Nghiên cứu thành phần hoá học và tác dụng ức chế enzyme α-Glucosidase từ loài trà shan tuyết camellia sinensis var. assamica (j.w.mast.) kitam

var. assamica, nhóm tác giả Murakami đã phân lập được tám triterpenoid: assamsaponin A-E (89-93), theasaponin E1 (94), theasaponin E2 (95) và camelliasaponin B1 (96). Hoạt tính bảo vệ dạ dày của các hợp chất thu được đã được đánh giá và kết quả chỉ ra rằng hợp chất 94 thể hiện hoạt tính ức chế tổn thương niêm mạc dạ dày gây ra bởi ethanol trên chuột tốt hơn so với thuốc tham khảo omeprazole [13]. Năm 2000, nhóm tác giả Murakami tiếp tục phân lập được thêm bốn hợp chất assamsaponin F- I (97-100) từ hạt và assamsaponin J (101) từ lá của loại trà Camellia sinensis var. assamica [14]. 15 Năm 2000, Lu và cộng sự cũng đã phân lập được ba triterpenoid từ rễ loài trà C. sinensis var. assamica bao gồm: axit 3-O-α-L- 16 arabinopyranosyl(1→3)-β-D-glucuronopyranosyl-21,22-di-O-angeloyl-R1- barrigenol-23-oic (102), axit 3-O-α-L-arabinopyranosyl(1→3)-β-D- glucuronopyranosyl-21-O-angeloyl-22-O-2-methylbutanoyl-R1 barrigenol 23- oic (103) và axit 3-O-α-L-arabinopyranosyl (1→3)-β-D-glucuronopyranosyl- 16α-O-acetyl-21-O-angeloyl-22-O-2-methylbutanoyl-R1-barrigenol-23-oic (104) [15]. Theo nghiên cứu của Ohta, tám oligoglycoside triterpen: floraassamsaponin I-VIII (105-112) được phân lập từ nụ hoa của loài Camellia sinensis var. assamica. Các hợp chất floraassamsaponin II-IV (106- 108) và floraassamsaponin VII (111) đã được thử nghiệm hiệu quả ức chế sự tổng hợp của 42-mer amyloid β-protein (Aβ42), một loại protein gây ra bệnh Alzheimer. Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng các hợp chất 107, 108 và 111 có hiệu quả ức chế đối với sự tổng hợp của Aβ42 với phần trăm ức chế (%) tương ứng là 107: 73.4±8.0 (p<0.01), 108: 68.8±8.4 (p<0.01), và 111: 56.9±13.2 (p<0.01) ở nồng độ 100 µM. Trong khi đó, hợp chất 106 có ảnh hưởng yếu hơn với phần trăm ức chế là 18.3±5.4 (p<0.01) ở cùng nồng độ [16]. 17 1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước Ở Việt Nam, chi trà mới chỉ có một vài nghiên cứu sơ bộ về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. Năm 2014, tác giả Trần Thị Liên đã nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của phụ phẩm trà trong quá trình chế biến trà khô của trà xanh Thái Nguyên. Tác giả đã phân lập được bốn hợp chất từ dịch chiết ethyl acetate của trà: epiafzelechin (4), epicatechin (5), epigallocatechin (6) và catechin (36). Đồng thời, dịch chiết nước từ trà và phân đoạn giàu polyphenol thể hiện hoạt tính kháng oxi hoá DPPH rất tốt, trong đó tốt nhất là phân đoạn giàu polyphenol có giá trị EC50 = 5.0 μg/ml tốt hơn chất đối chứng Resveratrol 1.66 lần và cao trà tổng có giá trị EC50 = 8.9 μg/ml, chất đối chứng (8.3 μg/ml) [17]. Nguyễn Thị Hương và cộng sự đã phân lập được hai saponin triterpene: camellioside I (113) và J (114), và hai glycoside megastigmane: camellistigoside A (115) và B (116) từ lá của loài Camellia bugiamapensis. Tác dụng ức chế của chúng đối với sự sản xuất NO do LPS gây ra trong các tế bào RAW264.7 đã được đánh giá. Trong số các hợp chất này, chỉ có camellioside I (113) cho thấy hoạt tính ức chế sản xuất NO với IC50 = 49.42 ± 1.34 µM, so với chất đối chứng dương là cardamonin (IC50 là 2.20 ± 0.27µM). Thử nghiệm khả năng sống của tế bào chỉ ra rằng hợp chất này ít hoặc không ảnh hưởng đến độc tính tế bào [18]. 