được phát hiện ở một nồng độ giới hạn của chúng trong mẫu. Một phương pháp tốt khi nó có thể phát hiện được đối tượng quan tâm ở nồng độ càng thấp càng tốt. Do đó, đây là một chỉ tiêu quan trọng dùng để đánh giá mức độ hiệu quả của phương pháp. Trong nghiên cứu này, để xác định độ nhạy của primer, chúng tôi tiến hành pha loãng bậc 10 liên tiếp mẫu ban đầu (đã biết trước nồng độ) thành nhiều nồng độ khác nhau. Ở mỗi nồng độ chúng tôi tiến hành khảo sát với những điều kiện tối ưu đã được khảo sát từ các thí nghiệm trên. Từ đó chúng tôi sẽ xác định nồng độ thấp nhất mà phương pháp vẫn cho kết quả rõ ràng và chính xác. 2.3.5.2. Khảo sát khả năng nhân bản chọn lọc của primer và TaqMan probe Một yêu cầu quan trọng của hệ primers và TaqMan probe là nó phải khuếch đại đúng trình tự mục tiều cần quan tâm. Ngoài trình tự mục tiêu của loài đang khảo sát, primer và probe không được bắt cặp lên các trình tự của loài khác. Do đó việc xác định khả năng nhân bản chọn lọc của primer luôn luôn được đòi hỏi. Việc xác định này phải được thực hiện trên cả lý thuyết và thực nghiệm. Trên lý thuyết, chúng tôi sử dụng phần mềm Annhyb 4.942 để kiểm tra sự bắt cặp của primer trên genome của một số loài cùng họ như HSV1, HSV2, EBV và một số loài khác HBV, HCV, HPV, MTB….. Trên thực nghiệm đối với mỗi tác nhân, chúng tôi tiến hành song song hai phản ứng Real- Time PCR. Một chúng tôi dùng hệ primers và TaqMan probe đã thiết kế chạy với những mẫu bệnh phẩm nhiễm HSV1, HSV2, EBV, HBV, HCV, HPV,MTB đã được khẳng định dương tính. Một phản ứng với các cặp primer-TaqMan probe đặc hiệu cho từng tác nhân. 2.3.6. Phương pháp giải trình tự (sequencing) Để biết sản phẩm khuyếch đại thu được là đặc hiệu của vùng gen UL123–CMV đã thiết kế theo gene bank, sản phẩm phải được gửi đi giải trình tự nucleotide, ở công ty Macrogenn Inc (Hàn quốc). Nguyên tắc đoạn DNA cần được giải được chạy Real-Time PCR, sau đó mỗi mạch của phân tử DNA sẽ bắt cặp với một primer, thường là mổi sử dụng trong phản ứng Real-Time PCR, xảy ra với sự có mặt của dideoxyribonucleotide đã được đánh dấu bằng mỗi màu khác nhau. 2.3.7. Phương pháp xây dựng đường chuẩn (Standard curve) Đường cong chuẩn được xây dựng với các mẫu chuẩn đã có nồng độ DNA-CMV biết trước. Sau đó, hàm lượng sản phẩm PCR của mẫu xét nghiệm sẽ được xác định bằng cách so sánh với hàm lượng sản phẩm PCR từ các mẫu chuẩn được nhân bản cùng lúc thông qua đường cong chuẩn vừa xây dựng này [2]. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Kết quả xây dựng quy trình 3.1.1. Kết quả thiết kế hệ primers và TaqMan probe trên lý thuyết Việc lựa chọn vùng trình tự mục tiêu để thiết kế primer để phát hiện CMV cho đến nay vẫn chưa có kết quả nào xác định vùng trình tự tối ưu trong số các gen như: UL54(được sử dụng trong kit Cobas Amplicor CMV monitor- Roche Diagnotics), UL55 (gB), UL123 (IE), UL83 (pp65), US17. Theo kết quả mới nhất của công trình nghiên cứu Nada Madi & cs – 2007 [56], và một số tác giả khác [49], [53]), [61] chúng tôi chọn vùng bảo tồn của gen UL 123-CMV. 3.1.1.1. Trình tự sản phẩm khuyếch đại một đoạn của gen UL 123-CMV  Đầu tiên, chúng tôi tiến hành download tất cả các trình tự gen UL 123 của CMV trên NCBI, gồm có 12 trình tự với mã gen như sau: 1. GI:222354438- mã FJ 616285,1 2. GI:219879708- mã FJ 527563,1 3. GI:39841729- mã GQ 466044 4. GI:52139287- mã NC 006273 5. GI:254771140- mã GQ 396663 6. GI:254770974- mã GQ 396662 7. GI:39841819- mã GQ 221974 8. GI:242345887- mã GQ 221975 9. GI:242345721- mã GQ 221973 10. GI:39842122- mã AY 446894 11. GI:239909470- mã GQ 121041 12. GI:27808742-mã BK 000394  Sau khi tải xong 12 trình tự gen trên, sử dụng chương trình ClustalX để tìm vùng bảo tồn cao nhất, và kiểm tra bằng phần mềm Annhyb, trình tự DNA đích được chọn là một đoạn trình tự dài 98bp thuộc vùng UL123 (dài khoảng 1760bp) của bộ gen CMV.  Kết quả trình tự sản phẩm khuyếch đại Vị trí 974- gen UL123–CMV 3’ATCCACATCTCCCGCTTATCCTCAGGTACAATGTAGTTCTCATACATGCTCTGCATAGT TAGCCCAATACACTTCATCTCCTCGAAAGGCTCATGAAC5’- vị trí 1071-gen UL123–CMV 3.1.1.2. Trình tự nucleotide của hệ primers và TaqMan probe  Dựa trên phần mềm ClustalX và sự tương đồng giữa các gen UL 123 của bộ gen CMV đã tải về, chúng tôi đã thiết kế trình tự cặp primers và TaqMan probe (bảng 3.1) Bảng 3.1: Trình tự nucleotide của primers và TaqMan probe Tên Trình tự nucleotit Vị trí trên gen UL123 Primer xuôi 5’-ATCCACATCTCCCGCTTATCC-3’ 974-993 Primer ngược ® 5’-TCCTCGAAAGGCTCATGAAC-3’ 1052- 1071 TaqMan probe 5’TCTCATACATGCTCTGCATAGTTAGCC CAA3’ 1011- 1040  Kết quả chạy ClustalX hệ primers –TaqMan probe vừa thiết kế  Với primer xuôi: Hình 3.1: Kết quả của việc tìm độ tương đồng của primer xuôi Nhận xét: Tỷ lệ tương đồng giữa primer xuôi và các đoạn gen UL123-CMV là 100% .  Với primer ngược: Hình 3.2: Kết quả của việc tìm độ tương đồng của primer ngược Nhận xét: Tỷ lệ tương đồng giữa primer ngược và các đoạn gen UL123-CMV cũng là 100% .  Với TaqMan probe: Hình 3.3: Kết quả của việc tìm độ tương đồng của TaqMan probe Nhận xét: Tỉ lệ tương đồng của probe với 12 đoạn gene UL123 là 100%.  Kết quả chạy Annhyb cho hệ primers – TaqMan probe Đối với Gen GI:219879708: trình tự primer xuôi, TaqMan probe, và primer ngược được thể hiện hình 3.4: Hình 3.4: Kết quả của việc đánh giá primer, TaqMan probe bằng Annhyb  Kết quả khảo sát trên Blast: (kết quả blast sẽ được trình bày ở phần phụ lục). Kết quả khảo sát trên Blast (ó giá trị E-value là một thông số thể hiện mức độ tin cậy về sự tương đồng giữa hai trình tự. Giá trị này càng nhỏ hoặc bằng 0 thì sự tương đồng giữa các trình tự càng có ý nghĩa. Qua kết quả chúng tôi thấy trong tất cả các trường hợp đều có giá trị E-value rất thấp trong khoảng từ 3x10-7 - 0,048. Với giá trị E-value này thì sự tương