Tóm tắt Luận án Nghiên cứu sản xuất vaccine than Bacillus anthracis

uồng cấy vô trùng Class II Nuaire – USA. - Máy Khuếch đại gene Parking Elmer 2400 ( Mĩ). - Máy điện di Power pac 300 ( Bio - rad). - Máy ly tâm, máy đo MacFanland, máy ủ (370C). - Máy sequencer 3130 genetic Analyzer –ABI (Mỹ). - Cân điện tử, hộp Roux, đĩa Petri và các dụng cụ chuyên dùng. 2.2.2.2. Dụng cụ tiêu hao 2.2.2.3. Động vật thí nghiệm - Chuột nhắt trắng khỏe mạnh: 18 – 22g/con. - Chuột lang khỏe mạnh: 250 – 350 g/con. - Thỏ khỏe mạnh trọng lượng 2,5 – 3,5 kg/con (thỏ newzeland do Trung tâm nghiên cứu dê, thỏ Xuân Canh Ba Vì cung cấp). 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu: 2.3.1. Phƣơng pháp nghiên cứu tuyển chọn chủng sản xuất vaccine và các chủng vi khuẩn than gây bệnh làm chủng thử thách:  Kỹ thuật phân lập và định danh vi khuẩn:  Phƣơng pháp xác định khả năng gây bệnh thực nghiệm: - Phương pháp xác định độc tính cấp LD50 của chủng than độc lực.  Phƣơng pháp phát hiện B. anthracis và các yếu tố độc lực bằng kỹ thuật sinh học phân tử. - Kỹ thuật PCR và semi-Nested PCR xác định các gene độc lực B.anthracis - Kỹ thuật giải trình tự gene và so sánh trình tự các vùng gene: 4 2.3.2. Quy trình kỹ thuật sản xuất vaccine 2.3.2.1. Quy trình kỹ thuật sản xuất vaccine bào tử sống giảm độc lực Hình 2. 1: Quy trình sản xuất vaccine phòng bệnh than sống giảm độc lực. . Dsfdfgd Fgfgh Ghj Chủng Bacillus anthracis BaVCN1167 đông khô Nhân chủng trong canh thang TSB 37 0 C/15 giờ 3 Hoàn nguyên chủng với canh thang TSB (37 0 C/6h) (370C/hhggggiờ)giờ) Thạch dinh dưỡng (NA) 370C/24 giờ Bất hoạt vi khuẩn (650C/1giờ) Nuôi cấy thu sinh khối VK trên Thạch NA trong hộp Roux 37oC/48 giờ 370C/48 giờ Phân 0,5 ml dịch vi khuẩn vào lọ đông khô Gặt vi khuẩn bằng tá dược (12ml/hộp Roux) Đông khô vaccine trên máy đông khô Vắc xin thành phẩm - Kiểm tra thuần khiết - Kiểm tra độ sống - Kiểm tra vật lý, độ ẩm - Kiểm tra an toàn chung - Kiểm tra đáp ứng miễn dịch và công hiệu - Kiểm tra chủng giống - Kiểm tra thuần khiết - Chọn khuẩn lạc 5 2.3.2.2. Phƣơng pháp sản xuất vaccine hấp phụ phòng bệnh than (AVA) Hình 2. 2. Quy trình sản xuất vaccine hấp phụ phòng bệnh than (AVA) 2.2.2.2.1. Các bƣớc thực hiện quy trình lên men: 2.3.2.2.2. Các phƣơng pháp áp dụng trong sản xuất và đánh giá độ tinh sạch của protein PA của vaccine hấp phụ  Lựa chọn môi trường thích hợp lên men chủng dự tuyển sản xuất vaccine  Điều kiện môi trường sinh tổng hợp protein PA của B.anthracis  Kỹ thuật thu nhận protein PA [119]  Xác định độ tinh sạch bằng kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide 12,6 %  Tinh sạch protein bằng phương pháp tủa Ethanol  phương pháp sắc ký trao đổi ion  Sắc ký lọc gel Biogel P100.  