18 Gần đây, nhóm tác giả Nguyễn Thị Hồng Vân đã tiến hành chiết tách các hợp chất flavonoid từ hoa của loài Camellia chrysantha và thu được các hợp chất: (-)-epicatechin (5), (+)-catechin (36), quercetin (75), quercetin-3- O-methyl ete (117) và kaempferol (118) [19]. 1.4. TỔNG QUAN VỀ TIỂU ĐƯỜNG 1.4.1. Khái quát về bệnh tiểu đường Tiểu đường là một nhóm bệnh rối loạn chuyển hóa cacbohydrat, mỡ và protein khi hormone insulin của tuyến tụy bị thiếu hay giảm tác động trong cơ thể, biểu hiện bằng mức đường trong máu luôn cao. Bệnh tiểu đường được chia làm hai loại chính sau: - Tiểu đường tuýp 1 (còn gọi là tiểu đường phụ thuộc insulin): cơ thể ngừng sản xuất insulin. Thường gặp ở trẻ em hoặc thiếu niên. Những bệnh nhân bị tiểu đường tuýp 1 cần phải được điều trị bằng insulin mỗi ngày để duy trì cuộc sống. - Tiểu đường tuýp 2: là một chứng bệnh mạn tính phát triển khi tuyến tụy không sản xuất đủ insulin hoặc khi các mô trong cơ thể không thể sử dụng insulin một cách bình thường. Tiểu đường tuýp 2 rất phổ biến (chiếm trên 90% số trường hợp mắc bệnh), thường gặp ở người trên 40 19 tuổi trong đó người bị bệnh tiểu đường thường dễ bị một số bệnh đi kèm như tăng huyết áp, đau thắt ngực, nhồi máu cơ tim, đục thuỷ tinh thể... và thường có tuổi thọ ngắn hơn những người khác. - Tiểu đường thai kỳ: đây là một tình trạng rối loại dung nạp glucose trong quá trình mang thai. Bệnh này làm tăng đường huyết trong thai nhi dẫn đến nguy cơ gây sảy thai, thai lưu, dị tật Bệnh tiểu đường thường gây ra những biến chứng nguy hiểm. Những biến chứng cấp tính của bệnh này có thể là hôn mê do tăng đường huyết, hạ đường huyết và tăng keto-axit máu. Các biến chứng lâu dài do bệnh tiểu đường gây ra gồm có các tổn thương thần kinh, tim mạch, thị giác, nguy cơ nhiễm trùng. Nguyên nhân là do lượng đường trong máu quá cao lâu ngày gây thương tổn các mạch máu nhỏ với hậu quả là mù mắt, suy thận, đồng thời thúc đẩy xơ mỡ động mạch (atherosclerosis) làm hẹp các động mạch lớn gây tai biến mạch máu não, nhồi máu cơ tim... Ngoài ra, bệnh tiểu đường còn có ảnh hưởng xấu lên dây thần kinh, cơ tim, da, chân và răng lợi. Các biến chứng mãn tính xảy ra sớm hay muộn, nặng hay nhẹ rất khác biệt ở từng bệnh nhân. 1.4.2. Các thuốc điều trị bệnh tiểu đường Để kiểm soát được đường huyết của các bệnh nhân mắc bệnh tiểu đường thường kết hợp chế độ ăn phù hợp với dùng thuốc. Thuốc cho bệnh nhân tiểu đường có 2 loại cơ bản là thuốc dùng đường tiêm và thuốc viên uống. 1.4.2.1. Các thuốc điều trị tiểu đường dùng tiêm - Isulin: Insulin là nội tiết tố của tuyến tuỵ do tế bào β của tiểu đảo Langerhans tiết ra. Insulin có tác dụng điều hoà đường huyết bằng cách đưa glucose qua màng tế bào