Luận văn Xây dựng quy trình thực nghiệm phân tích độc tố Ciguatoxins trong Chình biển bằng phương pháp sắc ký lỏng đầu dò khối phổ kép (LC/MS - MS)

11,6 Cá ăn thịt [12], [13] P-CTX-2 CTX-2A2; 52- epi-54-deoxyCTX 1095,5 Cá ăn thịt [12], [13], [14] P-CTX-3 CTX-2B2; 54- deoxyCTX 1095,5 Cá ăn thịt [12], [13] 49-epi- CTX-3C CTX-3B 1023,6 Gambierdicus toxicus [15] M-seco- CTX-3C 1041,6 G. toxicus [15] CTX-3C 1023,6 G. toxicus [15], [16] 2,3- dihydroxy CTX-3C CTX-2A1 1057,6 Cá ăn thịt/G. toxicus [17], [16] 51- hydroxyC TX-3C CTX-2C1 1039.5 Cá ăn thịt [17] CTX-4B GT-4B 1061.6 G. toxicus /cá ăn thực vật [8], [16], [18] 18 52-epi- ciguatoxin -4B CTX-4A; GT-4A 1061.6 G. toxicus [16], [18] Caribbean ciguatoxins C-CTX-1 1141,6 Cá ăn thịt [19], [20], [21] C-CTX-2 56-epi-C-CTX-1 1141,6 Cá ăn thịt [19], [20], [21] C-CTX- 1127 1127,6 Cá ăn thịt [20], [21] C-CTX- 1143 1143,6 Cá ăn thịt [20], [21] C-CTX- 1157 1157,6 Cá ăn thịt [20], [21] C-CTX- 1159 1159,6 Cá ăn thịt [20], [21] Indian ciguatoxins I-CTX-1 1141,6 Cá ăn thịt [22], [23] I-CTX-2 1141,6 Cá ăn thịt [22], [23] I-CTX-3 1157,6 Cá ăn thịt [22], [23] I-CTX-4 1157,6 Cá ăn thịt [22], [23] Khối phổ được sử dụng để phân tích CTXs cả khi cần xác định đặc tính và cấu trúc của các đồng phân khác nhau, chủ yếu sử dụng kỹ thuật FAB và ion hoá. Lewis và cs.,1994 [24] đã đề cập đến kỹ thuật dùng nguồn sương ion (IS) cho điều tra phổ của độc tố này. Rất nhiều nguồn ion được ứng dụng, chủ yếu mục đích để xác định khối lượng phân tử và giả phân tử của các ion độc tố P-CTX-1 với các m/z khác nhau như 1111,8 đối với [M + H]+; 1133,8 đối 19 với [M + Na]+; 1129,8 đối với [M+H+ H2O]+ và khi đã bị cắt đi lần lượt 05 phân tử nước (m/z 1094; 1076, 1058; 1040 và 1022). Phân tích khối phổ thu nhận được bằng kỹ thuật IS cung cấp thông tin phổ và các mảnh phổ tương tự như trong kỹ thuật FAB, và có thể phát hiện được CTX-1 tinh sạch (tương đương với độ nhạy của HPLC-FLD). Tuy nhiên, rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến các ion này khi thử nghiệm phân tích các dịch chiết thô từ cá được thêm P-CTX-1 ở nồng độ 1,5 ng/g mẫu ban đầu. Tuy nhiên, đây vẫn được coi là một cách đơn giản, nhạy để kiểm chứng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép nối khối phổ. Khi sử dụng phương pháp này để phân tích dịch chiết độc tố có độ tinh sạch cao từ ruột Chình biển Lycodontis javanicus gây ngộ độc CFP đã cho phép xác định 14 đồng phân gồm 02 ở m/z 1095,7; 06 ở 1111,6 hoặc 06 ở 1127,7 với ưu thế của P-CTX-1, -2 và -3. Ngoài các ion chính, mỗi đồng phân này lại cho các mảnh ion [M+NH4]+ và [M+Na]+. Ở đây, cũng ghi nhận là hệ dung môi MeCN:H2O bổ sung 1 nM ammonium acetate cho kết quả tốt hơn so với bổ sung 0,1% TFA, và sử dụng bơm hỗ trợ hệ HPLC-MS sẽ giúp tín hiệu ghi nhận tăng gấp 20 lần so với HPLC-MS truyền thống [13]. Thành công chứng minh được đặc tính phân mảnh này vô cùng hữu hiệu để xác định các đồng phân mới của độc tố CTXs. Trong một công bố khác, HPLC-MS được ứng dụng để xác định đặc tính của 12 đồng phân C-CTXs trong dịch chiết tinh sạch