Tóm tắt Luận án Nghiên cứu mức độ nhiễm Aflatoxin và đề xuất một số giải pháp công nghệ bảo quản lạc sau thu hoạch ở các tỉnh miền Trung và Bắc Việt Nam

độ môi trường dưới 35 oC (Enjie Diao và cs., 2015), các chủng Aspergillus phát triển cao ở 30 oC và 35 oC trên môi trường kết hợp với hạt kê (K. Shehu và M.T. Bello, 2011), chuyên khảo của Urban Diener và Norman D. Davis (1997) cho thấy A. flavus phát triển tối ưu ở 30 oC, sau đó đến 25oC, 20 oC và bị ức chế ở 45 oC, A. flavus trên môi trường cuống ngô phát triển tối ưu ở 20-25 oC còn trên môi trường CZA phát triển tối ưu ở 30-35 oC (Paola Giomi và cs., 2008). Qua các kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ cho thấy A. flavus phát triển và sinh AF ở nhiệt độ < 45 oC, ở nhiệt độ từ 45 oC có thể ức chế sự phát triển và sinh AF của A. flavus. Các chủng này có thể phát triển tối ưu ở khoảng nhiệt độ 20-35 oC tùy theo môi trường cơ chất. Luận án nghiên cứu tìm ra nhiệt độ tối ưu để A. flavus sinh AF trên cơ chất là lạc để phòng tránh nhiễm AF trong bảo quản. Giống Aspergillus có khoảng 180 loài. Chi Flavi được chia thành hai nhóm loài, một nhóm gồm các loài sinh AF như A. flavus, A. parasiticus và A. nomius; một nhóm khác gồm các loài không có gen sinh độc tố AF như A. oryzae, A. sojae và A. tamarii dùng trong sản xuất các sản phẩm thực phẩm lên men ở các nước châu Á. Các loài A. parasiticus và A. nomius sinh cả AFB và AFG nhưng không phát hiện Cyclopiazonic acid; A. flavus phát hiện sinh AFB1, AFB2 và Cyclopiazonic acid (P. Rodrigues và cs., 2007). Nấm sinh AF trên lạc chủ yếu là A. flavus, tuy nhiên mức độ nhiễm AF còn tùy thuộc vào chủng đã nhiễm trên lạc. Luận án thực hiện nghiên cứu ảnh hưởng của mức nhiễm A. flavus đến khả năng sinh AF. Các nghiên cứu trước đây cho thấy điều kiện bảo quản ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh AF trong lạc như: Độ ẩm của lạc 6 dưới 12 % giúp ngăn ngừa nhiễm A. flavus và sinh AF trong lạc; Bảo quản ở nhiệt độ thấp cũng là phương pháp hiệu quả (Nguyễn Văn Thắng và cs., 2010). Các loại bao bì khác nhau ở các điều kiện môi trường khác nhau cho kết quả thời gian lạc duy trì được chất lượng khác nhau (Nguyễn Văn Thắng và cs., 2010; Mutegi C.K. và cs., 2013). Điều biến khí quyển trong môi trường đóng gói là biện pháp giảm lượng ôxy trong môi trường không khí, từ đó giảm quá trình ôxy hóa chất béo có trong lạc và giảm khả năng hô hấp của nấm mốc để hạn chế quá trình phát triển và sinh độc tố. Nghiên cứu nông sản đóng gói kín với 3 % ôxy và nồng độ khí CO2 từ 90 % trở lên ngăn được nhiễm côn trùng và AF (Philippe Villers, 2017). Đóng gói hút chân không với áp suất chân không 200 mmHg và nồng độ ôxy thấp cũng có tác dụng diệt côn trùng (George N. Mbata và cs., 2001), hạn chế nguy cơ côn trùng gây hại là tác nhân ảnh hưởng đến chất lượng bảo quản. Bao bì PE và PVC là các vật liệu thông dụng trong đóng gói hút chân