vào chu trình Krebs. Sự tăng glucose trong máu có thể do thiếu insulin hay do insulin không thể hấp thụ vào các mô. Sự mất cân bằng này dẫn đến bất thường trong chuyển hoá glucid, lipid và protid. Insulin gắn vào receptor đặc hiệu trên màng tế bào, quá trình này sẽ hoạt hoá tyrosin kinase đặc hiệu của receptor ở trong tế bào và kinase này lại hoạt hoá protein kinase khác, bằng phản ứng phosphoryl hoá. Cuối cùng những enzym này có 20 thể phosphoryl hoá nhiều enzym quan trọng khác như glucokinase, glycogen synthetase.... - Amylin: Amylin là một hormon được bài tiết từ tế bào β của tuỵ cùng với insulin đóng vai trò hết sức quan trọng trong cơ chế điều hoà đường huyết. Trong tế bào β, insulin và amylin cùng được chứa trong mép nang tiết và cùng được bài tiết khi tăng đường huyết. Amylin có tác dụng ức chế bài tiết glucagon sau ăn và làm chậm tiêu hoá thức ăn ở dạ dày, chậm hấp thu đường ở ruột vì vậy làm cho đường huyết tăng chậm. Trong khi đó insulin có tác dụng tăng dự trữ glucose ở mỡ, cơ, xương và giảm sản xuất glucose ở gan, giảm tiết glucagon. Cả hai hormon này hoạt động tương trợ nhau giúp kiểm soát đường huyết tốt hơn. 1.4.2.2. Các thuốc điều trị tiểu đường dùng đường uống Nhiều thuốc có tác dụng hạ đường huyết được đưa vào cơ thể bằng đường uống. Theo cấu trúc và cơ chế tác dụng các chất này được chia thành 5 nhóm sau: - Các thuốc nhóm dẫn xuất biguanide: Chất đầu tiên thuộc biguanide tìm thấy có tác dụng hạ đường huyết là Metformin vào năm 1948. Dẫn xuất biguanid có công thức chung như sau: Trong nhóm biguanide gồm có: metformin, buformin, phenformin. Vì nguy cơ gây nhiễm acid lactic nên buformin, phenformin ngày nay ít được sử dụng. Cơ chế tác dụng của các thuốc nhóm này như sau: + Làm tăng tác dụng của insulin tại thụ thể và hậu thụ thể + Tăng sử dụng glucose ở tổ chức ngoại vi, đặc biệt ở tế bào cơ + Giảm sinh glucose ở gan + Giảm hấp thu glucose ở ruột 21 + Tăng sự nhạy cảm của insulin ở thụ thể và hậu thụ thể Chúng không có tác dụng kích thích bài tiết insulin ở tuỵ như các sulfamide chống tiểu đường. - Các thuốc nhóm dẫn xuất sulfamide: Khái niệm sulfamide chống tiểu đường xuất hiện từ năm 1942, sau khi Laubatiere thử nghiệm một loại sulfamide kháng khuẩn trên bệnh nhân thương hàn thấy có dấu hiệu hạ đường huyết. Nhưng mãi tới năm 1995 người ta mới thực sự tìm ra những chất có tác dụng điều trị thuộc nhóm dẫn xuất benzen sulfonylurea với các gốc ankyl có công thức chung là: Chất đầu tiên được đưa vào điều trị là Carbutamide (R1= ̶ NH2, R 2 = n ̶ C4H9) được dùng điều trị bệnh tiểu đường dưới dạng thuốc uống vào năm 1955. Sau nhiều năm nghiên cứu người ta thấy rằng không nhất thiết phải có nhóm -NH2 gắn với nhân thơm và khi thay nhóm ̶ NH2 bằng nhóm ̶ CH3, ̶ Cl hay một nhóm thế khác thì vẫn có tác dụng tốt và độc tính giảm đi. Cơ chế tác dụng là kích thích bài tiết insulin. Trong trạng thái sinh lý, đường huyết tăng cao sẽ có hiện tượng khoá kênh K+ ̶ ATP, dẫn tới K+ trong tế bào tăng đột ngột sẽ kích thích hoạt động của kênh Ca++ dưới tác động của AMP