của loài cá Vẩu Caranx latus [25]. Trong trường hợp này, bơm cao áp HP 3300 được kết nối với đầu dò tứ cực API Qstar Pulsar (PE-Sciex). Ion tương ứng với [M+NH4]+, [M+H]+ và [M+H-H2O] + và [M+H-2H2O] + được ghi nhận với cường độ nhất khi formic acid được bổ sung vào dung dịch đệm. Ngược lại, khi dùng TFA, hầu như thiếu vắng có mặt của phân tử ion [M+NH4]+. Ngoài ra, formic acid luôn cải thiện đường nền và khối phổ thu nhận được cao gấp 5 lần so với TFA. Kỹ thuật phân tách pha đảo trở nên hiệu quả hơn trên cột sắc ký Zorbax C3 (2,1 × 150 mm, Agilent) so với cột Aquapore C18 RP 300 (1 × 50 mm), đặc biệt là có thể phân tách được các đồng phân gần nhau. Với chế độ sắc ký thay đổi nồng độ pha động (gradient) là hệ dung môi MeCN:H2O khi có và không có mặt formic acid 0,1%; đã xác định được 05 đồng phân CTXs mới ở 20 m/z của [M+H]+ lần lượt là 1159,6; 1143,6; 1157,6; 1127,6; và một loạt dẫn xuất và C-CTX-1 mà trước đây chưa bao giờ được ghi nhận. I-CTXs đầu tiên được xác định bởi Hamilton và cs. [26] trong cá Hồng đốm bạc Lutjanus bohar và Lutjanus sebae và kiểm chứng bằng HPLC-MS tương tự như phương pháp phân tích C-CTXs [25] có một số thay đổi ở điều kiện sắc ký. Quá trình phân tách được thay đổi sang chế độ đẳng dòng trên cột sắc ký Zorbax 300SB (2,1×150 mm; 3,5 μm, Agilent) với hệ pha động MeCN:H2O:isopropanol (80:19:1 về thể tích) có 5 μM ammonium acetate hoặc 0,1% formic acid. Kết quả, ion phân tử của I-CTX thu được hoàn toàn tương đồng với ion phân tử của C-CTX ở m/z 1141,6; mặc dù thành phần/tỉ lệ của các phân tử và ion phân tử có khác biệt với ưu thế của giả ion phân tử [M+H-H2O] + trong các dẫn xuất I-CTXs. Sau đó, đã phát hiện thêm 03 đồng phân khác là I-CTX-2, -3 và -4. I-CTX-1 và -2 có khối phổ hoàn toàn giống C-CTX-1 trong loài cá Hồng L. bohar. Tiếp theo, Lewis và cs. công bố kết quả ghép nối giữa HPLC với khối phổ kép tandem mass spectrometry (MS/MS) [27]. Khi phân tích CTX tinh sạch với pha động 50% MeCN có 0,1% TFA, sản phẩm ion của MRM được tối ưu cho mất đi gốc -NH3 từ phân tử ion [M+NH4]+, sau đó tiếp tục mất đi 03 phân tử H2O và đã thu nhận các mảnh khối phổ với m/z lần lượt 1128,7 > 1094,0/1076,0/1058,0 (P-CTX-1); và 1158,6 > 1123,6/1105,6 (C-CTX-1). Phương pháp này cho đường chuẩn trong khoảng làm việc và cải thiện độ nhạy rất nhiều LOD 0,04 và 0,1 ng/g đối với P-CTX-1 và C-CTX-1. Quá trình sắc ký được thực hiện trên cột pha đảo Vydac (2,1 × 250 mm, 5 μm; Separation Group) với dịch giải cột là MeCN:H2O có bổ sung 0,05% TFA. Hệ sắc ký lỏng 1100 Agilent kết nối với 4000 QTRAP hybrid mass spectrometer (Applied Biosystems) được thử nghiệm để kiểm chứng P-CTX- 1 và C-CTX-1 trên cơ sở khối phổ và thời gian lưu đối chiếu với độc tố chuẩn và đã phát hiện được độc tố một cách đặc hiệu [2]. Đối với C-CTX-1, 03 quá trình chuyển tiếp MRM được chọn lọc với giả phân tử ion [M+H-H2O]+ đóng vai trò ion tiền thân (m/z: 1123,5 > 1105,6/1087,6/1069,6). Đối với P-CTX-1, 02 nhóm chuyển tiếp được giám sát với sự có mặt của tín hiệu phản hồi. 21 Trước tiên, coi phân tử ion [M+H]+ là chất tiền thân (m/z: 1111,6 > 1093,6/1075,6/1057,6), sau đó dựa vào mảnh ion [M+NH4]+ (m/z: 1128,6 > 1093,6/1075,6/1057,6). Chế độ sắc ký được thực hiện trên cột pha đảo Luna C8 (2) (2,0 × 150 mm, 5 μm; Phenomenex) và chương trình sắc ký thay đổi nồng độ của pha động MeCN:H2O có 0,1% formic acid. Gần đây, phương pháp HPLC/MS-MS cải tiến được công bố bởi Lewis và cs. [28] với phương pháp tách chiết nhanh từ 2 g mẫu thịt cá ban đầu với giới hạn định lượng là 0,1 ng/g – hoàn toàn có thể ứng dụng phân tích các mẫu cá gây ngộ độc CFP từ biển Thái bình dương. Ở quy trình này, chế độ sắc ký được thực hiện trên cột Luna C18 (2.1 × 250 mm, 5 μm; Phenomenex) với chương trình thay đổi nồng độ pha động 95% MeCN:H2O có 2 mM ammonium formate và 0,1% formic acid. Hệ khối phổ kép 3 tứ cực (triple quadrupole) API 4000 QTRAP (Applied Biosystems) với cặp chuyển đổi MRM đối với P-CTX-1 trên cơ sở sự phân mảnh của giả ion phân tử [M+NH4] + sau khi lần lượt mất đi nhóm chức -NH3 và các phân tử H2O (m/z: 1128,7 > 1093,7/1075,7/1057,7). Ngay sau đó, Stewart và cs. đã công bố phương pháp cải tiến nhằm tách chiết nhanh và phân tích HPLC/MS-MS các độc tố P-CTX-1, -2 và -3 trong mẫu cá nghi ngờ gây ngộ độc CFP [29]. Chế độ sắc ký được thực hiện trên thiết bị Prominence LC (Shimadzu Corp.) gắn cột Gemini C6-phenyl (2,0 × 50 mm; Phenomenex) và AB/Sciex API4000Q (AB/MSD Sciex). Hệ dung môi pha động Acetonitrile:H2O thay đổi dòng với cải tiến bằng cách có mặt của 2 mM ammonium acetate và 0,1% formic acid. Chế độ sang lọc nhiều ion (MRM) tương tự như Lewis và cs [28], với khoảng phổ để xác định CTX-2 và -3 (m/z: 1128,7 > 1093,7/1075,7/1057,7 (P-CTX1); 1112,7 > 1077,6/1059,6/1041,6 (P-CTX-2 và -3). 22 Hình 1.5. Khối phổ và thời gian lưu của 16 dẫn xuất CTXs [30] Nhìn chung, HPLC-MS và HPLC/MS-MS đã được chứng minh hiệu quả trong định danh và xác định đặc tính các đồng phân độc tố CTXs trên toàn thế giới. Hơn nữa, sự cải tiến các thiết bị phân tích đã nâng cao độ nhạy và độ chọn lọc do đo lường được chính xác phổ hoặc chuỗi các mảnh ion con theo đặc tính từng mảnh. Tuy nhiên, xét về tiêu chí an toàn thực phẩm (0,01 ng/g và 0,1 ng/g đối với P-CTXs và C-CTXs), HPLC-MS vẫn bị hạn chế khi cần kết quả định lượng chính xác từ những mẫu có kết quả rất gần với giới hạn này. Cải tiến thiết bị phân tích và quy trình chuẩn bị mẫu trước khi phân tích sẽ khắc phục được khó khăn do một số tạp chất trong mẫu cá làm giảm LOD và LOQ. Kỹ thuật ion hóa Trong khi các nghiên cứu nhằm tìm hiểu tính chất đặc điểm phổ khối của các độc tố nhóm CTXs có thể sử dụng các kỹ thuật ion hóa khác nhau với các loại nguồn ion khác nhau, các nghiên cứu nhằm định tính, định lượng những độc tố này trong cá sử dụng phổ biến nhất là ESI. Với đặc điểm là kỹ 23 thuật ion hóa “mềm”, phổ ESI-MS thường cho các pic có cường độ lớn tương ứng với những ion sơ cấp giữ nguyên cấu trúc nguyên bản của đối tượng phân tích (chẳng hạn như ion [M-H]– ở chế độ ion âm hay ion [M+Na]+ ở chế độ ion dương), tạo điều kiện thuận lợi cho việc bắn phá tiếp để tạo ra