Tóm tắt Luận án Nghiên cứu cải tiến qui trình tổng hợp nguyên liệu mesna và ứng dựng bào chế thuốc tiêm

i và Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương. 2.4.3. Phương pháp thử độc tính cấp của nguyên liệu mesna Phương pháp thử độc tính cấp của nguyên liệu mesna là mô hình liều cố định theo hướng dẫn của OECD đối với các hóa dược kết hợp vói hưóng dẫn của Bộ Y tế. Căn cứ vào các TLTK đã công bố về độc tính cấp của mesna, lựa chọn liều khởi đầu là một trong những liều cố định 5, 50, 300, 2000, 5000 mg/kg theo hưóng dẫn của OECD. Tùy theo kết quả đáp ứng của liều khởi đầu mà tiến hành thử tiếp mức liều cao hơn hoặc thấp hơn trên 5 chuột nhắt trắng, trưởng thành, giống cái cho mỗi nhóm. Căn cứ vào kết quả thu được để phân loại mẫu thử theo mức độ độc GHCS. 2.4.4. Phương pháp bào chế Bao bì thuốc: lọ thủy tinh, nút cao su và nắp nhôm được xử lý theo phương pháp thường qui. Dung dịch tiêm được bào chế theo thứ tự: sục khí nitơ vào nước cất pha tiêm 10 phút, hòa tan tá dược trong khoảng 70% thể tích nưóc cất, hòa tan dược chất, điều chỉnh pH đến giá trị thích hợp bằng dung dịch natri hydroxyd IN, bổ sung thể tích vừa đủ, khuấy, lọc qua màng lọc 0,2 jj.m, đóng lọ thủy tinh trung tính, thể tích 4ml, sục khí nitrogen trong 2 phút, đóng nút cao su, siết nắp nhôm, hấp tiệt khuẩn ở 121 °c trong 15 phút. 2.4.5. Phương pháp đánh giá chất lượng dung dịch tiềm mesna lOOmg/ml Mesna được định lượng bằng phương pháp HPLC với các điều kiện như sau: Cột Lichrospher C18 (250 X 4,6 mm; 10 Ị i i m ) hoặc cột tương đương; Nhiệt độ cột: 30 °C; Detector u v : 215 nm; Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút; Thể tích tiêm: 20 ỊL il . Thẩm định phương pháp định lượng: Phương pháp định lượng mesna được thẩm định các tiêu chuẩn: độ đặc hiệu, tính thích hợp, độ tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại, độ chính xác trung gian theo qui định của ICH và USP 38. Căn cứ tiêu chuẩn chất lượng của nguyên liệu mesna được qui định trong BP2015, USP38, đề tài đề xuất phương pháp xác định giói hạn tạp chất trong dung dịch tiêm mesna được tiến hành bằng phương pháp HPLC. Cột: C18 (250 X 4,6 mm; 10 Jim); Detector: 235 nm; Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút. Thể tích tiêm: 20 ỊL4.1. Các chỉ tiêu chất lượng khác theo qui định trong Dược điển Việt Nam IV. 2.4.6. Phương pháp đánh giá độ on định Mau nguyên liệu, dung dịch tiêm mesna 100 mg/ml được thử nghiệm lão hóa: ở điều kiện nhiệt độ 40 ± 2 °c, độ ẩm tương đối 75 ± 5%, thời gian theo dõi 6 tháng. Thử nghiệm dài hạn ở điều kiện nhiệt độ 30 ± 2 °c, độ ẩm tương đối 75 ± 5% tại Bộ môn Công nghiệp Dược và Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia - Trường Đại học Dược Hà Nội. Tuối thọ của thuốc được tính toán với sự trợ giúp của phần mem MINITAB 17.0.1 2.4.7. Phương pháp xử lý so liệu, kết quả nghiên cứu Các thí nghiệm được lặp lại 03 lần và lấy kết quả trung bình. Đánh giá phương pháp phân tích và các kết quả phân tích sử dụng phương pháp thống kê với công cụ hỗ trợ là phần mềm Microsoft office excel 2010. Tổng hợp natri 2-cloroethansulfonat (2) được thực hiện theo phương pháp của R. Bai trên cơ sở phản ứng Strecker với hiệu suất 74,5% tính theo natri sulíìt, t°„c: 293,0 - 295,0 °c, Rf= 0,31 (Hệ A); Rf = 0,42 (hệ C). IR (KBr), Vmax (cm4): 1195 và 1043 (-SCV), 806 và 604 (C-Cl). ESI-MS (MeOH), m/z: 142,9 [M-Na]- (CTPT: C2H4ClNa03S, M = 166,55 đvC). 