Phương pháp Western Blot [3, 25] Môi trường nhân giống Môi trường lên men Nhân giống 24 h Lên men Tiếp giống 10% Tối ưu điều kiện môi trường Kiểm tra tốc độ sinh trưởng Xác định lượng protein tạo thành Thu mẫu sau 36h lên men Loại bỏ tế bào Tủa bằng cồn 50 % Kiểm tra protein bằng phản ứng Western, ELISA Chia nhỏ và đông khô Bổ sung amluminum hydroxide 0.1% (1) (2) (3) (4b) (5) (6) (9) (7) (10) (4a) (2) (8) 6 2.3.3. Phƣơng pháp đánh giá tính an toàn và sinh miễn dịch của vaccine phòng bệnh than. 2.3.3.1. Kỹ thuật xác định độc tính cấp của vaccine trên động vật thực nghiệm (LD50) . - Cách xác định LD50 theo phương pháp Kaerker và behrens - Cách tính LD50 theo công thức Spearman-Karber 2.3.3.2. Đánh giá tính an toàn của vaccine: 2.3.3.3. Kỹ thuật gây miễn dịch trên thỏ Máu 1 Máu 2 Máu 3 Máu 4 0 tuần 4 tuần 2 tuần 6 tuần 8 tuần 10 tuần Tiêm mũi 1 Tiêm mũi 2 Hình 2. 3: Lịch tiêm và thời gian lấy máu đánh giá đáp ứng miễn dịch của thỏ tiêm vaccine 2.3.3.4. Định lƣợng kháng thể (anti-PA) kháng kháng nguyên bảo vệ Pa-83 Kda từ huyết thanh thỏ. 2.3.3.5. Phƣơng pháp đánh giá vaccine phòng bệnh than và các tiêu chuẩn kiểm định vaccine phòng bệnh than Bảng 2. 1 Tiêu chuẩn chất lƣợng vaccine bào tử than, sống giảm độc lực TT Chỉ tiêu Tiêu chuẩn 1 Kiểm tra vật lý - Bánh xốp, màu trắng, vàng nhạt, bong, không teo, không chảy nước. - Hoàn nguyên với nước muối sinh lý tạo thành huyền dịch đồng nhất, không vẩn cặn. 2 pH 6,8-7,5 4 Thuần khiết (*) - Hình thái đặc trưng của trực khuẩn Than, Gram (+). - Không có tạp nhiễm. 5 Độ sống (*) 1 x 108 – 5 x 108 CFU/ml 6 Độ ẩm tồn dư  3% 7 Độ ổn định Độ sống đạt 1x108 - 5x108 CFU/ml đến 2 năm, bảo quản ở nhiệt độ 2 o C - 8 o C. 8 Chí nhiệt tố - Đánh giá các yếu tố gây sốt gây viêm trong vaccine, tiêm trên thỏ. Vết tiêm không có phản ứng viêm, Thỏ không tăng nhiệt sau khi tiêm 9 Tính sinh miễn dịch trên thỏ - Liều tiêm: + TTB 0,5ml x 10 8 tbvk/thỏ - Hiệu giá, hàm lượng kháng thể trong thỏ tiêm vaccine (u/ml = ng/ml) 7 10 Công hiệu, đánh giá thử thách - Sau 10 ngày thử thách (ngày 21-30), với phác đồ tiêm vaccine 0,14 ngày: + Chuột chứng: Chết 100%. + Chuột được tiêm vaccine liều: + 10 7 btvk/ml/con: sống 90% + 10 8 btvk/ml /con: sống 100%. Bảng 2. 2. Tiêu chuẩn vaccine hấp phụ phòng bệnh than AVA TT Chỉ tiêu Tiêu chuẩn 1 Kiểm tra vật lý - Bánh xốp, màu trắng, vàng nhạt, bong, không teo, không chảy nước. - Hoàn nguyên với nước muối sinh lý tạo thành huyền dịch đồng nhất, không vẩn cặn. 2 pH 6,8 - 7,5 3 Vô trùng - Không nhiễm vi khuẩn, nấm, vi sinh vật khác. 5 Độ sống Không 6 Aluminum hydrorid hoặc aluminum potassium sulfate 0,65mg / liều (AVA-Mỹ) 0,52 mg / liều (Merck) 7 formaldehyde 0,01% (AVA-Mỹ) 8 Benzethorium chlorid 0,0025% - 0,01% 9 Độ ẩm tồn dư  3% 10 Chí nhiệt tố - Đánh giá các yếu tố gây sốt, gây viêm trong vaccine trên thỏ. Vết tiêm không có phản ứng viêm, thỏ không tăng nhiệt sau khi tiêm. 11 Tính sinh miễn dịch trên thỏ - Liều tiêm: + AVA 0,1ml x 50µg/thỏ - Hiệu giá, hàm lượng kháng thể trong thỏ tiêm vaccine (u/ml = ng/ml) 12 Công hiệu, đánh giá thử thách. - Hiệu lực bảo vệ của vaccine tăng theo liều tiêm và nồng độ kháng nguyên PA83. 