không (Leon G. M. Và cs., 2007). Luận án thực hiện nghiên cứu các điều kiện đóng gói hút chân không: 50, 100, 150, 200 và 250 mmHg với bao bì PVC trong bảo quản lạc nhân. Ngoài ra, các hóa chất như hydrogen peroxide, methanol, dimethylamine hydrochloride, perchloric acid (Philippe Villers, 2017), hoặc calcium hydroxide và khí amoniac (Nguyễn Văn Thắng và cs., 2010) cũng giảm đáng kể hàm lượng AF trong ngũ cốc và thức ăn chăn nuôi, tuy nhiên theo báo cáo của FAO, cho đến nay các hóa chất hoặc chất phụ gia trên không được chấp nhận trong thực phẩm. Trong số nhiều giải pháp bảo quản thực phẩm thì giải pháp ức chế sự phát triển của vi sinh vật được ứng dụng nhiều nhất. Trong tự nhiên tinh dầu đóng vai trò quan trọng trong bảo vệ thực vật. Tinh dầu có chứa các hoạt chất có thể ức chế, làm chậm sự phát triển của vi khuẩn, nấm men và nấm mốc. Các hoạt chất của tinh dầu tác dụng đến màng tế bào, nguyên sinh chất và thậm chí làm biến dạng hình thái tế bào (Filomena Nazzaro và cs., 2013). Cộng đồng châu Âu chấp nhận những chất tạo hương có nguồn gốc từ tinh dầu tự nhiên được xem như không có tác hại đến sức khỏe người tiêu dùng. Cục Dược và thực phẩm (FDA) của Hoa Kỳ phân loại là những chất này là an toàn (generally recognized as safe - GRAS). 7 Tinh dầu xạ hương có khả năng chống mốc hiệu quả trên hạt lúa mạch (Sabina Anžlovar và cs., 2016). Tinh dầu quế, bạc hà, sả, gừng và tinh dầu chanh có khả năng ức chế sự phát triển của một số vi khuẩn gây bệnh (Lê Thanh Mai và cs., 2014; Trịnh Thị Thanh Nga và cs., 2015; Trịnh Thị Thanh Nga và cs., 2013). Tinh dầu quế có nguồn gốc Thái Lan có thể ức chế tối đa sự phát triển của A. flavus IMI 242684 trên môi trường PDA ở nồng độ 50 %(v/v) (Dusanee Thanaboripat và cs., 2007), tinh dầu quế (nguồn: Sigma Aldrich, USA) ức chế sự phát triển của sợi nấm A. parasiticus (phân lập từ lạc tại Georgia - USA) trên môi trường PDA ở nồng độ 0,1 % (Mina M. Yooussef và cs., 2016). Nghiên cứu khả năng ức chế sự phát triển của nấm sinh độc tố A. flavus và A. parasiticus quy mô phòng thí nhiệm cho thấy tinh dầu hồi có thể ức chế sự phát triển và sinh độc tố của hai loài nấm mốc này hoàn toàn ở nồng độ 0,02 % (Soher E. Aly và cs., 2014). Quế và hồi là cây nhiệt đới được trồng rộng rãi tại các vùng núi của Việt Nam, quế và hồi cũng được dùng làm gia vị trong chế biến nhiều loại thực phẩm. Lạc rang húng lìu là sản phẩm truyền thống sử dụng gia vị có nguồn gốc từ quế và hồi để tạo hương vị đặc trưng. Luận án thực hiện nghiên cứu khả năng ức chế của tinh dầu hồi và quế đến sự phát triển và sinh độc tố của A. flavus trên lạc. Mặc dù với nỗ lực của các nhà nông học để giảm thiểu nguy cơ sinh AF trong quá trình trước thu hoạch nhưng các sản phẩm sau thu hoạch vẫn có nguy cơ nhiễm AF, do đó việc nghiên cứu các giải pháp bảo quản lạc sau thu hoạch nhằm giảm nguy cơ nhiễm AF trong lạc là cần thiết. Vì vậy, Nghiên cứu mức độ nhiễm AF và đề xuất một số giải pháp công nghệ bảo quản lạc sau thu hoạch ở các tỉnh miền Trung và Bắc Việt Nam” là hết sức có ý nghĩa. CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Nguyên vật liệu - Lạc nhân và lạc củ giống L14, giống đang được trồng phổ biến tại các tỉnh miền Bắc và miền Trung; và lạc rang húng lìu được thu thập vào năm 2013. 