vòng, Ca++ vào tế bào tăng. Kích thích quá trình phosphoryl hoá và giải phóng insulin từ nang tiết vào máu. sulfamide có tác dụng như một cái khoá hoạt động trên kênh K+ ̶ ATP và vì vậy có tác dụng kích thích bài tiết insulin. Cho đến nay có rất nhiều sulfamide hạ đường huyết đã được khám phá và đưa vào điều trị. Dựa vào thời gian duy trì tác dụng (nhanh hoặc kéo dài) và liều dùng mà người ta chia sulfamide hạ đường huyết thành hai thế hệ, thế hệ một và thế hệ hai. Các sulfamide hạ đường huyết thế hệ một gồm có: carbutamide, tolbutamide, phenbutamide, metabutamide, chlorpropamide, tolcyclamide, acetohexamide, metahexamide, tolazamide. 22 Các sulfamide hạ đường huyết thế hệ hai cũng là các dẫn xuất của sulfonylurea có công thức tổng quát giống như sulfamide hạ đường huyết thế hệ thứ nhất nhưng được tìm ra trong thập kỷ 70 và đầu thập kỷ 80, nó bao gồm các phân tử có cấu trúc nhóm thế phức tạp hơn, có mạch cacbon dài hơn, có hiệu lực tác dụng mạnh hơn và tác dụng kéo dài hơn nên thường mỗi ngày chỉ phải uống một lần. Các sulfamide hạ đường huyết thế hệ hai gồm có glypinamide, gliclazide, glibonuride, glibenclamide, glipizide, glisoxepide, gliquidon, glimepiride. Trong số các sulfamide hạ đường huyết liệt kê ở trên thì tolbutamide, chlorpropamide và glibenclamide hiện đang được sử dụng phổ biến nhất trong điều trị bệnh tiểu đường tuýp 2 ở nước ta. - Các thuốc nhóm ức chế enzyme α-glucosidase: các thuốc loại này có tác dụng ngăn không cho hấp thu glucose vào máu. Vì thế có ưu điểm là không có nguy cơ gây hạ đường máu, không gây tăng cân (như: insulin và các sulfamid hạ đường huyết khác). Ngày nay trên thị trường xuất hiện một số thuốc ức chế enzyme α-glucosidase có tác dụng gây hạ đường huyết sau đây: + Acarbose: 23 Acarbose hoạt động theo cơ chế ức chế cạnh tranh sự phân giải đường phức. Acarbose là một phân tử được tổng hợp từ Actiplanes (vi khuẩn) bằng kỹ thuật sinh học. Hoạt động của nó làm chậm tiêu hóa đường bằng cách ức chế cạnh tranh enzyme α -glucosidase ruột và các yếu tố enzyme ở ruột non có nhiệm vụ tách các đường phức thành các đường đơn. Kết quả là kéo dài thời gian thủy phân các đường đôi dẫn đến việc tiêu hóa các đường này bị chậm lại. Thuốc có tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase ở rìa bàn chải niêm mạc ruột non. Ngoài ra còn ức chế các enzym thuỷ phân đường đa ở ruột, do vậy làm giảm hấp thu glucose. + Voglibose (Basen): Voglibose là một chất ức chế α-glucosidase được sử dụng để làm giảm mức đường huyết sau ăn ở những người bị tiểu đường. Voglibose làm chậm sự hấp thu glucose do đó làm giảm nguy cơ biến chứng mạch máu vĩ mô. - Benfluorex: Benfluorex có tác dụng tạo thuận lợi cho sự xâm nhập và sử dụng glucose ở tế bào, không có tác dụng trên sự bài tiết insulin, ngoài ra 24 còn có tác dụng giảm lipid máu. Thuốc dùng để hỗ trợ cho chế độ ăn kiêng trong bệnh tiểu đường. - Các thuốc nhóm meglitinide: Các thuốc nhóm meglitinide liên kết với kênh K+ (KATP) phụ thuộc ATP trên màng tế bào của các tế bào beta tuyến tụy theo cách tương tự như