2.3.3.6. Quy trình kỹ thuật đánh giá công hiệu của vaccine AVA. 2.3.3.7. Quy trình kỹ thuật đánh giá công hiệu của vaccine TTB: 2.4. Quy trình, kỹ thuật đông khô vaccine. 2.5. Xử lý số liệu: Thống kê xử lý số liệu theo các thuật toán trong y học và các phần mềm trong nghiên cứu. Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ TUYỂN CHỌN CHỦNG SẢN XUẤT VẮC XIN VÀ CHỦNG THỬ THÁCH. 3.1.1. Kết quả phân lập định danh vi khuẩn than từ các loại mẫu khác nhau. Các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và mẫu môi trường được thu thập và phân lập tại Khoa Vi sinh vật viện Y học dự phòng Quân đội. Mẫu được phân lập chọn lọc trên môi trường thạch máu, sau đó lựa chọn khuẩn lạc, nhuộm soi hình thể cấu trúc, tính chất bắt màu và trình tự sắp xếp. 8 Các chủng nghi ngờ được định danh trên thanh API 50CHB/E và API 20E, để xác định tính chất sinh vật hóa học và định danh trên phần mềm của hãng BioMerieux. Bảng 3. 1: Kết quả định danh các chủng nghi ngờ từ mẫu bệnh phẩm và chủng đƣợc cung cấp bằng bộ kit API 50CHB/E TT Ký hiệu mẫu Nguồn mẫu Số mẫu/ chủng Nguồn gốc Kết quả định danh 1 Toxin Bệnh nhân HVQY 01 Chủng Bacillus anthracis (99,7%) 2 Non Toxin Bệnh nhân HVQY 01 Chủng Bacillus cereus II (99,9%) 3 Vaccine Viện VSPDQD 01 Chủng Bacillus cereus II (99,9%) 4 BaVCM1167 Viện CNSH cung cấp 01 Chủng Bacillus anthracis (99,9%) 5 Ba VCM 1168 Viện CNSH cung cấp 01 Chủng Bacillus anthracis (99,6%) 6 1NS Niêm Sơn-Mèo Mạc-Hà Giang 01 Thể da Bacillus cereus 1 (99,9%) 7 4NS Niêm Sơn-Mèo Vạc-HG 01 Thể dạ dày- ruột Bacillus anthracis (99,8%) 8 3KV (3B) Khâu Vai - HG 01 Thể da Bacillus anthracis (99,1%) 9 18C Tuần Giáo - Điện Biên 01 Thể da VK không mọc Kết quả bảng 2 cho thấy: Kết quả định danh xác định 05 chủng là trực khuẩn than (B. anthracis) từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng và mẫu chủng cung cấp với độ tin cậy trên 99%: Toxin, BaVCM1167, BaVCM1168, 4NS, 3KV. Bảng 3.2. Kết quả định danh các chủng nghi ngờ từ mẫu môi trƣờng bằng bộ kit API 50CHB/E T T Điểm thu thập mẫu Loại mẫu Số mẫu Kết quả định danh 1 Niêm Sơn- Niêm Tòng – Mèo Vạc – Hà Giang Đất (nơi bò chết) 03 2/3 chủng B.anthracis Đất (nơi chôn) 02 2 chủng B.anthracis Phân bò mắc bệnh 01 B.cereus 2 Khâu Vai- Hà Giang Đất nơi bò chết 02 B.cereus Lông bò 01 B.anthracis Phân bò 01 B.anthracis 3 Quỳnh Nhai- Sơn La Đất nơi xung quanh nơi trâu mắc bệnh 05 2/5 chủng B.anthracis B.cereus Phân trâu 01 B.anthracis 4 Trung Thu- Tủa chùa- Điện Biên Đất nơi ổ dịch cũ 03 B.cereus Nước sinh hoạt 01 Âm tính Lông, sừng trâu 06 3/6 chủng B.cereus 9 5 Tuần Giáo Điện Biên Đất chôn gia súc 06 B.cereus Phân gia súc mắc bệnh 01 B.cereus Tổng số 33 - Tống số chủng B. anthracis phân lập định danh từ mẫu môi trường là 9/33 chủng. 