8 - Chủng chuẩn đối chứng: A. flavus ATCC 204304 được cung cấp từ thư viện chủng quốc gia Mỹ. - Tinh dầu hồi/ quế được mua của Công ty TNHH chế biến và xuất khẩu nông lâm sản Lạng Sơn. 2.1.2. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ thí nghiệm - Hóa chất tinh khiết phân tích được sử dụng cho nghiên cứu. - Thiết bị đáp ứng độ nhạy và đảm bảo yêu cầu phục vụ phân tích để đánh giá kết quả: hàm lượng AF, mức nhiễm nấm men-mốc, phân lập nấm sinh độc tố AF. - Các dụng cụ và thiết bị thông thường của phòng thí nghiệm. 2.2 Phương pháp lấy mẫu - Cỡ mẫu tính theo công thức trong nghiên cứu mô tả: 30 mẫu/lần lấy mẫu/loại lạc. - Trong nghiên cứu mức độ nhiễm nấm men-mốc và AF: lạc củ lấy 3 kg/mẫu, lạc nhân lấy 1 kg/mẫu; lạc rang húng lìu lấy nguyên túi, lượng tối thiểu 500 g/mẫu, trường hợp đóng túi nhỏ hơn thì lấy nhiều hơn 1 túi. - Trong nghiên cứu ảnh hưởng của bao bì đối với sự thay đổi độ ẩm của lạc, nghiên cứu khảo nghiệm giải pháp bảo quản lạc, lượng mẫu lấy tối thiểu là 25 kg và tổng lượng mẫu đảm bảo đủ cho từng thiết kế thí nghiệm. 2.3 Phương pháp phân tích hóa lý - Xác định độ ẩm: phương pháp sấy đến khối lượng không đổi theo TCVN 2384-1993. - Xác định hàm lượng AF trong lạc bằng sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) theo phương pháp đã được chuẩn hóa tại Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia. Sắc đồ chuẩn và đường nền của các aflatoxin như các hình 2.3, 2.4, 2.5 và 2.6 dưới đây. 9 Hình 2.3. Sắc đồ đường nền và chuẩn AFB1 Hình 2.4. Sắc đồ đường nền và chuẩn AFB2 Hình 2.5. Sắc đồ đường nền và chuẩn AFG1 Hình 2.6. Sắc đồ đường nền và chuẩn AFG2 - Đánh giá về mặt ngoại quan. Tình trạng mẫu khi lấy được ghi chép lại và theo dõi đến khi có kết quả kiểm nghiệm (nguyên hạt/ hạt vỡ, dóc vỏ lụa/ không dóc vỏ lụa, hạt mẩy/ hạt nhăn/ hạt lép, màu khác thường - không hồng, không đỏ, có vết màu khác so với những hạt bình thường: đen, vàng, ...) theo TCVN 2843:2008. 2.4 Phương pháp vi sinh, hóa sinh và sinh học phân tử - Xác định tổng số bào tử nấm men-mốc bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc theo TCVN 8275-2:2010 (ISO 21527-2:2008). 10 - Phân lập và xác định chủng A. flavus sinh AF từ lạc: phân lập nấm mốc có hình thái tương đồng với A. flavus trên lạc và làm thuần → tách chiết và làm sạch DNA → khuếch đại bằng phản ứng PCR → Giải trình tự gen và so sánh sự tương đồng với các chủng trên ngân hàng gen thế giới → Khẳng định khả năng sinh độc tố AF của các chủng tương đồng. 2.5 Đánh giá mức độ nhiễm nấm men-mốc và aflatoxin trong lạc 2.5.1. Đánh giá trên lạc nhân, lạc củ và lạc rang húng lìu thu thập vào mùa hè 2.5.2. Đánh giá mức nhiễm AF và nấm mốc trên lạc thu thập vào mùa thu tại tỉnh đã lựa chọn 2.6 Phương pháp công nghệ 2.6.1. Điều chỉnh độ ẩm của lạc thí nghiệm Điều chỉnh độ ẩm của lạc nhân: thêm nước cất trên bề mặt trong túi vô trùng, trộn túi rồi làm lạnh đến 4 oC trong 48 h. 2.6.2. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh AF trên lạc của A. flavus BG1. Các yếu tố đã nghiên cứu: độ ẩm, nhiệt độ, mức nhiễm A. flavus BG1, điều kiện hút chân không, ảnh hưởng tinh dầu hồi (quế). 2.6.3. Khảo nghiệm và đề xuất giải pháp bảo quản lạc - Bảo quản lạc nhân bằng kiểm soát chất lượng trước bảo quản: kiểm soát độ ẩm, nấm mốc, loại hạt không đạt yêu cầu, kiểm tra loại hạt nhiễm AF; đóng bao; bảo quản. - Bảo quản lạc nhân bằng đóng gói hút chân không: từ kết quả nghiên cứu 2.6.2.4 xác định được điều kiện hút chân không giảm nhiễm AF, chọn điều kiện này để khảo nghiệm bảo quản bằng đóng gói hút chân không. - Bảo quản lạc nhân bằng sử dụng tinh dầu: Lạc nhân, tinh dầu thấm vào giấy lọc, đặt giấy lọc vào giữa bao, đổ lạc nhân sang hai bên, đóng bao, bảo quản. 11 2.7 Xử lý số liệu - So sánh sự khác biệt giữa độ ẩm lạc thu thập tại hộ gia đình và hộ kinh doanh ta sử dụng hàm t-test, so sánh độ ẩm với tình trạng cảm quan của mẫu lạc tại thời điểm lấy mẫu. - So sánh sự khác biệt giữa các tỉ lệ nhiễm nấm mốc và AF trong lạc tại các tỉnh khác nhau ta sử dụng hàm prop.test phân tích trong phần mềm R, kiểm định 2 để biết trên phương diện thống kê các tỉ lệ này có khác nhau không; - Phân tích mối liên quan giữa tình trạng mẫu và mức nhiễm AF trong lạc thông qua phân tích tỉ số nguy cơ - RR. - Xử lý số liệu: Phân tích bằng phần mềm R 3.4.1. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Đánh giá mức độ nhiễm nấm men-mốc và AF trên lạc tại Nghệ An, Thanh Hóa và Bắc Giang 3.1.1. Đánh giá trên lạc nhân, lạc củ và lạc rang húng lìu thu thập vào mùa hè - Mức nhiễm nấm men-mốc và AF trong lạc nhân thu thập tại Nghệ An, Thanh Hóa và Bắc Giang có kết quả tương ứng: + Tổng số bào tử nấm men-mốc phát hiện trong lạc nhân trong khoảng 1,0×102 đến 1,1×105 CFU/g, với tỉ lệ mẫu phát hiện nhiễm nấm men-mốc tại các tỉnh này lần lượt là: 46,7; 53,3 và 60,0 %. Trong đó, vượt ngưỡng (102 CFU/g) chiếm tỉ lệ: 30; 30 và 40 %. Kiểm định 2 cho biết trên phương diện thống kê tỉ lệ nhiễm nấm men-mốc giữa các tỉnh không khác nhau, vì p=0,5853. + Mức nhiễm AF trong lạc nhân trong khoảng 0,34 đến 10.498 µg/kg, với tỉ lệ mẫu nhiễm AF tương ứng là: 40,0; 30,3 và 53,3 %. Trong đó, vượt ngưỡng (8 µg/kg) chiếm tỉ lệ 16,7; 10,0 và 16,7 %. Kiểm định 2 cho biết trên phương diện thống kê tỉ lệ nhiễm AF giữa các tỉnh không khác nhau, vì p=0,183. 