1H- NMR (500 MHz, D20), (5 (ppm): 3,35 (2H, t ,J = 7,0 Hz, H-l); 3,86 (2H, t, J = 7,0 Hz, H-2). 1SC~NMR (125 MHz, c), ổ (ppm): 37,96 (C-2); 52,88 (C- 1). Các thông số tốt nhất cho phản ứng tổng hợp chất 2 từ 24,37 g natri Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u 3.1. Tống hợp và tinh chế mesna ở qui mô phòng thí nghiệm 3.1.1. Tổng họp natri 2-cloroethansul/onat (2) 1 2 M = 166,55M = 98,95 9Sulfit (hiệu suất cao nhất 80,6 ± 0,33%) là: Tỉ lệ mol 1,2-dicloroethan : natri Sulfit = 3 : 1 ; t°pư: hồi lưu; Tỉ lệ thể tích dung môi nước : ethanol 96% = 7 : 5; Tổng thể tích dung môi: 450 ml. 3.1.2. Tổng hợp mesna qua ừung gian muối thiouroni S 03Na ' HjN'’’ 'NHi 1 Trao dối ion ddNHs 25% Hs _______ e NKj (Purolile CIOƠR) ---- —► SO3 H2N=C ------------- *" Ss^ SOjNa Vrrr 2.NaOH,pH6,6 4 2 Man« Ọ) Tổng hợp 2-S-thiouroni ethansulfonat (3) từ 2 sử dụng tác nhân thioure, với xúc tác KI, hiệu suất 69,7%, t°nc: 267,5 - 269,0 °c, R/ = 0,19 (hệ C). IR (KBr), Vmax (cm"1): 3300 và 3088 (N-H); 2727 và 2226 (N+-H); 1653 (-C = N+), 1199 và 1041 (SO3-). ESI-MS (CH3OH), m/z: 185,0 [M+H]+; 182,9 [M-H]* (CTPT C3ĨỈ8N2O3 S2, M = 184,24 đvC). XH-NMR (500 MHz, D20), 5 (ppm): 3,29 (2H, t, J = 7,0 Hz, H-2); 3,48 (2H, t, J = 7,0 Hz5 H-l). Các thông số sau khảo sát phản ứng tổng hợp chất 3 từ 24,48 g chất 2 cho hiệu suất tốt nhất (75,1 ± 0,17%) là: Tỉ lệ mol chất 2 : thioure = 1 : 1,25; t°pư: 90 °c. Thể tích dung môi nước tham gia phản ứng là 60 ml. Tổng hợp guanidini 2-mercaptoethansulfonat (4) từ chất 3 sử dụng tác nhân NH3 với hiệu suất 88,9%, t°nc: 82,3-83,5 °c, R/ = 0,27 (hệ C). IR (KBr), vmax (em'1): 3398, 324ố, 3197 (N-H); 2991, 2943 (C-H no), 2571 (S- H); 2198 (N -H), 1668 (C = N+); 1197 và 1043 (-SO3-). ESI-MS (MeOH), m/z: 140,816 [M-NH2C(NH2)2] (CTPT: C3H 1 1 N3O3S2, M = 201,27 đvC). 13C-NMR (125 MHz5 CD3OD), 5 (ppm): 20,08 (C-2); 56,60(C-1); 159,95 (C-guanidini). Các thông số sau khảo sát phản ứng tổng hợp chất 4 từ 18,42 g chất 3 (hiệu suất phản ứng cao nhất 93,0 ± 0,78%) là: t°pư: 50 °C; Tỷ lệ mol natri 2-iS,-thiouroni ethansulfonat: NH3 = 1 : 4 . Tổng hợp mesna từ 4 sử dụng tác nhân natri nitrat hiệu suất 15,9%; t°nc: 265,0 - 267,5 °c. R/= 0,49 («-BuOH : AcOH : H20 = 6,0 : 2,0 : 2,0). 10 Tổng hợp mesna từ chất 4, sử dụng cation purolite C100E chuyển về acid 2-mercaptoethansulfonic, điều chỉnh về pH 6,6 bằng dd NaOH IM, tinh chế thu được mesna, hiệu suất 76,0%, t°nc: 263,0 - 265,5 °C5 R/= 0,49 (w-BuOH: AcOH: H20 = 6,0 : 2,0 : 2,0). IR (KBr), vmax (em'1): 2929 và 2852 (C-H no), 2553 (S-H), 1168 và 1058 (S03-> ESI-MS (MeOH), m/z: 140,835 [M-Na]' (CTPT C2H5Na03S2, M = 164,17 đvC). 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) 5 (ppm): 2,83-2,86 (2H, m, H-2); 3,03-3,06 (2H, m, H-l). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD),Ô (ppm): 20,12 (C-2); 56,61(C-1). Hiệu suất tổng hợp mesna qua trung gian muối thiouroni tính từ chất 2 là 53,0 ± 0,37%. Hàm lượng mesna 86,54 ± 0,28%. 3.1.3. Tong hợp mesna qua trung gian thioester Tổng hợp natri 2-(benzoylthio)ethansulfonat (5) từ acid thiobenzoic và NaHC03, hiệu suất 67,0%, t°„c: 314,0 - 316,0 °c (phân hủy), Rf = 0,74 (hệ B). IR (KBr), iứtnax (em'1): 3057 và 3007 (C-H thơm), 2954 (C-H no), 1664 (C = o thioester), 1178 và 1068 (SO3-). ESI-MS (CH3OH), m/z: 291,0 [M+Na]+ (CTPT CpHpNaCuSí, M = 268,29 đvC). ^H-NMR (500 MHz, D2O), 5 (ppm): 3,41-3,44 (2H, m, H-l); 3,23-3,26 (2H, m, H-2); 7,55 (2H, dd, Ji = 7,5 Hz, J2 = 8,5 Hz, H-3’, H-5’); 7,71-7,74 (1H, m5 H-4’); 7,98 (2H, dd, Jj= 1,5 Hz, J2 = 8,5 Hz, H -2\ H-6’). 13C-NMR (125 MHz, D20), 5 (ppm): 23,52 (C-2); 50,33 (C-l); 127,08 (C-3’, C-5’); 128,95 (C-2’, C- 6’); 134,28 (C-4’); 136,27 (C -l’); 195,03 (C = O). Hiệu suất cao nhất đạt 70,9 ± 0,45% từ 2,9 g chất 2 với các thông số: t°pư: 85 °C; Tỉ lệ acid thiobenzoic: chất 2 là 1,1 : 1,0; Lượng nưóc tham gia phản ứng 60 ml. Tổng hợp mesna từ thioester 5, sử dụng tác nhân NH3 hiệu suất 70,3%, t°„c = 263,0-267,5 °c, R/= 0,61 (hệ B). IR (KBr), ũmaxCcrn1): 2970 và 2937 (C-H no), 2571 (S-H), 1161 và 1047 (SO3-). ESI-MS (MeOH, negative), m/z: 140,9 [M-Na]' (CTPT C2H5Na03S2>M =164,17 đvC). XH-NMR (500 11 MHz, D2O), 6 (ppm): 2,87-2,90 (2H, m, H-2); 3,18-3,21 (2H, m, H-l). 13C- NMR (125 MHz, D20), 5 (ppm): 54,37 (0-1); 18,43 (C-2). Các thông số tối ưu cho phản ứng tổng hợp mesna từ 2,8 g thioester 5 íhiệu suất cao nhất 75,9 %): t°pư: 50 °C; Tỉ lệ mol NH3: thioester là 4 : 1; Thể tích nước là 19 ml. Hiệu suất tổng hợp mesna qua trung gian thioester tính từ chất 2 là 53,9± 2,25%, hàm lượng mesna 88,3 ± 1,46%. 3.1.4. Tong hợp mesna qua trung gian muối Bunte Tổng hợp natri £-(2-sulfonatoethyl)sulfurothioat (muối Bunte 6) từ 2, sử dụng natri thiosulfat pentahydrat, hiệu suất 78,8%, t°nc: 230,5-233,0 °c (phân hủy), R/ = 0,28 (hệ B). IR (KBr), -Umax (cm'1): 2987 và 2926 (C-H no); 1188, 1134 và 1039 (SO3-). ESI-MS (MeOH), m/z: 221,1 [M-2Na+H]‘ (CTPT C2H4Na2S3Oổ5 M = 266,22 đvC). ‘H-NMR (500 MHz, D20), 5 (ppm): 2§ (ppm): 2,81-2,89 (2H, m, H-2); 3,03-3,08 (2H, m, H-l). 13C- NMR (125 MHz, D20), 8 (ppm): s (ppm): 30,02 (C-2); 52,49 (C-l). Các thông số tối ưu cho phản ứng tổng hợp muối Bunte 6 từ 1,0 g chất 2 (hiệu suất cao nhất 82,1 ± 0,36%): Tỉ lệ mol chất 2 : Na2S2 0 3 .5 ĩỈ2 0 = 1 : 1,1; Tỉ lệ nước : ethanol = 6 : 7 ; t°pư: hồi lưu; Dung môi tinh chế: methanol : nưóc (50 : 1). C l N i i j S ^ ____g ^ - " ^ S O jN a NaOjS ^ ^ S O j N a natri 2-doroethansulfonat natri 5^2-mlfomtoe*hyl)*ulfuToibioat (2) » HjO/H* ,NaOH HS'-^ 'S 0 3H Mtsn» (9) pH ~ 6,6 2-merwptoethan5nlfo£iic (8) Tổng hợp mesna từ 6, sử dụng HCl thủy phân, dung dịch NaOH điều chỉnh pH 6,6, tinh chế bằng ethanol 96%, hiệu suất 32,4%, t°nc: 264,1 - 267,0 °c, R/= 0,61 (hệ B). IR (KBr), ũmax (cm4): 2972 và 2924 (C-H no); 2571 (S-H); 1130 và 1049 (SCV). ESI-MS (MeOH), m/z: 141,2 [M-Na]- (CTPT C2H5N a03S2, M = 164,17 đvC). ‘H-NMR (500 MHz, D20), 5 (ppm): 2,84-2,87 (2H, m, H-2); 3,15-3,18 (2H, m, H-l). 