các ion thứ cấp đặc trưng khi phân tích MS/MS ở chế độ MRM nhằm nâng cao độ đặc hiệu của phương pháp. Vì vậy, với kỹ thuật ESI-MS/MS được dùng rất phổ biến để phân tích các độc tố nhóm CTXs ở cả chế độ ion âm và ion dương [1]. Các điều kiện cụ thể của bộ nguồn ESI được công bố dao động tùy thuộc vào thiết bị LC/MS-MS cụ thể được sử dụng để xây dựng phương pháp. Lựa chọn phân tích khối Các phương pháp sử dụng đầu dò khối phổ, nhất là khối phổ hai lần, đã và đang được sử dụng ngày càng phổ biến để phân tích đồng thời cả định tính và định lượng độc tố nhóm CTXs. Theo yêu cầu về độ tin cậy, một phương pháp phân tích bằng khối phổ hai lần (MS/MS) được chấp nhận là đủ đặc hiệu khi đối tượng nghiên cứu được định danh ít nhất bằng 4 điểm định danh (identification point - IP) trong đó 1 ion sơ cấp được tính 1 IP, một ion thứ cấp được tính 1,5 IP, và tỷ lệ cường độ các peak thu được từ các ion thứ cấp của mẫu thử phải nằm trong khoảng dao động cho phép so với tỷ lệ này của chuẩn phân tích trong cùng điều kiện và thời điểm. Như vậy, để đáp ứng các yêu cầu về độ tin cậy kể trên, các phương pháp phân tích độc tố nhóm CTXs bằng LC/MS-MS đều sử dụng tối thiểu 1 ion sơ cấp, tối thiểu 2 ion thứ cấp của các độc tố này khi phân tích, trong đó cường độ 1 ion thứ cấp được dùng làm đáp ứng để tính toán kết quả định lượng, ion sơ cấp và ion thứ cấp còn lại cung cấp thông tin định tính và đảm bảo độ đặc hiệu. Chế độ ion dương với nguồn ion hoá phun điện tử (ESI+) được áp dụng để định tính và định lượng CTXs, trong đó các ion thứ cấp m/z từ [M+NH4]+ sau khi lần lượt mất đi nhóm chức -NH3 và các phân tử H2O (m/z: 1128,7 > 1093,7/1075,7/1057,7) được dùng để định tính độc tố này. Như vậy, cho tới nay, chế độ ion dương là chế độ được áp dụng phổ biến để định danh riêng từng độc tố bằng cách so sánh với chất chuẩn, kết hợp thời gian lưu với các thông tin phân tích MS/MS. Tuy nhiên, với đặc trưng là 24 một kỹ thuật phân tích phổ phức tạp, có nhiều thông số phải tối ưu hóa, với mỗi thiết bị LC-MS cụ thể sẽ cần phải thực hiện lại việc khảo sát tối ưu hóa các điều kiện phù hợp với đặc điểm kỹ thuật nội tại của thiết bị để có được kết quả phân tích tốt nhất. Điều kiện sắc ký Trong các nghiên cứu phân tích độc tố CTXs bằng LC/MS-MS, pha tĩnh sử dụng chủ yếu là cột pha đảo C18. Chủ yếu sử dụng pha động với 2 thành phần dung môi chính là MeCN và H2O ở 2 vùng pH: pha động có pH acid và pha động có pH kiềm. + Thành phần của pha động có pH kiềm thường là hỗn hợp MeCN - H2O có chứa amoniac. Tỷ lệ amoniac trong pha động được duy trì cố định ở một mức nhất định: 0,05 % (tt/tt) [31], 6,7 mM [32], [33]. Ngoài ra, pha động ở pH kiềm còn sử dụng amoni bicarbonat được chỉnh pH về khoảng 11 bằng amoniac [34]. + Thành phần pha động ở vùng pH acid là hỗn hợp ACN - H2O có chứa acid formic và amoni format [31] hoặc chỉ chứa acid formic [33], [35]. Các pha động có thành phần dung môi MeCN - H2O được sử dụng ở cả chế độ rửa giải gradient và rửa giải đẳng dòng. LOQ (µg/kg) 4,65 3,55 5,12 Nhận xét: - Dung môi phổ biến dùng để