12 - Mức nhiễm nấm men-mốc và AF trong lạc củ thu thập tại Nghệ An, Thanh Hóa và Bắc Giang có kết quả như sau: + Tổng số bào tử nấm men-mốc phát hiện trong lạc củ trong khoảng 1,3×101 đến 7,5×108 CFU/g, với tỉ lệ số mẫu phát hiện tại các tỉnh này lần lượt là: 53,3; 43,3 và 56,7 %. Trong đó, vượt ngưỡng (102CFU/g) chiếm tỉ lệ: 33,3; 30 và 36,7 %. Kiểm định 2 cho biết trên phương diện thống kê tỉ lệ nhiễm nấm men-mốc giữa các tỉnh không khác nhau, vì p=0,561. + Mức nhiễm AF trong lạc củ trong khoảng 0,64 đến 215 µg/kg, với tỉ lệ số mẫu nhiễm AF tương ứng là: 30,0; 26,7 và 40,0 %. Trong đó, vượt ngưỡng (8 µg/kg) chiếm tỉ lệ 10,0; 10,0 và 13,3 %. Kiểm định 2 cho biết trên phương diện thống kê tỉ lệ nhiễm AF giữa các tỉnh không khác nhau, vì p=0,516. - Mức nhiễm nấm men-mốc và AF trong lạc rang húng lìu thu thập tại Nghệ An, Thanh Hóa và Bắc Giang có kết quả như sau: + Tỉ lệ số mẫu phát hiện nhiễm tổng số bào tử nấm men-mốc tại các tỉnh này lần lượt là: 30,0; 23,3 và 36,7 % với mức nhiêm trong khoảng 1,1×101 - 1,0×103 CFU/g. Trong đó, tỉ lệ số mẫu vượt ngưỡng cho phép (102 CFU/g) tương ứng là 10,0; 13,3 và 13,3 %. Kiểm định 2 cho biết trên phương diện thống kê tỉ lệ nhiễm nấm men-mốc giữa các tỉnh không khác nhau, vì p=0,53. + Tỉ lệ số mẫu lạc rang húng lìu nhiễm AF tại các tỉnh trên tương ứng là: 6,67; 3,33 và 13,3 % với mức nhiễm AF trong trong khoảng 0,65 ÷ 2,3 µg/kg. Không có mẫu lạc rang húng lìu nào vượt ngưỡng cho phép (4µg/kg). Kiểm định 2 cho biết trên phương diện thống kê tỉ lệ nhiễm AF giữa các tỉnh không khác nhau, vì p=0,338. Kết quả nhiễm nấm men - mốc trong lạc tại 3 tỉnh, hình 3.1. 13 Hình 3. 1. Tỉ lệ nhiễm nấm men-mốc trong lạc thu thập tại Nghệ An, Thanh Hóa và Bắc Giang Kết quả nhiễm AF trong lạc tại 3 tỉnh, hình 3.2. Hình 3. 2. Tỉ lệ nhiễm AF trong lạc thu thập tại Nghệ An, Thanh Hóa và Bắc Giang Như vậy, tỉ lệ nhiễm nấm men-mốc và AF trong các mẫu lạc nhân thu thập trong các tỉnh đều cao nhất, sau đó đến lạc củ và thấp nhất trong lạc rang húng lìu. Tỉ lệ mẫu nhiễm nấm men-mốc và AF vượt ngưỡng cho phép cũng cao nhất trong lạc nhân, sau đến lạc củ, thấp nhất là lạc rang húng lìu. Lạc rang húng lìu không có mẫu nào nhiễm AF vượt ngưỡng cho phép. 14 3.1.2 Đánh giá mức độ nhiễm nấm mốc và AF thu thập trên địa bàn huyện Lục Nam, tỉnh Bắc Giang vào mùa thu Kết quả khảo sát thực trạng bảo quản lạc, phân tích nấm mốc và AF trong 30 mẫu lạc nhân và 30 mẫu lạc củ thu thập tại các hộ gia đình và hộ kinh doanh lạc cho thấy: - Đa số các hộ dân dùng bao tải hai lớp để bảo quản lạc (46,7 % dùng cho lạc nhân và 73,3 % dùng cho lạc củ), sau đó đến bao tải một lớp (33,3 % dùng cho lạc nhân và 26,7 % dùng cho lạc củ), ngoài ra lạc nhân còn được chứa đựng trong bao nilon, chậu, rổ tre và đổ dưới sàn nhà. - Độ ẩm của các mẫu lạc nhân và lạc củ thu thập được tương ứng là: 5,1-12,8 % và 5,94-10,19 %. Các mẫu lạc nhân và lạc củ phát hiện AF có độ ẩm từ 9,2 % và 8,70 % trở lên. Các mẫu có thể dóc vỏ lụa có độ ẩm từ 5,1-7,2 %. - Tỉ lệ số mẫu nhiễm tổng số bào tử nấm