sulfoamide nhưng có ái lực liên kết yếu hơn và phân ly nhanh hơn từ vị trí gắn SUR1. Điều này làm tăng nồng độ kali nội bào. Sự khử cực này mở các kênh Ca2+ có điện áp. Sự gia tăng canxi nội bào dẫn đến tăng phản ứng tổng hợp insulin trong màng tế bào, và do đó tăng tiết insulin. Hiện nhóm này có 2 hoạt chất chính là repaglinide (Prandin) và nateglinide (Starlix). - Các thuốc nhóm thiazolidinedione (TZD hay glitazone): Các thuốc nhóm TZD có tác dụng làm tăng nhạy cảm của insulin tại các mô trong cơ thể và giảm rối loạn mỡ máu tương tự như nhóm Biguanide. Nhưng thuốc lại làm tăng tích trữ mỡ dưới da nên thường gây tăng cân cho người bệnh. Mặt khác còn gây giữ nước, do đó cần thận trọng khi sử dụng điều trị cho những người bệnh tim mạch hay viêm gan, men gan tăng cao. Thuốc đang được dùng là rosiglitazone và pioglitazone, nhóm này trước đây có troglitazone nhưng nay đã bị cấm vì tác hại gây độc với gan, dẫn tới suy gan và tử vong. 25 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Mẫu lá trà Shan tuyết (Camellia sinensis var. assamica (J.W.MAST.) Kitam.) được thu hái tại Nguyên Bình, Cao Bằng, Việt Nam vào tháng 4/2019. Tên khoa học được TS. Nguyễn Thế Cường, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật giám định. Mẫu tiêu bản (NCCT-P86) được lưu tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phương pháp phân tích, phân tách và phân lập các hợp chất  Sắc ký lớp mỏng (TLC) Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ trên bếp điện đến khi hiện màu.  Sắc ký lớp mỏng điều chế Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel 60G F254 (Merck 1,05875), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại hai bước sóng 254 nm và 365 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất; ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất; sau đó cạo lớp silica gel có chất, giải hấp phụ và tinh chế lại bằng cách kết tinh trong dung môi thích hợp.  Sắc ký cột (CC) Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường và chất hấp phụ pha đảo. Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh). Chất hấp phụ pha đảo là octadecylsilyl (ODS) hoặc YMC (30-50 m, Fuji Silysia Chemical Ltd.). Nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 (Misubishi Chem. Ind. Co., Ltd.). 26 2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất Phương pháp chung để xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất là sự kết hợp xác định giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại bao gồm:  Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Phổ NMR đo trên các máy: máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer của Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Chất nội chuẩn là TMS (Tetrametyl Silan). Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC và HMBC. Dung môi được sử dụng bao gồm các dung môi: CD3OD hoặc DMSO- d6. 