chiết độc tố CTXs là Acetone. - Chương trình sắc ký để tách độc tố nhóm CTXs là sắc ký pha đảo với pha tĩnh hay sử dụng là C18. - Kỹ thuật khối phổ 2 lần cho LOD thấp với độ nhạy của phương pháp rất cao (đơn vị ppb) [1]. Đây là một ưu điểm nổi trội của phương pháp LC/MS-MS so với các phương pháp trước đây trong xác định độc tố CTXs có mặt trong mẫu cá. 25 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Đối tượng: Tổng số 14 cá thể cá Chình thu mua tại một số vùng biển miền Trung Việt Nam bao gồm Lý Sơn (Quảng Ngãi), Trường Sa (Khánh Hoà). Mẫu được vận chuyển về phòng thí nghiệm tại Viện Hải dương học trong điều kiện bảo quản bằng đá lạnh với thời gian sớm nhất. Tại phòng thí nghiệm, mẫu được rửa sạch, định danh khoa học, sau đó cá tách thành 02 phần (cơ, gan), bảo quản trong các túi plastic riêng ở điều kiện -20°C cho đến khi sử dụng thí nghiệm.. Thiết bị bảo quản mẫu: Tủ lạnh sâu MDF-549-PB (Panasonic, Nhật) Bảng 2.1. Định danh và ký hiệu mẫu Tên loài Kí hiệu mẫu Tên loài Kí hiệu mẫu Cơ Gan Cơ Gan Cá Lịch vân vòng C026 G026 Cá Lịch vân vòng C033 G033 Cá Lịch vân vòng C027 G027 Cá Lịch vân sóng C034 G034 Cá Lịch vân vòng C028 G028 Cá Lịch vân sóng C035 G035 Cá Lịch vân vòng C029 G029 Cá Lịch chấm tia C036 G036 Cá Lịch vân vòng C030 G030 Cá Lịch chấm tia C037 G037 Cá Lịch vân vòng C031 G031 Cá Lịch mõm trắng C038 G038 Cá Lịch vân vòng C032 G032 Cá Lịch mõm trắng C039 G039 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 2.2.1. Nguyên liệu, thiết bị 2.2.1.1. Dung môi, hóa chất Các loại hóa chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích dành cho LC/MS-MS. - Methanol (Wako, code: 131-01826, độ tinh khiết: 99,8%) - Acetone (Wako, code: 016-00346, độ tinh khiết: 99,5%) - Diethyl ether (Wako, code: 055-01155, độ tinh khiết: 99,5%) 26 - Hexan (Wako, code: 085-00416, độ tinh khiết: 96%) - Acetone nitril (Wako, code: 014-00386, độ tinh khiết: 99,5%) - Ethyl acetate (Wako, code: 051-00356, độ tinh khiết: 99,5% - Amonium formate (Wako, code: 014-03125) - Formic acid (Wako, code: 063-04192, độ tinh khiết: 99 %) - Nước trao đổi ion (Hệ thống máy khử ion nước cất Ultral Clear GP UV UF TM, hãng sản xuất: Evoqua – Đức) 2.2.1.2. Thiết bị, dụng cụ phân tích Thiết bị: - Máy sắc ký lỏng khối phổ kiểu tứ cực chập ba với nguồn ion hóa phun điện (ESI) gồm máy sắc ký lỏng siêu hiệu năng LC20AD-XR (Shimadzu, Nhật), bộ ổn nhiệt cột CTO-20A và bộ tiêm mẫu tự động SIL 20AC-XR kết nối thiết bị hệ phổ khối ba tứ cực MS/MS 8040 (Shimadzu, Nhật), hệ thống sử dụng khí nitơ từ bộ sinh khí AB-3G của Shimadzu. - Máy ly tâm lạnh Mikko (Hermle, Đức, code: 58080029) - Cân phân tích Sartorius CP224S (Sartorius, Thụy Sĩ) với d = 10-4 g. - Thiết bị đồng nhất mẫu Ika T10 (Ika, Đức) - Máy lắc xoáy, Ika Vortex 2 (Ika, Đức) Ngoài ra, còn các thiết bị phụ trợ khác bao gồm nồi cách thủy, máy lọc nước trao đổi ion, hệ thống cô quay chân không, tủ âm sâu bảo quản mẫu thuộc phòng thí nghiệm trọng điểm cấp Viện Hàn lâm KHCNVN về “ATTP và môi trường (khu vực Miền Trung)” tại Viện Hải dương học. Dụng cụ phân