3.1.2. Kết quả phát hiện B.anthracis và các yếu tố độc lực bằng kỹ thuật PCR  Kết quả phát hiện vùng gene đặc hiệu Ba813 trên các chủng vi khuẩn than  Kết quả phát hiện vùng pagA thuộc pXO1 của các chủng vi khuẩn than  Kết quả phát hiện các vùng gene capA, capB, capC thuộc pXO2 Bảng 3.3. Kết quả PCR phát hiện B. anthracis và các yếu tố độc lực từ các chủng đƣợc cung cấp và chủng phân lập TT Ký hiệu mẫu Chromosome Các vùng gene thuộc plasmide (pXO1 và pXO2) Ba813 pagA CapA Cap B Cap C 1 Toxin (+) (+) (+) (+) (+) 2 Non Toxin (-) (-) (-) (-) (-) 3 Vaccine (-) (-) (-) (-) (-) 4 BaVCM1167 (+) (+) (-) (-) (-) 5 Ba VCM 1168 (+) (+) (+) (+) (+) 6 1NS (-) (-) (-) (-) (-) 7 4NS (+) (+) (+) (+) (+) 8 3KV (3B) (+) (-) (-) (-) (-) 9 A3 (+) (-) (-) (-) (-) 10 B1 (+) (-) (-) (-) (-) 11 B2 (+) (-) (-) (-) (-) 12 6B (+) (-) (-) (-) (-) 13 7C (-) (-) (-) (-) (-) 14 2C (+) (-) (-) (-) (-) 15 6C (-) (-) (-) (-) (-) 16 8C (-) (-) (-) (-) (-) 17 12C (-) (-) (-) (-) (-) 18 21C (-) (-) (-) (-) (-) 19 13C (-) (-) (-) (-) (-) 20 23C (-) (-) (-) (-) (-) 21 24C (-) (-) (-) (-) (-) 22 1C3 (+) (+) (+) (+) (+) 23 5C (-) (-) (-) (-) (-) 24 4C (+) (-) (-) (-) (-) 25 20C (-) (-) (-) (-) (-) Kết quả bảng trên cho thấy: Chủng BaVCM1167 chỉ có gene pagA nằm trên plasmide pXO1, không có các gene trên plasmide pXO2. phù hợp tiêu chí của chủng sản xuất vaccine. [25] [80]. Phát hiện 4 chủng độc lực ký hiệu Toxin, BaVCM1168, 4NS và 1C3 đầy đủ độc lực sử dụng làm các chủng thử thách. 10 3.1.3. Kết quả thử nghiệm gây bệnh thực nghiệm trên chuột nhắt trắng Bảng 3.4: Thử nghiệm độc tính các chủng than trên chuột nhắt trắng TT Tên chủng Nguồn gốc chủng Thời gian chuột chết 1 Toxin HVQY (BN thể da) 24 giờ - 48 giờ 2 4NS BN thể dạ dầy-ruột 24 giờ - 48 giờ 3 1C3 Môi trường 24 giờ - 48 giờ 4 Ba1167 Chủng được cung cấp không 5 Ba1168 Chủng được cung cấp 24 giờ - 48 giờ 3.1.4. Kết quả đánh giá chủng dự tuyển vaccine BaVCM1167 3.1.4.1. Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa đặc trƣng của chủng sản xuất vaccine - BaVCM1167 Bảng 3.4. Đặc tính sinh lý sinh hóa của chủng BaVCM1167 Chủng BaVCM1167 Đặc điểm A B C D E F G H I - + - + + + + + + . h ển đ ng . inh le cithina e . T o acid trong môi trường ch a manitol . inh catala e . h nitrat . hản ng . n men gl co e kị kh . hát triển trong môi trường a l . háng 1% lysozyme 3.1.4.2. Kiểm tra khẳng định sự có mặt của gene pagA và protein PA của chủng dự tuyển BaVCM1167  Khuếch đại đoạn gen pagA bằng phản ứng PCR  Đọc trình tự nucleotide của gene pagA của chủng VCM 1167. 