2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase Hoạt tính ức chế α-glucosidase được thực hiện dựa vào phản ứng thủy phân p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG) thành đường glucose và p- nitrophenol, hợp chất có màu vàng, dưới xúc tác của enzyme α-glucosidase. Khi mẫu thử có hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase, sự tạo thành hợp chất p-nitrophenol sẽ giảm, do vậy mật độ quang (OD) của p-nitrophenol so với mẫu đối chứng, không bị ức chế sẽ giảm theo. Mật độ quang (OD) của p- nitrophenol sinh ra sau phản ứng được đo ở bước sóng 405 nm và được dùng để đánh giá hoạt động ức chế enzyme của mẫu thử. Cách tiến hành: - Sử dụng phiến 96-giếng - Trong mỗi giếng chứa mẫu nghiên cứu (50 L) đã ủ với enzyme α- glucosidase (100 L) trong 10 phút ở 25oC sau đó bổ sung p- nitrophenyl- α- D-glucopyranoside (50 L), ủ trong 5 phút ở 25oC. Đo OD ở bước sóng 405 nm. 27 - Chất đối chứng dương: Acarbose - Kết quả được tính theo công thức sau: % Ức chế = 100 OD - OD )OD - (OD - )OD - (OD -c+c bs-cc x+ Trong đó: ODc+: Mật độ quang trung bình của mẫu chứng dương (không có mẫu thử, có α-glucosidase; trường hợp này coi như giá trị ức chế 0%); ODc-: Mật độ quang trung bình của mẫu chứng âm (không có mẫu thử và α-glucosidase; trường hợp này coi như giá trị ức chế 100%); ODs: Mật độ quang trung bình của mẫu thử; ODb: Mật độ quang trung bình mẫu trắng (có mẫu thử, không có α- glucosidase). Nồng độ ức chế 50%, IC50 được xây dựng trên 5 nồng độ thử nghiệm. Giá trị IC50 được xác định theo phương pháp hồi quy tuyến tính trên phần mềm Graphpad Prism 5.0. 2.3. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 2.3.1. Hóa chất Dung môi: methanol, dichloromethane, ethyl acetate, acetonitrile, n- hexan, dichloromethane, acetone, sulfuric acid, nước cất. 2.3.2. Thiết bị  Bản mỏng tráng sẵn silica gel DC-Alufolien 60 F254 và RP18 F254S (Merck)  Bản mỏng điều chế tráng sẵn silica gel 60G F254 (Merck 1,05875)  Đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 và 365 nm  Chất hấp phụ silica gel (Silica gel 240-430 mesh, Merck)  Chất hấp phụ pha đảo (ODS hoặc YMC 30-50 m, Fuji Silysia, Nhật Bản)  Máy fraction collector EYELLA DC-1200 28  Máy cộng hưởng từ hật nhân Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer. 29 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM 3.1. PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT Mẫu lá trà Shan tuyết khô (5 kg) được nghiền nhỏ ngâm trong bể siêu âm với methanol ba lần (mỗi lần 15L, 30 phút). Dịch chiết methanol được gom lại, lọc qua giấy lọc và cất thu hồi dung môi dưới áp suất thấp thu được 400 g cặn chiết methanol. Cặn chiết này được phân tán vào nước cất và chiết phân bố lần lượt với các dung môi tăng dần độ phân cực (dichloromethane, ethyl acetate). Các dịch chiết được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được các cặn chiết tương ứng dichloromethane (CA1A, 100.0 g), ethyl acetate (CA1B, 70.0 g) và dịch nước (CA1C). Hình 3.1. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài trà Shan tuyết C. sinensis var. assamica 30 Tiếp đó, phần cặn ethyl acetate được đưa lên cột sắc ký silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải gradient CH2Cl2/MeOH (50/1, 20/1, 10/1, 2/1, v/v) thu được bốn phân đoạn CA1B1-CA1B4. Phân đoạn CA1B2 được đưa lên cột pha đảo với hệ dung môi rửa giải MeOH/nước (1/1.5, v/v) thu được ba phân đoạn CA1B2A (1.5 g), CA1B2B (1.9 g) và CA1B2C (2.0 g). Phân đoạn CA1B2A được tinh chế trên máy HPLC (cột J’sphere M-80, dài 150 mm×20 mm ID, sử dụng 25% acetonitrile trong nước, tốc độ 3 mL/min) thu được bốn hợp chất CA1 (6 mg), CA3 (98 mg), CA5 (76 mg) và CA9 (30 mg). Phân đoạn CA1B2B được tinh chế trên máy HPLC (cột J’sphere M-80, dài 150 mm×20 mm ID, sử dụng 28% acetonitrile trong nước, tốc độ 3 mL/min) thu được hai hợp chất CA2 (3 mg) và CA4 (30 mg). Phân đoạn CA1B4 được đưa lên cột pha đảo với hệ dung môi rửa giải MeOH/nước (1/2.0, v/v) thu được ba phân đoạn CA1B4A (0.9 g), CA1B4B (3.5 g) và CA1B4C (2.5 g). Phân đoạn CA1B4A và CA1B4B được lần lượt phân tách trên cột Sephadex LH-20 với hệ dung môi rửa giải bằng MeOH/nước (1/1, v/v) thu được CA6 (20 mg) và CA7 (500 mg). Phân đoạn CA1B4C được tinh chế trên cột sắc ký silica gel pha thường với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH (5/1, v/v) thu được CA8 (500 mg). 3.2. THÔNG SỐ VẬT LÍ CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC 3.2.1. Hợp chất CA1 Tên: 5,4′-dihydroxydihydrostilbene 3-O-[6′′-O-(4′′′-methoxy)galloyl]-β-D- glucopyranoside (chất mới) Chất bột vô định hình, màu trắng. Công thức phân tử: C28H30O12. Khối lượng phân tử: 558 HR-ESI-MS: m/z 593.1429 [M+Cl] – Tính toán lý thuyết cho công thức [C28H30O12Cl] –, 593.1426 1H-NMR (CD3OD) và 13C-NMR (CD3OD): Xem Bảng 4.1. 31 3.2.2. Hợp chất CA2 Tên: 5,4′-dihydroxydihydrostilbene 3-O-[6′′-O-(3′′′,4′′′- dimethoxy)galloyl]-β-D-glucopyranoside (chất mới) Chất bột vô định hình, màu trắng. Công thức phân tử: C29H32O12. Khối lượng phân tử: 572 HR-ESI-MS: m/z 607.1574 [M+Cl] – Tính toán lý thuyết cho công thức [C29H32O12Cl] –, 607.1582 1H-NMR (CD3OD) và 13C-NMR (CD3OD): Xem Bảng 4.2. 3.2.3. Hợp chất CA3 Tên: 5,4′-dihydroxydihydrostilbene 3-O-β-D-glucopyranoside Chất bột vô định hình, màu trắng. Công thức phân tử: C20H24O8 Khối lượng phân tử: 392 1H-NMR (CD3OD) và 13C-NMR (CD3OD): Xem Bảng 4.3. 3.2.4. Hợp chất CA4 Tên: Sasastilboside A Chất bột vô định hình, màu trắng. Công thức phân tử: C21H26O8. Khối lượng phân tử: 406 1H-NMR (CD3OD) và 13C-NMR (CD3OD): Xem Bảng 4.4. 3.2.5. Hợp chất CA5 Tên: 3,5-dihydroxydihydrostilbene 4′-O-β-D-glucopyranoside Chất bột vô định hình, màu trắng. Công thức phân tử: C20H24O8. 32 Khối lượng phân tử: 392 1H-NMR (CD3OD) và 13C-NMR (CD3OD): Xem Bảng 4.5. 3.2.6. Hợp chất CA6 Tên: Epicatechin Chất bột vô định hình, màu vàng. Công thức phân tử: C15H14O6. Khối lượng phân tử: 290 1H-NMR (CD3OD) và 13C-NMR (CD3OD): Xem Bảng 4.6 3.2.7. Hợp chất CA7 Tên: Epicatechin 3-O-gallate Chất bột vô định hình, màu vàng. Công thức phân tử: C22H18O10 Khối lượng phân tử: 442 1H-NMR (CD3OD): H 5.05 (br s, H-2),5.55 (H-3), 2.89 (dd, J = 2.0, 17.0 Hz, H-4)/ 3.02 (dd, J = 4.5, 17.0 Hz, H-4), 6.00 (s, H-6/H-8), 6.97 (d, J = 2.0 Hz, H-2′), 6.73 (d, J = 8.0 Hz, H-5′), 6.84 (dd, J = 2.0, 8.0 Hz, H-6′) và 6.98 (s, H-2″/H-6″). 