tích: - Cột sắc ký pha đảo hiệu năng cao Agilent Poroshell 120 EC-C18 (100 × 2,1 mm, 1,9 mm kích cỡ hạt nhồi) (Agilent, Đức) - Cột sắc ký pha đảo Wakosil 3C18 HG (Wako, Nhật Bản) 27 - Cột chiết ly pha rắn Florisil (InertSep FL-PR 500 mg, GL Science Inc.) - Cột chiết ly pha rắn Florisil (InertSep FL-PR 200 mg, GL Science Inc.) - Cột chiết ly pha rắn PSA (InertSep PSA, 200 mg, GL Sciences Inc.) - Dụng cụ chính xác: Bộ micropipette (Eppendorf, Đức) thể tích 2-20, 10-100, 10-200, 100-1000 µL; pipet thủy tinh chính xác từ 1-10 mL. - Ống ly tâm Teflon có nắp xoắn (15 và 50 mL), ống eppendorf (2 mL). - Lọ đựng mẫu loại 1,8 mL, màu nâu dùng cho hệ tiêm mẫu LC tự động - Các dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm như ống đong, cốc thủy tinh, phễu, giấy lọc 2.2.2. Chiết tách và tinh sạch độc tố CTX từ cơ và gan của Chình biển Trong quy trình tách chiết độc tố CTXs từ mẫu cá, ba yếu tố quan trọng chi phối độ chính xác của kết quả phân tích LC/MS-MS bao gồm dung môi tách chiết; làm sạch dịch chiết ban đầu và loại các tạp chất nhóm lipid. a) Dung môi tách chiết Do bản chất thân dầu của các độc tố CTXs ở dạng ester hóa, dung môi sử dụng để chiết các độc tố này ra khỏi thịt cá cần có độ phân cực phù hợp để đảm bảo hiệu suất chiết, đồng thời cũng phải hạn chế được việc chiết theo cùng các thành phần khác trong cá để đơn giản hóa giai đoạn làm sạch mẫu cũng như hạn chế sai số, nhất là dương tính giả và âm tính giả trong giai đoạn phân tích. Trong giai đoạn đầu sau khi CTXs được phát hiện và định danh, acetone (AcOH) được dùng để chiết độc tố từ cá để định lượng bằng thử nghiệm sinh học trên chuột [30]. MeOH và hỗn hợp MeOH - nước với các tỉ lệ nhất định cũng được sử dụng trong nhiều nghiên cứu khác để chiết độc tố CTXs từ cá trước khi phân tích bằng kỹ thuật sắc ký lỏng với các đầu dò MS hay MS/MS [30], [1]. 28 b) Phương pháp làm sạch dịch chiết ban đầu (clean-up) Tùy thuộc vào dung môi chiết sử dụng trong giai đoạn đầu và loại kỹ thuật phân tích sẽ sử dụng, dịch chiết thô từ mẫu cá có thể được xử lý làm sạch theo nhiều quy trình khác nhau, nhưng về cơ bản là sử dụng 2 kỹ thuật chiết lỏng - lỏng và chiết ly pha rắn (solid phase extraction – SPE).  Chiết lỏng – lỏng Đây là một kỹ thuật tách đơn giản nhất và trung thực nhất được sử dụng để làm sạch hoặc để tách một cấu tử riêng hoặc một loại các cấu tử khỏi mẫu mẹ. Mẫu rắn hoặc lỏng được chiết bằng dung môi hữu cơ thích hợp. Đối với các mẫu nước, dung môi chiết phải không tan trong nước. Độ phân cực của dung môi nằm trong một khoảng rộng từ các ankal như pentan, hexan, hoặc xiclohexan đến nitrobenzene và n-butanol, cũng như các dung môi có chứa clo (đặc biệt là dicloruametan, cloroform) thường có lợi thế tách chiết. Có hai quá trình chiết lỏng – lỏng là chiết không liên tục (chiết phân đoạn) và chiết liên tục.  