đồng giữa các trình tự rất có ý nghĩa. Bên cạnh giá trị E-value thì phần trăm tương đồng giữa sản phẩm PCR mà chúng tôi thu được với các trình tự thuộc UL123-CMV là 100%. Kết quả trên cho phép chúng tôi có thể nhận định đoạn trình tự mà chúng tôi nhân bản được là đặc hiệu của Humanherpesvirus 5, gen mã hóa protein immediate-early, exon4, chúng tôi thấy rằng trình tự primer hầu hết đều tương đồng với CMV và không xuất hiện trình tự nào khác. Điều này chứng tỏ hệ primers-TaqMan probe do chúng tôi thiết kế có độ chuyên biệt cao về mặt lý thuyết. Nhận xét: Tỷ lệ tương đồng giữa hệ primers–TaqMan probe với gen UL123-CMV – exon 4 là 100%. 3.1.1.3. Kết quả khảo sát đặc tính của primer và TaqMan probe Để kiểm tra đặc tính của primer và TaqMan probe về nhiệt độ lai, kích thước primer, các cấu trúc thứ cấp, chúng tôi sử dụng phần mềm Annhyb và phần mềm trực tuyến oligo Analyzer 3.0 của IDT.  Kết quả đại diện trên oligo Analyzer 3.0 của IDT ( Hình 3.5 : Kết quả trên IDT đoạn primer xuôi  Kết quả đại diện trên Annhyb Hình 3.6: Kết quả Annhyb khảo sát đặc tính primer xuôi . Trên kết quả khảo sát của các phần mềm, chúng tôi tóm tắt các đặc tính của hệ primers và TaqMan probe (bảng 3.2). Bảng 3.2: Các đặc tính của primers và TaqMan probe Yếu tố kiểm tra Kết quả kiểm tra Primer xuôi Primer ngược TaqMan Probe Kích thước 21 bp 20 bp 30 bp % GC 52,4% 50 % 43,3 % Nhiệt độ nóng chảy 55,6 0C 54 0C 61 0C (Tm) Cấu trúc kẹp tóc hairpin loop (kcal/mole) ΔG= 2,48 ΔG= -0,78 ΔG= -1,44 Cấu trúc Self-dimer (kcal/mole) ΔG= -3,61 ΔG= -8,53 ΔG= -7,05 Cấu trúc hetero- dimer(kcal/mole) Primer ngược ΔG= -4,74 Với primer xuôi : ΔG= -4,74 Với primer xuôi : ΔG= -4,74 Với probe : ΔG=-4,74 Với probe : ΔG= -6,6 Với primer ngược ΔG= -6,6 Dựa trên kết quả khảo sát đặc tính primers, TaqMan Probe (bảng 3.2), chúng tôi nhận thấy:  Về mặt kích thước, cả 2 primers và TaqMan probe trên đạt yêu cầu về chiều dài tốt nhất của primer (20 – 30bp).  Về thành phần %GC, các primers-TaqMan probe trên có %GC nằm trong tỉ lệ tốt nhất (40% - 60%).  Nhiệt độ lai của primer và TaqMan probe thỏa mãn điều kiện thiết kế (TaqMan probe có nhiệt độ nóng chảy cao hơn primer 5-100C, ở giai đọan 600C là nhiệt độ bắt cặp tối ưu của TaqMan probe, TaqMan probe sẽ bắt cặp vào sợi đích trước, rồi primer mới bắt cặp).  Cấu trúc thứ cấp thể hiện ở phần phụ lục: bao gồm hairpin loop (cấu trúc kẹp tóc), self dimer (oligonucleotide tự bắt cặp với chính nó), hetero dimer (sự bắt cặp giữa hai oligonucleotide khác nhau). Trong phản ứng PCR, nếu cấu trúc bậc hai này càng bền vững bao nhiêu thì hiệu quả nhân bản càng giảm đi bấy nhiêu. Độ bền vững của các cấu trúc thứ cấp được đo bằng chỉ số năng lượng tự do (∆G, kcal/mole), chỉ số này phải lớn hơn -9kcal (theo hãng IDT) vì ∆G càng lớn bao nhiêu thì cấu trúc càng kém bền bấy nhiêu, do đó sẽ không ảnh hưởng đến hoạt động của PCR. Kết quả