15C-INlMDR (125 MHz, DMSO-d6) 5 (ppm): 19,79 (C-2); 55,21 (C-l). Các thông số sau khảo 12 sát phản ứng tổng hợp mesna từ 1,0 g chất 6 (hiệu suất cao nhất 35,7%): 25ml dung môil,4-dioxan : nưóc (1,5 : 1), acid HC1 đặc thủy phân ở 70 °c. Hiệu suất tổng hợp mesna từ 2: 29,3± 0,88%, hàm lượng 88,1 ±0,47%. 3.1.5. Tồng hợp mesna qua ừung gian alkyl trithiocarbonat C1'—^SOjNa nsttri 2-elaroe*awulfonat <*) SOjNa Mesma 0) NijCS, pH 6,6 ỉa S.S>C^SX N ^ SQaJfa Moooalkyi tritìdocartKmât ỡ) HjO/H*- SO3H Rcid 2-mercaptí>etìiaimi]frrtiic (*) Tổng hợp natri 2-(dithiocarboxylatothio)ethansulfonat (7) từ 2, sử dụng dd natri trithiocarbonat 40%, hiệu suất 69,9% (tính theo 2), t°nc: 210,0 - 216.0 °c (phân hủy), R/= 0,45 (hệ B). IR (KBr), vmax (em'1): 2972 và 2927 (C-H no); 1130 (C = S); 1197 và 1053 (SO3-). ESI-MS (MeOH), m/z: 238,99 [M-Na]' (CTPT C3H4Na03S4, M = 262,30 đvC). ‘H-NMR (500 MHz, DMSO-đe), 5 (ppm): 3,16-3,20 (2H, m, H-l); 2,68-2,71 (2H, m, H- 2). 13C-NMR (125 MHz, DMSO-<&) s (ppm): 35,64 (C-2); 50,66 (C-l); 239,29 (C-3). Các thông số thu được sau khảo sát phản ứng tổng hợp 7 từ 2,0g chất 2 (hiệu suất cao nhất 70,6 ± 0,35%); tỉ lệ natri trithiocarbonat : chất 2 là 1,4 : 1; Thể tích nước dùng với 2,00 g chất 2 là 8 ml. Tổng hợp dinatri 2,2’-thiocarbonylbis(sulfanendiyl)diethansulfonat (7a) từ natri 2-cloroethansulfonat (2) và dd natri trithiocarbonat (tỉ lệ 16 : 1), hiệu suất 85,7% (tính theo natri trithiocarbonat). t°nc: 265,0-272,0 °c (phân hủy), R /= 0,34 (hệ B). IR (KBr), Vmax (em'1): 2974 và 2935 (C-H no); 1026 (C = S); 1195 và 1055 (SO3-) ESI-MS (MeOH), m/z: 393,10 [M+Na]+ (CTPT C5H8Na206S5, M = 370,42 đvC). ‘H-NMR (500 MHz, DMSO-ÍÍẠ ô (ppm): 2,68-2,71 (4H, m, H -l, H -l’); 2,62-2,66 (4H, m, H-2, H-2’). 13C- NMR (125 MHz, DMSO-40 ô (ppm): 26,60 (C-2); 51,62 (C-l). Tổng hợp mesna từ 7 sử dụng dd acid sulfuric 35% ở pH 1,4 tạo acid 2- mercaptoethansulfonic (8). Mesna được hình thành bằng dd NaOH 1,0 M ở pH 6,6. Hiệu suất 71,1% (tính theo monoalkyl trithiocarbonat), t°nc: 264,5- 267.0 °c. R/= 0,61 (hệ B). IR (KBr), ĩ)max (em'1): 2970 và 2937 (C-H no), 13 2569 (S-H), 1174 và 1047 (SO3-), ESI-MS (MeOH), m/z\ 140,782 [M-Na]-; (CTPT C2H5N a03S2, M = 164,17 đvC), ‘H-NMR (500 MHz, CD3OD), Ỗ (ppm): 2,83-2,86 (2H, m, H-2); 3,03-3,06 (2H, m, H-l). 15C-NMDR (125 MHz, CD3OD), Ỗ (ppm): 20,11 (C-2); 56,60 (C-l). Chúng tôi đã tiến hành tạo nhóm thiol từ dialkyl trithiocarbonat bằng cách thủy phân trong dd H2SO4 với các nồng độ khác nhau (25, 35, 45, 55 %) ở các pH khác nhau, amoniac phân, khử hóa bằng NaBELi và ethanolamin đều không thu được mesna. Từ đó có thể kết luận mesna được tổng hợp từ monoalkyl trithiocarbonat 7. Trong quá trình tổng hợp monoalkyl trithiocarbonat 7 luôn thấy xuất hiện vết tạp dimesna. Vì vậy, chúng tôi đã đề xuất qui trình tổng hợp mesna một giai đoạn íone-pot) từ 2 qua trung gian monoalkyl trithiocarbonat, hiệu suất 47,6% (tính theo 2), t°„c: 264,0-267,5 °c. R /= 0,61 (hệ B). IR (KBr), Vmax (em'1): 2970 và 29378 (C-H), 2571 (S-H), 1161 và 1047 (SO3-). ESI- MS (MeOH), m/z: 141,34 [M-Na]-; (C2H5Na03S2, M = 164.17 đvC). 