Chiết ly pha rắn (Solid Phase Extraction – SPE) Tuy nhiên, độc tố dạng thô thu được bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng chứa nhiều tạp chất có khối lượng phân tử tương đương với chất cần phát hiện. Thường hay bắt gặp hiện tượng các đỉnh MS không tách biệt, dính chồng nhau dẫn đến không thể xác định chính xác MW của mảnh ion. Do đó, bên cạnh chiết lỏng – lỏng, dịch chiết sơ bộ ban đầu từ thịt cá được tiếp tục làm giàu mẫu và làm sạch bằng phương pháp chiết ly pha rắn (SPE) trước khi phân tích bằng LC/MS-MS. Chiết ly pha rắn (hay chiết rắn – lỏng) là quá trình phân bố các chất tan giữa hai pha lỏng và rắn; trong đó, chất tan ban đầu ở trong pha lỏng (nước hoặc dung môi hữu cơ), chất để hấp thụ chất tan ở dạng rắn (dạng hạt, nhỏ và xốp) – pha rắn. Pha rắn (pha tĩnh) thường là các hạt silica gel xốp trung tính, hạt oxit nhôm, silica gel trung tính đã được ankyl hoá nhóm -OH bằng các gốc hydrocarbon mạch thẳng (-C2, -C4, -C8, -C18), hay nhân phenyl, các polyme hữu cơ, các loại nhựa hoặc than hoạt tính được nhồi vào cột chiết nhỏ 29 hoặc nén ở dạng đĩa dày 1-2 mm, đường kính 3-4 cm (đĩa chiết). Một số loại cột SPE pha thường thông dụng như Silica, NH2, CN, Diol, Florisil; trong đó cột SPE 2,3 lớp của hỗn hợp các chất nền là tối ưu nhất để làm sạch dịch chiết độc tố CTXs. Dung môi giải hấp phụ thường là hỗn hợp CHCl-MeOH, hexan-MeOH, AcOH-MeOH hay EtOAc-MeOH với tỉ lệ thể tích nhất định hoặc Acetoniltril (MeCN). c) Phương pháp loại tạp chất nhóm lipid trong dịch chiết Với một số mẫu có hàm lượng chất béo cao (gan, ruột cá), cần thực hiện bước thứ tiếp theo nhằm loại tạp chất béo. Trong trường hợp này, các cột pha đảo như Silica C18, C8, C4, NH2, CN, PHE, PSD, HLB thường được sử dụng dựa vào tương tác kỵ nước giữa pha rắn và mẫu. Hai loại sắc ký pha đảo cột nhồi thường được dùng là một loại pha tĩnh là chất mang (pha nền) silica gel gắn với các dây alkyl bằng liên kết hóa học (silica gel biến tính hóa học) và loại còn lại là các hạt nhựa nhồi cột. Ngoại trừ trường hợp đặc biệt, loại chất mang silica gel pha đảo thường được dùng vì khả năng tạo số lượng lớn đĩa lý thuyết. Phải sử dụng các hạt nhựa nhồi cột trong trường hợp pH của pha động dùng trong việc phân tách nằm ngoài khoảng cho phép để được sử dụng của silica gel hoặc nếu các nhóm silanol chưa được alkyl hóa nằm trên bề mặt của silica gel gây hiệu ứng bất lợi cho việc phân tách và vấn đề này không thể được giải quyết bằng cách thay đổi thành phần pha động. Dù vậy, đó là những trường hợp tương đối hiếm gặp. Các nhóm chức alkyl điển hình gắn trên silicagel bằng phương pháp hóa học gồm octadecyl, octyl và trimethyl. Mạch alkyl càng dài, lực lưu chất càng mạnh. Tuỳ lực lưu chất kỵ nước đối với hợp chất mục tiêu, cột có lực lưu chất yếu hơn được chọn nếu hợp chất cần phân tách không thể rửa giải trong một thời gian thích hợp ở điều kiện khi pha động cung cấp lực rửa giải mạnh nhất (dung môi hữu cơ 100%). Ngược lại, sử dụng cột có lực lưu chất mạnh hơn nếu chất cần phân tách không được lưu giữ trong một thời gian thích hợp ở điều kiện khi pha động cung cấp lực rửa giải yếu nhất (100% dung dịch đệm). Pha động cơ bản thường là một hỗn hợp gồm nước/dung dịch đệm và dung môi hữu cơ. Ba tác nhân chủ yếu ảnh hưởng đến sự phân tách