khảo sát trên phần mềm trực tuyến IDT oligo analyzer cho thấy, tất cả cấu trúc thứ cấp của hệ primers – mẫu dò đều có ∆G > -9kcal, nằm trong khoảng cho phép chấp nhận được. Kết luận, về mặt lý thuyết hệ primers và TaqMan probe của chúng tôi có thể chấp nhận. 3.1.2. Kết quả hệ primers và TaqMan probe bằng thực nghiệm 3.1.2.1. Kiểm tra khả năng hoạt động của hệ primers–TaqMan probe bằng Real - Time PCR Chúng tôi chạy thử nghiệm hệ primers - TaqMan probe trên mẫu bệnh phẩm đã được khẳng định dương tính bằng Real-Time PCR từ kit CMV của Roche (Light Cycler® CMV Quant kit-04- 845-854-001 ở trung tâm Y khoa Medic (thông tin mẫu ở phần phụ lục có mã số 5089) với kit của chúng tôi thiết kế. Mẫu được tách chiết DNA-CMV trong huyết thanh. Quá trình này nhằm mục đích kiểm tra khả năng bắt cặp, khuếch đại và phát tín hiệu huỳnh quang của hệ primers – probe trên gene UL123 của CMV. Để kiểm tra hiện tượng ngoại nhiễm có thể xảy ra trong quá trình thí nghiệm, chúng tôi bố trí thêm một mẫu chứng âm với những thành phần phản ứng không đổi nhưng thay nguồn DNA bằng nước cất vô trùng. Kết quả chạy thực nghiệm: (hình 3.7) Hình 3.7: Đường cong biểu diễn sự hoạt động của hệ primers – TaqMan probe bằng thực nghiệm. Kết quả chạy Real-Time PCR cho thấy, hệ primers và TaqMan probe hoạt động tốt, mẫu dương tính ở chu kỳ ngưỡng 33,9, tương đương 3x103 copies virus/ml mẫu thử, phù hợp kết quả xét nghiệm của trung tâm y khoa Medic . Đường cong PCR lên đều và đẹp, không có hiện tượng nhiễu tín hiệu huỳnh quang. Chứng âm cho kết quả âm tính chứng tỏ mọi hoạt động trong quy trình thử nghiệm đều tốt, không có hiện tượng ngoại nhiễm. Như vậy, hệ primers-TaqMan probe CMV được thiết kế hoạt động hiệu quả trong phản ứng Real-Time PCR. UL123_-CMV- mẫu 5089 Chứng âm 3.1.2.2. Kết quả khảo sát khả năng nhân bản chọn lọc của hệ primers và probe được thiết kế  Trên lý thuyết, bằng phần mềm Annhyb 4,942 và trình tự genome của các tác nhân HSV1, HSV2, VZV, EBV, HBV, HCV, HPV, vi khẩn lao từ Genbank, chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng bắt cặp của hệ primers – TaqMan probe, kết quả khảo sát (bảng 3.3). Bảng 3.3: Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của hệ primers – TaqMan probe thiết kế với một số loài virus khác Tên chủng HSV1 HSV2 VZV EBV HBV HCV HPV MTB Phần trăm (%) bắt cặp Primer xuôi 61,9 58,1 54,3 54,3 53,3 48,1 49,5 59,5 Primer ngược 50,5 56 61 52 42 51,5 45 61,5 Probe 39 39,7 47,7 41 31,7 38,7 37,7 44,3 Qua kết quả bảng 3.3, chúng tôi thấy phần trăm bắt cặp giữa hệ primers-TaqMan probe của CMV trên genome của các loài HSV-1, HSV-2, VZV, EBV, HBV, HCV, HPV, vi khẩn lao đều không cao, đối với primer xuôi dao động trong khoảng 48,1% đến 61,9%, với primer ngược trong khoảng 42%-61,5%, còn với probe nằm trong khoảng 39%-44,3% khẳng định hệ primers-TaqMan probe được thiết kế là đặc hiệu cho CMV.  Trên thực nghi