men-mốc trong lạc nhân và lạc củ tương ứng là 50 % và 26,7 %, mức nhiễm trong khoảng 1,0×101-7,0×103 CFU/g và 1,0×101-3,0×102 CFU/g. - Tỉ lệ số mẫu nhiễm AF trong lạc nhân và lạc củ tương ứng là 46,7 % và 26,7 %, mức nhiễm trong khoảng 0,66-115 µg/kg và 0,46- 2,5 µg/kg. Không phát hiện AF trong các mẫu lạc nhân có tình trạng: nguyên hạt, hạt mẩy, hạt dóc vỏ lụa và lạc củ có tình trạng: sạch, không có hạt mốc. Như vậy, các mẫu lạc nhân và lạc củ thu thập vào mùa thu và tại các hộ gia đình có mức nhiễm nấm mốc và AF thấp hơn các mẫu thu thập mùa hè và ngoài chợ trên cùng địa bàn. Nguyên nhân có thể do thời tiết mùa hè nóng ẩm thuận lợi cho nấm mốc phát triển, đồng thời lạc bảo quản tại hộ gia đình tốt hơn lạc bày bán bên ngoài. Lạc đưa vào bảo quản cần kiểm soát và loại bỏ các hạt mốc, nhăn, lép, màu khác thường và loại tạp. 3.1.3 Phân lập và xác định chủng sinh AF trên lạc Các mẫu lạc phát hiện nhiễm AF trong nghiên cứu 3.1.2 được dùng để phân lập nấm sinh độc tố. Các khuẩn lạc có đặc điểm về màu sắc tương đồng với chủng chuẩn A. flavus ATCC 204304 nuôi cấy trong 3 ngày trên môi trường SDA ở 25oC → chọn lấy khuẩn lạc, 15 chấm điểm để làm thuần → làm tiêu bản nhuộm Lactophenol Amann, soi tiêu bản dưới kính hiển vi quang học có các đặc điểm tương đồng với chủng đối chứng A. flavus ATCC 204304 → Chụp ảnh hiển vi điện tử quét, bào tử đính của chủng nấm nghi ngờ là A. flavus, chọn được 11 chủng có bào tử đính điển hình của A. flavus được lựa chọn để tách chiết và làm sạch DNA → khẳng định DNA thu được sạch, không lẫn protein và RNA → Các mẫu DNA tổng số dùng làm sợi khuôn cho phản ứng PCR đặc hiệu với cặp mồi ITS1 và ITS2→ điện di để kiểm tra kết quả phản ứng. Kết quả điện di cho thấy các mẫu băng lên rõ ràng, không có băng phụ, kích thước đoạn ITS 600 bp phù hợp với đặc tính của A. flavus và thích hợp để giải trình tự → chọn sản phẩm PCR từ 5 chủng để giải trình tự. Dựa vào mức độ tương đồng giữa chủng phân tích và chủng đã công bố trên ngân hàng gen quốc tế NCBI để định danh và dùng phần mềm BLAST để so sánh độ tương đồng. Kết quả tìm kiếm sự tương đồng của chủng phân lập với chủng trên ngân hàng gen (bảng 3.10). Trong 5 chủng được giải trình tự gen có 4 chủng định danh được là A. flavus còn 1 chủng có trình tự gen không tương thích với ngân hàng gen. Bảng 3.10. Kết quả tìm kiếm trên ngân hàng gen quốc tế Mẫu nấm Chủng, trình tự trên ngân hàng gen quốc tế Đoạn ADN so sánh Loài xác định Phần trăm đoạn so sánh (%) Mức đồng nhất trình tự (%) A1 TUHT115 ITS1, ITS2 A. flavus 100 100 A12 KP214054.1 ITS1, ITS2 A. flavus 100 100 A15 MTCC 8654 ITS1, ITS2 A. flavus 100 100 A16 ZJ4-A ITS1, ITS2 A. flavus 99 100 A28 Không có trình tự tương đồng ITS1, ITS2 Không định được loài Các chủng A1, A12 và A15 được chọn để đánh giá khả năng sinh AF bằng cách nhiễm vào lạc nhân đã tiệt trùng trong 10 ngày với mức nhiễm 107 CFU/g, sau đó phân tích hàm lượng AF bằng LC- MS/MS, kết quả cho thấy chủng A1 sinh AF cao nhất (1.335,2µg/kg) sau đến A12 (998,7µg/kg) và thấp nhất là A15 (785,8µg/kg). Các chủng phân lập được chỉ phát hiện sinh AFB1 và AFB2. Chủng A1 phân lập được trong nghiên cứu này được đặt tên là A. flavus BG1 và được dùng cho nghiên cứu tiếp theo. 16 3.2 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh AF trên lạc của A. flavus BG1. 