1H- NMR (500 MHz, CD3OD), 5 (ppm): 2,74-2,77 (2H, m, H-2); 3,06-3,09 (2H, m, H-l). 13C-NMR (125 MHz, DMSO-dổ) s (ppm): 18,36 (C-2); 54,34(C-1). Các thông số tốt nhất cho qui trình one-pot: tỉ lệ mol chất 2: natri trithiocarbonat là 1:1,5; t°pư: 55 °C; Acid thủy phân: dd H2SO4 35%; pH thủy phân: 1,4. Hiệu suất tính từ 2 là 50,3 ± 0,26%, hàm lượng mesna đạt 91,0 ±0,40%. 3.1.6. So sánh các phương pháp tổng hợp mesna từ natri 2- cloroethansulfonat Từ các kết quả ở qui mô phòng thí nghiệm đã so sánh 4 phương pháp và tìm được 2 phương pháp thích hợp để nâng cấp qui mô tổng hợp mesna 100 g/mẻ qua trung gian muối thiouroni và monoalkyl trithiocarbonat. 3.1.7. Tinh chế mesna đạt tiêu chuẩn về hàm lượng theo BP 2015 Sau khảo sát, đã lựa chọn được ethanol 96% là dung môi tinh chế với qui trình như sau: trong bình cầu 50 ml, phân tán 1,00 g mesna vào 15 ml ethanol 96% ở 55 °c đã sục khí nitơ. Lọc nóng, sục khí nitơ, để kết tinh lạnh qua đêm, lọc lấy tinh thể (đối với mesna được tổng hợp theo con 14 đường I kết tinh lại 1 lần nữa trong ethanol 96%). sấy chân không ở nhiệt độ 40 °c trong 5 giờ. Hiệu suất tinh chế đối vói mesna được tổng hợp theo COĨ1 đường I là 77,0%, con đương IV là 88,0%. 3.2. Xây dựng qui trình tống họp và tinh chế mesna qui mô 200 g/mẻ Tổng hợp 3 mẻ nguyên liệu natri 2-cloroethansulfonat từ 251,0g natri Sulfit và 631 ml 1,2-dicloroethan (tốc độ khuấy 200 vòng/phút) đã thu được hiệu suất 81,8%, tăng nhẹ so vói qui mô 24,37 g natri Sulfit (80,6%). s<y đồ 3.2. Qui trình tống hợp mesna qua trung gian monoalkyl trithiocarbonat từ natri 2-cIoroethansulfonat qui mô 200g/mẻ 15 Tổng hợp mesna theo con đường I qui mô lOOg/mẻ: Thực hiện 3 mẻ phản ứng, mỗi mẻ 261 g chất 2, hiệu suất tổng hợp giảm nhẹ so với qui mô 24,48 g chất 2 (52,3 so vói 53,0%), hiệu suất tinh chế đạt 77,2%, hiệu suất toàn qui trình tính từ 2 là 40,3%. Sản phẩm đã được kiểm nghiệm tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương, được xác nhận đạt tất cả các chỉ tiêu chất lượng theo qui định của BP 2015. Tổng hợp mesna theo con đường IV qui mô lOOg/mẻ: Thực hiện 3 mẻ phản ứng, mỗi mẻ 268 g chất 2, hiệu suất tổng hợp tăng nhẹ so vói qui mô 20.0 g chất 2 (52,4% so với 50,3%), hiệu suất tinh chế đạt 86,6%, hiệu suất toàn qui trình tính từ 2 là 45,4% cao hơn so với con đương I (p-value =0,000). Sản phẩm đã được kiểm nghiệm tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương và được xác nhận đạt tất cả các chỉ tiêu chất lượng theo qui định của BP 2015. Từ kết quả nghiên cửu qui trình tổng hợp mesna qui mô 100 g/mẻ qua trung gian monoalkyl trithiocarbonat vói hiệu suất ổn định, chúng tôi tiến hành nâng cấp qui trình ở qui mô 200 g/mẻ nhằm đánh giá sự ổn định của qui trình tổng hợp mesna ở qui mô lớn hơn. Thực hiện 3 mẻ vói 550,00 g chất 2, hiệu suất toàn qui trình tính từ 2 là 45.0 ± 0,16%. Sản phẩm đã được kiểm nghiệm tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương và được xác nhận đạt tất cả các chỉ tiêu chất lượng theo qui định của BP 2016. 