13C-NMR (CD3OD): C 78.5 (C-2), 70.0 (C-3), 26.8 (C-4), 157.8 (C-5), 96.6 (C-6), 157.8 (C-7), 95.9 (C-8), 157.2 (C-9), 99.4 (C-10), 131.4 (C- 1′), 115.1 (C-2′), 145.9 (C-3′), 145.9 (C-4′), 116.0 (C-5′), 119.4 (C-6′), 121.5 (C-1′′), 110.2 (C-2′′/C-6′′), 146.2 (C-3′′/C-5′′), 139.7 (C-4′′) và 167.6 (C-7′′). 3.2.8. Hợp chất CA8 Tên: Epigallocatechin 3-O-gallate Chất bột vô định hình, màu vàng. Công thức phân tử: C22H18O11 Khối lượng phân tử: 458 33 1H-NMR (CD3OD) và 13C-NMR (CD3OD): Xem Bảng 4.7. 3.2.9. Hợp chất CA9 Tên: Kaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside Chất bột vô định hình, màu vàng. Công thức phân tử: C21H20O11 Khối lượng phân tử: 448 1H-NMR (DMSO-d6): H 6.20 (d, J = 1.5 Hz, H-6), 6.43 (d, J = 1.5 Hz, H-8), 8.04 (d, J = 9.0 Hz, H-2′/H-6′) và 6.88 (d, J = 9.0 Hz, H-3′/H-5′). 13C-NMR (DMSO-d6):C 156.2 (C-2), 133.2 (C-3), 177.5 (C-4), 161.2 (C-5), 98.8 (C-6), 164.4 (C-7), 93.7 (C-8), 156.4 (C-9), 103.9 (C-10), 120.9 (C-1′), 130.9 (C-2′/C-6′), 115.1 (C-3′/C-5′), 160.0 (C-4′), 100.9 (C-1′′), 74.2 (C-2′′), 76.4 (C-3′′), 69.9 (C-4′′), 77.5 (C-5′′) và 60.9 (C-6′′). 3.3. ĐÁNH GIÁ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYME α- GLUCOSIDASE CỦA CÁC HỢP CHẤT Các hợp chất CA6-CA9 được đánh giá sơ bộ hoạt tính ức chế enzyme α-Glucosidase 34 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA CÁC HỢP CHẤT 4.1.1. Hợp chất CA1: 5,4′-dihydroxydihydrostilbene 3-O-[6′′-O- (4′′′-methoxy)galloyl]-β-D-glucopyranoside (chất mới) Hình 4.1. Cấu trúc hóa học của CA1 và hợp chất tham khảo CA1a Hợp chất CA1 thu được dưới dạng bột vô định hình, màu trắng. Công thức phân tử của CA1 được xác định là C28H30O12 dựa trên phổ HR-ESI-MS m/z 593.1429 [M+Cl] – (tính toán theo lý thuyết cho công thức [C28H30O12Cl] – , 593.1426). Phổ 1H-NMR của hợp chất CA1 thấy xuất hiện tín hiệu bốn proton của một vòng thơm thế p- tại δH 6.65 (2H, d, J = 8.5 Hz) và 6.82 (2H, d, J = 8.5 Hz), ba proton của một vòng thơm thế 1,3,5- tại δH 6.20 (dd, J = 1.0, 2.0 Hz, 1H), 6.28 (1H, dd, J = 1.0, 2.0 Hz) và 6.36 (1H, dd, J = 2.0, 2.0 Hz), hai proton của một vòng thơm thế 1,3,4,5- tại δH 7.11(2H, s), hai nhóm methylene tại δH 2.58 (1H, m)/2.65 (1H, m) và 2.61 (1H, m)/2.71 (1H, m), một nhóm methoxy ở δH 3.85 (3H, s), và một proton anomeric ở δH 4.69 (1H, d, J = 7.5 Hz). Phổ 13C-NMR và HSQC của CA1 thể hiện tín hiệu của 28 carbon, bao gồm 10 carbon không liên kết trực tiếp với hydro (δC 126.5, 133.8, 141.3, 145.6, 151.8×2, 159.0, 156.3, 159.9 và 167.8), 14 carbon methine (δC 71.8, 74.8, 75.5, 77.8, 102.4, 103.1, 109.2, 110.4×2, 111.1, 116.0×2, 130.6×2), 3 carbon methylene (δC 37.8, 39.2 và 65.1), và một nhóm methoxy (δC 60.7). Phân tích dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất CA1 cho thấy đây là một dẫn xuất của dihydrostilbene, tương tự hợp chất 5,4′- 35 dihydroxydihydrostilbene 3-O-β-D-glucopyranoside (CA1a) [20], ngoại trừ sự xuất hiện thêm một nhóm 4′′′-methoxygalloyl tại glc C-6′′. Bảng 4.1. Số liệu NMR của CA1 và chất tham khảo CA1a