3.2.1 Sự thay đổi độ ẩm của của các mẫu lạc trong các loại bao bì khác nhau Các mẫu lạc nhân và lạc củ được đóng bao trong các loại bao bì: PE, bao đay, bao tải hai lớp, bao PVC trong 4 tháng. Kết quả cho thấy: - Độ ẩm của lạc nhân sau 4 tháng thay đổi nhiều, chênh độ ẩm của mẫu lạc đựng trong bao đay và bao PE tương ứng là 19,0 và 8,8 %, chênh lệch độ ẩm với bao tải hai lớp và bao PVC đều là 4,0 %. - Độ ẩm của lạc củ sau 4 tháng thay đổi nhiều, lạc đựng trong bao đay và bao PE chênh độ ẩm tương ứng là 20,4 và 9,8 %, với bao tải hai lớp và bao PVC thì chênh lệch độ ẩm tương ứng là 2,9 và 2,2 %. Qua kết quả trên ta thấy, lạc khô bảo quản trong bao bì kín độ ẩm thay đổi không đáng kể. Sự thay đổi độ ẩm của lạc trong bao PVC là thấp nhất. PVC được sử dụng làm bao bì trong các nghiên cứu tiếp theo. 3.2.2 Ảnh hưởng của độ ẩm Các mẫu được theo dõi quan sát màu sắc trên lạc và soi UV hàng tuần trong 4 tuần. Kết quả cho thấy A. flavus BG1 phát triển tốt trên lạc nhân có độ ẩm từ 10 % trở lên. Các mẫu đối chứng và mẫu có độ ẩm 6 và 8% không phát hiện nhiễm AF sau 16 tuần nghiên cứu. Các mẫu có độ ẩm 10; 12 và 14% phát hiện sinh AFB1 sau 2 tuần và vượt ngưỡng cho phép sau 4 tuần, AFB2 sinh ra sau 4 tuần. Các mẫu nghiên cứu chỉ phát hiện nhiễm AFB1 và AFB2, không phát hiện nhiễm AFG1 và AFG2. Phân tích hồi quy tuyến tính bằng chương trình R 3.4.1. Trong đó hàm lượng AFB1 (Y1) và AF tổng số (Y) có quan hệ tuyến tính với độ ẩm (x1) theo thời gian - tuần (x2) như phương trình 13 và 14. Y1 = -78,19 + 7,56 x1 + 2,0 x2 (13) Phương trình trình (13) có nghĩa là độ ẩm tăng lên 1 % thì hàm lượng AFB1 tăng lên 7,56 g/kg; thời gian tăng lên thêm 1 tuần thì hàm lượng AFB1 tăng 2,0 g/kg. 17 Y = -76,91 + 7,24 x1 + 2,6 x2 (14) Phương trình trình (14) có nghĩa là độ ẩm tăng lên 1 % thì hàm lượng AF tổng số tăng lên 7,24 g/kg; thời gian tăng lên thêm 1 tuần thì hàm lượng AFB1 tăng 2,6 g/kg. Như vậy ở nhiệt độ 25 oC, độ ẩm từ 10 % là điều kiện thuận lợi nhất cho sự phát triển và sinh độc tố AF của A. flavus, độ ẩm càng cao thì mức nhiễm AF càng cao và tăng lên theo thời gian. 3.