3.4. Đánh giá độ ốn định của nguyên liệu mesna Theo dõi độ ổn định của nguyên liệu mesna ở điều kiện lão hóa cấp tốc trong 6 tháng và điều kiện dài hạn trong ít nhất 12 tháng. Ket quả cho thấy nguyên liệu mesna ổn định sau thời gian theo dổi về các chỉ tiêu: hình thức, pH, hàm lượng và tỉ lệ tạp chất liên quan. 3.5. Đánh giá độc tính cấp của mesna Ket quả thử độc tính cho thấy mesna được tổng hợp theo con đường IV gần như không độc (không phân loại độc) theo đường uống, độc tính trung bình (phân loại 4) theo đường tiêm tĩnh mạch. 3.6. Xây dựng phương pháp định lượng mesna bằng HPLC Quy trình định lượng được thẩm định và đạt các chỉ tiêu về độ đặc hiệu (sắc ký đồ dung dịch thử xuất hiện pic sắc ký tương ứng với thời gian lưu 16 của pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn mesna ở thời gian 5,1 phút, sắc ký đồ dung dịch placebo không xuất hiện pic sắc ký tại thời gian lưu của pic chính mesna và tạp C). Tính tuyến tính: diện tích pic và nồng độ mesna trong khoảng 0,l-l,0mg/ml có sự tương quan tuyến tính, thể hiện ở phương trình đường chuẩn: y=1871,7x + 7,8046 với R2=0,9996. Độ chính xác: độ lặp lại cho RSD = 0,11% < 2% ÍN=6); độ chính xác trung gian được thực hiện ở 2 ngày khác nhau cho RSD - 0,16% < 2%. Độ đúng được thực hiện trên 3 mẫu bằng phương pháp thêm chuẩn tương ứng với các tỉ lệ 80%, 100%, 120% của công thức, tỉ lệ tìm lại dược chất 99,77-101,6%, độ lệch chuẩn tương đối đều nhỏ hơn 2%. Đánh giá tính tương thích của hệ thống sắc ký cho tR và diện tích pic của pic mesna đều bé hơn 2% (N=6), pic mesna và pic tạp chất c có độ phân giải 3,06. 3.7. Nghiên cứu bào chế dung dịch tiêm mesna lOOmg/ml Bảng 3.60. Công thức dung dịch tiêm mesna 100 mg/ml TT Thành phần Lưựng/Iọ 4 ml Lượng/mẻ 1000 ml 1 Mesna 400 100 R 2 Dinatri edetat 1 mg 250 mg 3 dd Natri hydroxid 1,0N pH 7,2-7,6 pH 7,2-7,6 4 Nưóc cất pha tiêm vừa đủ 4 mì 1000 ml 5 Khí nitơ Sục nưóc cất p đc la tiêm và trước khi >ng nắp Đe xuất tiêu chuẩn chất lượng và phương pháp thử của dd tiêm mesna: (1) Tính chất: dd trong suốt không màu đựng trong lọ thủy tinh không màu. (2) Độ trong: dd phải trong suốt và không có tiểu phân kiểm tra bằng mắt thường. (3) Giới hạn tiểu phân không nhìn thấy bằng mắt thường: phải đạt DĐVN IV. (4) Định tính: Chế phẩm phải thể hiện phép thử định tính của Mesna. (5) Thể tích: từ 4,0 - 4,6 ml thể tích ghi trên nhãn. (6) pH: 6,5- 8,0. í7) Nội độc tố vi khuẩn: không quá 0,20 IU/mg Mesna. (8) Độ vô khuẩn: Chế phẩm phải vô khuẩn. Thử theo DĐVN IV. (9) Tạp chất liên quan: Tạp D: Không quá 3,0%; Tạp chất C: Không quá 0,2%; Tạp chất A, B, E: Không quá 0,3%; Tạp chất không định danh: Không quá 0,1%; Tổng tạp đơn không định danh: Không quá 0,3%. (10) Định lượng: chế phẩm 17 phải chứa mesna (C2ĨỈ5Na0 3 S2) từ 90,0% đến 110,0% so với hàm lượng ghi trên nhãn. Bào chế dung dịch tiêm mesna 100 mg/ml từ nguyên liệu được tổng hợp theo con đường I và con đường IV, kiểm nghiệm tại Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ưang được xác nhận đều đạt các chỉ tiêu theo tiêu chuẩn cơ sở đã đề xuất. Theo dõi độ ổn định của nguyên liệu mesna ở điều kiện lão hóa cấp tốc và điều kiện dài hạn. Ket quả cho thấy dung dịch tiêm mesna ổn định sau thời gian theo dõi về các chỉ tiêu: hình thức, pH, hàm lượng mesna và tỉ lệ tạp chất liên quan. Chương 4. BÀN LUẬN 4.1. Phương pháp tổng hợp mesna 4.1.1. Phản ứng tong hợp natri 2-cloroethansulfonat Đe tổng hợp natri 2-cloroethansulfonat từ 1,2-đicloroethan, quá trình phản ứng kéo dài 22 giờ và yêu cầu sự có mặt của xúc tác. Ưu điểm khi sử dụng nguyên liệu 1,2-dicloroethan là quá trình thực hiện đơn giản, không yêu cầu phải nhỏ từ từ dd Na2SƠ3 như đối với 1,2-dibromoethan (nguyên liệu thường được sử dụng trong tổng hợp mesna) mà vẫn thu được chất 2 tinh khiết với hiệu suất tương đối cao (81%). Trong quá trình thực nghiệm, không phát hiện vết sản phẩm phụ disulíonat trên SKLM, cho thấy phản ứng thế hầu như chỉ xảy ra trên một nguyên tử clo. Phương pháp tinh chế được cải tiến nhờ kết tinh trong ethanol 96%, sản phẩm 2 tinh khiết hơn. 4.1.2. Phản ứng tổng hợp mesna qua trung gian muối thiouroni Phản ứng tổng hợp muối 2-JS'-thiouroni ethansulíonat dễ thực hiện, thời gian ngắn 9 giờ, hiệu suất đạt 75,1% từ nguyên liệu 2, cao hơn so với một số tài liệu đã công bố: 68% từ nguyên liệu natri 2-bromoethansulfonat, 52% từ kali 2-cloroethansulfonat. Việc sử dụng xúc tác KBr hoặc KI làm tăng khả năng phản ứng của tác nhân alkyl clorid 2 nhờ sự trao đổi giữa clo và brom (hoặc iod) có trong xúc tác. Một trong những khó khăn gặp phải là chất 4 rất dễ chảy lỏng do hút ẩm, đồng thời bị oxy hoá khi tiếp xúc với oxy không khí. Do vậy, sau khi lọc thu được tinh thể 4, cần đưa ngay vào bình hút ấm sạch hoặc tủ sấy 18 chân không được bão hòa khí nitơ. Sản phẩm 4 cũng có thể được sử dụng để thực hiện ngay phản ứng tiếp theo (tổng hợp mesna). Đe giảm tác động của nhiệt độ cất quay tới quá trình oxy hóa thiol, chúng tôi đã tiến hành cất loại phần lớn nước ở pH acid (3/4 thể tích). Đồng thời trong quá trình điều chỉnh pH về 6,6 cũng như quá trình cất quay, chúng tôi đảm bảo môi trường trơ bằng cách sục khí nitơ loại đi phần lón oxy trong không khí. 4.1.3. Phản ứng tổng hợp mesna qua trung gian thioester Phản ứng tổng hợp thioester xảy ra theo cơ chế Sjự2 sử dụng NaHCCb có tính base để hoạt hóa nhóm thiol, tăng tính ái nhân của nguyên tử lưu huỳnh trong phân tử acid thiobenzoic. Cải tiến về cách thức nạp niệu giúp tăng hiệu suất phản ứng lên 70,1% so với A. Reiner (64,5%). Một điểm mới nữa theo phương pháp này là nguyên liệu sử dụng 1,2-dicloroethan thay thế 1,2- dibromoethan có thể tiết kiệm được chi phí đầu vào. Đối với phản ứng tổng hợp mesna, tác nhân amoniac có tính kiềm yếu so với các tác nhân kiềm khác, có ưu điểm là tốc độ thủy phân lón hơn acid, phản ứng thường ít khi thuận nghịch, ít gây ăn mòn thiết bị. Hiệu suất cao nhất đề tài đạt được là 75,9%, trong khi tài liệu thu được 84,5% do rất nhiều nguyên nhân mà một trong số đó là ổn định nồng độ amoni. 