Tiểu luận Đánh giá tính đa hình ADN và khả năng chọn dòng tế bào đột biến ở một số giống lúa đặc sản

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RAPD - PCR TRONG NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH ADN

1.1.1. Phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR)

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) do Mullis và CS phát minh năm 1985. Thực chất đây là một phương pháp tạo dòng in vitro, không cần sự hiện diện của tế bào.

Điều kiện của phản ứng PCR: ADN khuôn, 2 đoạn mồi (mỗi mồi dài từ 18 - 24 nucleotit), Taq polymeraza (là enzym chịu nhiệt), bốn loại deoxyribonucleotit triphosphat (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), dung dịch đệm và ion Mg++ [21].

Trước đây phản ứng PCR thường dùng ADN polymeraza I của E.coli và T4 ADN polymeraza. Các enzym này bị bất hoạt ở nhiệt độ cao nên qua mỗi chu kỳ phản ứng phải phổ sung thêm enzym. Việc phát hiện ra các loại ADN polymeraza bền nhiệt (Vert ADN polymeraza, Pfu ADN polymeraza, Taq ADN polymeraza.) đã cho phép quá trình nhân bản được thực hiện tự động hoá. Ngoài độ bền nhiệt các enzym này còn khác nhau về khả năng kéo dài chuỗi ADN cần nhân bản. Thông dụng nhất là Taq ADN polymeraza được tách từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus, sống ở nguồn nước nóng 940C- 1000C. Enzym này hoạt động tốt nhất ở 700C - 800C. Trọng lượng phân tử của Taq ADN polymeraza là 94 KD, gen tổng hợp dài 2499 cặp bazơ nitơ, mã hoá cho 832 axit amin [34].

Năm 1988, Saiki đã chỉ ra rằng hoạt tính của Taq polymeraza giảm 50% sau 130 phút ở 92,50C; sau 40 phút ở 950C và sau 5-6 phút ở 970C. Mặt khác, nồng độ ion Mg++ và dNTP trong hỗn hợp phản ứng cũng ảnh hưởng rất nhiều đến hoạt tính của Taq polymeraza [23, 34].

Đoạn mồi là những đoạn oligonucleotit được thiết kế bổ sung với mạch ADN khuôn. Để gắn mồi một cách đặc hiệu, đoạn mồi thường được tổng hợp dài từ 18 - 24 nucleotit. Phản ứng PCR dùng một cặp mồi gồm một mồi xuôi (forward) và một môi ngược (reverse), mồi luôn gắn với ADN khuôn theo chiều từ 3 - 5 và ADN polymeraza kéo dài chuỗi tổng hợp về đầu 5.

Nhìn chung, trình tự mồi, nhiệt độ gắn mồi và nồng độ mồi trong phản ứng PCR là những nhân tố quyết định sự thành công của phản ứng.

Phản ứng PCR là một chuổi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn sau:

- Giai đoạn 1: biến tính ADN (denaturing), ở nhiệt độ khoảng từ 940C - 950C, trong thời gian ngắn từ 30 giây - 1 phút, để tách sợi ADN kép thành 2 sợi ADN đơn.

- Giai đoạn 2: giai đoạn gắn mồi (annealing), ở nhiệt độ 400C - 600C, hai đoạn mồi sẽ gắn vào ADN khuôn ở vị trí mã tương đồng theo nguyên tắc bổ sung ở hai đầu đoạn ADN cần nhân. Nhiệt độ của bước gắn mồi tuỳ thuộc vào loại từng mồi cụ thể, được tính toán dựa trên nhiệt độ nóng chảy (Tm) của đoạn mồi. Vì vậy giai đoạn này quyết định tính đặc hiệu của phản ứng PCR.

Công thức tính nhiệt độ nóng chảy (Tm) của đoạn mồi:

Tm =81.5 + 16.6 (log10{J+}) + 0.41 (%G + C) - (600/I) - 0.63 (%FA) [23].

Trong đó: {J+} : nồng độ của các cation hoá trị I.

FA : chất dùng để gây biến tính ADN.

I : chiều dài của mồi.

- Giai đoạn 3: giai đoạn kéo dài (extension) ở nhiệt độ 720C, ADN Taq polymeraza hoạt động tổng hợp, kéo dài các mạch theo nguyên tắc bổ sung từ hai đầu sợi khuôn ban đầu. Geifand và White (1990) đã thông báo về tốc độ tổng hợp của Taq là: 150 nucleotit/giây ở 750C - 800C; >60 nucleotit/giây ở 700C; 24 nucleotit/giây ở 550C; 1,5 nucleotit/giây ở 370C; 0,25 nucleotit/giây ở 220C [23].

Sau một chu kỳ gồm ba giai đoạn như trên, từ một phân tử ADN khuôn được nhân lên thành hai, các đoạn ADN vừa nhân bản trong mỗi chu kỳ lại làm khuôn cho chu kỳ nhân bản tiếp theo vì đầu tận cùng của sản phẩm bổ sung với mồi. Do đó sau mỗi chu kỳ tổng hợp đựơc lượng ADN gấp đôi và như vậy sau n chu kỳ nhân bản sẽ tạo ra 2n bản ADN khuôn ban đầu [13].