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường cho thấy A. flavus BG1 phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 25 oC, sau đó đến 30 oC, phát triển chậm ở 20 oC và 35 oC, và bị ức chế ở 40 oC. Hàm lượng AF sinh ra nhiều nhất ở nhiệt độ 25 oC, sau đến 30 oC, phát triển chậm và sinh AF thấp ở 20 oC và 35 oC, bị ức chế phát triển và sinh AF ở nhiệt độ 40 oC. Qua kết quả nghiên cứu và tổng quan tài liệu cho thấy lạc nên bảo quản ở nhiệt độ thấp hơn 25 oC để hạn chế sự phát triển và sinh AF của nấm mốc. 3.2.4 Ảnh hưởng của mức nhiễm A. flavus BG1 Nghiên cứu A. flavus BG1 ở các mức nhiễm khác nhau trên lạc nhiễm A. flavus BG1 càng nhiều thì hàm lượng AF sinh ra càng lớn. Kết quả phân tích mối quan hệ giữa mức nhiễm A. flavus và sự sinh AF có ý nghĩa thống kê (p< 0,05). Ta có phương trình hồi quy tuyến tính quan hệ giữa mức nhiễm AFB1 (Y1) theo mức nhiễm A. flavus BG1 (x3) và thời gian như sau: Y1 = 0,93 + 5,99×10-6 x3 + 2,0 x2 (15) Phương trình trình (15) có nghĩa là với độ ẩm từ 10 % trở lên, mức nhiễm A. flavus BG1 tăng lên 1 CFU thì hàm lượng AFB1 tăng lên 5,99×10-6 g/kg; thời gian tăng lên thêm 1 tuần thì hàm lượng AFB1 tăng 2,0 g/kg. 3.2.5 Ảnh hưởng của điều kiện hút chân không Các mẫu đóng gói hút chân không ở điều kiện 50, 100, 150 và 200mmHg quan sát thấy có A. flavus BG1 phát triển sau 2 tuần. Còn các mẫu đóng gói hút chân không ở điều kiện 250mmHg không quan 18 sát thấy nấm phát triển sau 16 tuần. Các mẫu được đóng gói với điều kiện hút chân không 50mmHg có mức nhiễm AFB1 cao nhất, sau đó đến 100mmHg, 150mmHg và thấp nhất là 200mmHg. Các mẫu đóng gói với điều kiện hút chân không 250mmHg không phát hiện AF sau 16 tuần. Như vậy, lạc nhân đóng gói với áp lực hút chân không 200 mmHg có thể hạn chế sự phát triển và sinh AF của A. flavus trên lạc. Với áp lực hút chân không 250 mmHg có thể ức chế sự phát triển và sinh AF của A. flavus BG1 trên lạc. 3.2.6 Phân tích mối quan hệ của các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh AF trên lạc của A. flavus BG1 Qua kết quả quan sát và thực nghiệm cho thấy: A. flavus BG1 phát triển đến khi bào tử có màu xanh mới phát hiện AF, mẫu nhiễm AF có phát ánh sáng xanh dưới đèn UV 365 nm. Mối tương quan giữa các yếu tố ảnh hưởng: thời gian (Week), độ ẩm (Moi) và mức nhiễm A. flavus BG1 (Flavus) với hàm lượng AF như hình 3.18. Week 10 13 0.00 NA 0e+00 0.00 0.59 0 60 2 1 2 0.62 1 0 1 3 Moi NA -0.23 0.52 0.35 Tem NA NA 1 5 3 0 NA 0 e + 0 0 Flavus 0.03 0.00 AFB1 0 5 0 0.95 2 12 0 6 0 15 30 0 40 AFTotal Hình 3.18. Biểu đồ mối tương quan giữa các biến: Thời gian (Week), Độ ẩm (Moi), Nhiệt độ (Tem), Mức nhiễm A. flavus BG1 (Flavus) với AFB1 và AF tổng số (AFTotal) 19 Hình 3.18 cho thấy: mức nhiễm AFB1 và AF tổng số có mối tương quan lớn nhất với chỉ số tương quan 0,95 và có mối quan hệ tuyến tính thể hiện ở đường thẳng tuyến tính biểu diễn mối quan hệ của hai biến này. Sau đó đến tỉ số tương quan giữa mức nhiễm AF tổng số và AFB1 với thời gian (Week) tương ứng là 0,62 và 0,59. Tiếp theo là mối tương quan giữa mức nhiễm AFB1 và độ ẩm (Moi) với hệ số tương quan là 0,52. Phân tích mô hình hồi quy tuyến tính mối quan hệ hàm lượng AF sinh ra trên các mẫu lạc nhân với các yếu tố ảnh hưởng bằng BMA ta có 4 mô hình được chọn. Các biến độc lập gồm