4.1.4. Phản ứng tong họp mesna qua trung gian muối Bunte Tổng hợp mesna qua trung gian muối Bunte đến nay chưa có tác giả nào mô tả. Vói kết quả thu được, đây là một trong những đóng góp mới của luận án. Trong đề tài đã tổng hợp chất ố từ natri 2-cloroethansulfonat và natri thiosulfat theo cơ chế Sjv2, thường cho hiệu suất tốt trong dung môi phân cực phi proton (chẳng hạn dimethylíbrmamid hoặc dimethylsulíbxid). Tuy nhiên, trong tổng hợp này, chúng tôi đã sử dụng dung môi là hỗn hợp nước - ethanol mà vẫn cho hiệu suất phản ứng cao (82,1%). Quá trình phản ứng cần kiểm soát tốt tỉ lệ mol các chất tham gia phản ứng, nhiệt độ. Phản ứng thủy phân tổng hợp mesna: Bản chất của quá trình thủy phân phụ thuộc vào tỉ lệ acid và nước. Khi nồng độ acid thấp, liên kết S-S trong phân tử muối Bunte khó bị cắt đứt, phản ứng không xảy ra. Khi nồng độ 19 acid quá cao (dd H2SO4 >70 %) làm giảm lượng nưóc phản ứng dẫn tới quá trình thủy phân diễn ra không hoàn toàn. Điều này cũng được bàn luận trong nghiên cứu động học về acid phân muối Bunte của tác giả L.Kice (1962). Do vậy hiệu suất tổng hợp mesna theo phương pháp này thấp. 4.1.5. Phản ứng tống hợp mesna qua trung gian alkyl trithiocarbonat Các tài liệu nghiên cứu về thủy phân alkyl trithiocarbonat đã chỉ ra có thể thủy phân cả dẫn chất monoalkyl và dialkyl trithiocarbonat để tạo ra thiol (-SH). Điều này làm cơ sở cho chúng tôi tổng hợp dẫn chất monoalkyl trithiocarbonat 7 và dialkyl trithiocarbonat 7a. Hai chất này chưa được công bố trong các TLTK. Đe kiểm soát việc hình thành chất 7 hay 7a, điều chỉnh tỉ lệ mol natri trithiocarbonat so vói chất 2. Tổng hợp mesna từ 7 là quá trình thủy phân monoalkyl trithiocarbonat trong môi trường H+ tạo ra aciđ 8, sau đó là quá trình điều chỉnh pH tạo natri 2~mercaptoethansulfonat. Theo một số TLTK, phản ứng có thể xảy ra theo cơ chế thủy phân. Tuy nhiên khi thực hiện phản ứng tổng hợp trung gian vói định hưóng tạo ra dạng dialkỵl trithiocarbonat nhưng không thu được mesna. Cơ chế được đề xuất bởi c. c. Greco và D. J. Martin như sau: s <3 n h3o+ 8 N a \ s ^ C ^ s / \ ^ S 0 3N a -- ^ ơ) (7c) - ....«S-H» HGSL so3h cs2 (8) S(y đồ 4.16. Co' chế thủy phân monoalkyl trithiocarbonat thành mesna Đe tài cũng tiến hành nghiên cứu sử dụng các tác nhân H2SO4 NH3, NaBEU, ethanolamin để thủy phân hoặc khử hóa 7a nhưng đều không thu được mesna. Như vậy, các kết quả thực nghiệm đã khẳng định trong điều kiện pH 1,4 ở 55 °c mesna được tạo thành từ dẫn chất monoalkyl 7 mà không phải từ dialkyl 7a. Việc loại bót natri trithiocarbonat (bằng cách chiết nhanh với isopropanol hoặc ethanol) trước khi tiến hành thủy phân có nhiều ưu điểm: (0 Hạn chế sinh ra khí H2S và CS2 có mùi khó chịu do Na2CS3 bị phân hủy. 20 Lúc này, phản ứng chỉ tạo ra lượng CS2 trong quá trình thủy phân chất 7 tạo mesna; (ii) giảm lượng acid H2SO4 35% sử dụng; (Ui) giảm lượng nước trong hỗn hợp sau phản ứng, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình cất quay sau đó; (iv) có thể tái sử dụng natri trithiocarbonat khi tiến hành với qui mô lón. Tóm lại, so vói các phương pháp đã công bố, phương pháp mới qua trung gian monoalkyl trithiocarbonat có những ưu điểm như: (?) qui trình đơn giản vói 3 bước, (ii) điều kiện phản ứng dễ kiểm soát: nhiệt độ thấp (40-60 °C), (Ui) thời gian ngắn khoảng 4 ngày với qui mô phòng thí nghiệm, (iv) hiệu suất toàn quá trình đạt 44,3%, cao hơn so với phương pháp tổng hợp mesna qua trung gian guanidini 2-mercaptoethansulf