là loại dung môi hữu cơ là tỉ phần dung môi hữu cơ 30 và độ pH của dung dịch đệm. Acetonitrile (MeCN) và MeOH là các dung môi hữu cơ được dùng phổ biến nhất. MeCN cung cấp lợi ích kép là có độ nhiễu thấp do độ hấp thu UV ở mức kém và tuổi thọ của cột được kéo dài, và cho phép việc phân tích diễn ra ở áp suất thấp. Tuy nhiên, MeOH có thể được dùng phổ biến hơn nhờ vào tính chọn lọc, thể hiện ở trường hợp tách được nhiều chất mà MeCN không tách được do sự khác biệt về hằng số phân ly của các chất trong 02 dung môi này. Mặt khác, tỉ phần của dung môi hữu cơ được chọn sao cho đạt được sự phân tách theo mong muốn và tốc độ rửa giải nhanh nhất, tăng tỉ phần của dung môi hữu cơ để tăng tốc độ rửa giải và ngược lại, giảm tỉ phần hữu cơ sẽ giảm tốc độ rửa giải nhưng sự phân tách diễn ra tốt hơn. Khi chỉ có các hợp chất trung hòa được phân tích, thời gian lưu không bị ảnh hưởng bởi pH của pha động, vì vậy việc phân tích thông thường được dùng bởi dung môi nước lẫn hữu cơ. Tuy nhiên, điều kiện về độ pH cũng phải được đáp ứng khi phân tích các acid và base. Đối với độc tố CTXs, cột Sephadex LH-20, CIS packed column và LiChrosorb RP-18 hay được sử dụng để làm sạch dịch chiết ở bước này với dịch giải hấp phụ là MeOH-nước ở các tỉ lệ thể tích nhất định (6:4, 7:3, 8:2, 9:1). Bước cuối cùng trong tinh sạch độc tố CTXs là sử dụng cột pha đảo chuỗi polymer ODS (InertSep C18, 200 mg). * Thực nghiệm chiết tách và loại tạp dịch chiết độc tố CTX từ cơ và gan của Chình biển Quy trình chiết tách được thực hiện theo Suzuki và cs., 2017 [1], mẫu được chiết trong dung môi Acetone với tỉ lệ w/v : 1/3. - Cân mỗi mẫu khoảng 5 gam, đồng nhất và cho vào ống ly tâm nhựa, thêm 15 mL acetone, ngâm qua đêm. - Ly tâm ở 3000 v/p trong 5 phút thu dịch trong, lặp lại 02 lần chiết với cùng thể tích acetone. - Thu gom toàn bộ dung dịch acetone của 02 lần chiết. Khi acetone được sử dụng làm dung môi chiết ban đầu để tách độc tố nhóm CTXs ra khỏi mô cơ cá, dung môi này sẽ được bay hơi, thu được cặn. 31 - Hoà tan cặn trong 4 mL diethyl ether, lắc đều trong phễu chiết thuỷ tinh, để lắng cho đến khi dung dịch phân thành 02 lớp, thu lớp trên (diethyl ether) (công đoạn này thực hiện 2 lần). - Bay hơi toàn bộ diethyl ether bằng hệ thống cô quay chân không để thu nhận cặn rắn. Hoà tan cặn này trong 1 mL MeOH-DW (tỷ lệ 9:1, v/v), thêm vào 2 mL hexane, để loại tạp lipid. Lắc đều trong phễu chiết thuỷ tinh, để lắng cho đến khi dung dịch phân 2 lớp, thu nhận lớp dưới (MeOH-DW). Cô quay chân không đuổi MeOH, thu được cặn thô chứa độc tố. * Thực nghiệm khảo sát quy trình tinh sạch dịch chiết độc tố từ thịt cá Việc sử dụng acetone làm dung môi chiết độc tố với thể tích và số lần chiết như đã trình bày ở phần trên cho phép chiết CTXs khỏi mô cá, tuy nhiên cần xem xét mức độ sạch của dịch chiết trước khi phân tích LC/MS-MS. Để đánh giá sự cần thiết của giai đoạn làm sạch dịch chiết, quá trình chiết với acetone được tiến hành trên 6 mẫu cá (03 mẫu cơ, 03 mẫu gan). Mục đích của bước thử nghiệm này là để xác định điều kiện tối ưu tron