3.1.4.3. Kết quả so sánh pagA mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA của chủng BaVCM1167 với các chủng gây bệnh trong nƣớc. Kết quả so sánh trình tự của chủng BaVCM1167 và các chủng than phân lập được tại Việt Nam cho thấy độ tương đồng rất cao, phát hiện hai đột biến điểm dẫn đến thay đổi 2 aa ở chủng Toxin và chủng 4NS của Việt Nam. Hình 3.1: So sánh trình tự nucleotide vùng pagA của 3 chủng B.anthracis phân lập tại Việt Nam và chủng dự tuyển sản xuất vaccine BaVCM1167 (Ba1167) bằng phần mềm Mega5 11 3.1.5. Kết quả đánh giá chủng than độc lực sử dụng làm chủng thử thách. Bảng 3.5. Kết quả xác định LD50 của chủng 4NS trên chuột lang Liều tiêm chủng 4NS (tbvk/ml) (n) Số chuột sống (%) Số chuột chết (%) Tƣơng quan sống/chết 10 tbvk/ml 5 4 (80,0%) 1 (20,0%) 0.2 100 tbvk/ml 5 2 (40,0%) 3 (60,0%) 0.6 1000 tbvk/ml 5 0 (0,0%) 5 (100,0%) 1 10.000 tbvk/ml 5 0 (0,0%) 5 (100,0%) 1 ∑Li =2.8 LD50 được tính theo phương pháp Kep∂epa LD50 = lgDN - ∂ (∑Li – 0,5) - lgDN: logarit của liều tiêm lớn nhất 10.000 = 4 - ∂ : log của hệ số pha loãng 10 = 1 Ta có : LgLD50 = 4 – 1(2,8 – 0,5) = 1.7  LD50 = 50 bào tử 3.2. NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮC XIN THAN 3.2.1. Nghiên cứu sản xuất vaccine hấp phụ phòng bệnh than (AVA) 3.2.1.1. Chọn môi trƣờng nuôi cấy thích hợp và khả năng sinh tổng hợp protein PA của chủng BaVCM1167 phục vụ sản xuất vaccine hấp phụ. Nghiên cứu sinh trưởng chủng BaVCM1166 và BaVCM1167 trên môi trường 1, 2 dạng đặc và dạng lỏng, ở 37 oC trong điều kiện kỵ khí hoàn toàn. Khả năng sinh trưởng phát triển và sinh tổng hợp protein PA của các chủng khi nuôi cấy trên cả hai môi trường 1, 2 dạng rắn rất tốt mật độ tế bào đạt 108 CFU/ml sau 36 h nuôi cấy. Trong khi đó, ở môi trường 1 (mt C) dạng lỏng các chủng vi khuẩn phát triển yếu hơn môi trường 2 (mt R). Kết quả điện di kiểm tra protein trên gel polyacrylamide 12,6%. 12 Hình 3.2: Điện di phát hiện sản phẩm protein Pa của chủng B.anthracis nuôi cấy trên môi trường 1 và 2 sau 42 giờ. 3.2.1.2. Nghiên cứu thời gian thích hợp cho sự sinh tổng hợp protein PA trên môi trƣờng 1 và 2 dạng lỏng và rắn. Hình 3.3: Điện di phát hiện sản phẩm protein PA của các chủng B.anthracis ở các thời điểm 24h, 36h, 48h, 60h, 72h trên môi trường 2 dạng rắn. Hình 3.4: Điện di phát hiện protein PA của các chủng B.anthracis sinh tổng hợp ở các thời điểm 24h, 36h, 48h, 60h, 72h nuôi cấy trong môi trường 1 dạng lỏng 1 – 5: Protein chủng Ba VCM 1166 sau 24, 36, 48, 60, 72 giờ nuôi cấy 6: Thang protein chuẩn 7 – 11: Protein chủng Ba VCM 1167 sau 24, 36, 48, 60, 72 giờ nuôi cấy 1 – 5: Protein chủng Ba VCM 1166 sau 24, 36, 48, 60, 72 giờ nuôi cấy 6: Thang protein chuẩn 7 – 11: Protein chủng Ba VCM 1167 sau 24, 36, 48, 60, 72 giờ nuôi cấy 83 kDa 100 70 1, 6: Protein chủng Ba VCM 1166 trên môi trường 1 rắn và lỏng 2, 7: Protein chủng Ba VCM 1167 trên môi trường 1 rắn và lỏng 3, 8: Protein chủng Ba VCM 1166 trên môi trường 2 rắn và lỏng 4, 9: Protein chủng Ba VCM 1167 trên môi trường 2 rắn và lỏng 5: Thang protein chuẩn 13 Hình 3.5: Điện di phát hiện protein PA của các chủng B.anthracis sinh tổng hợp ở các thời điểm 24h, 36h, 48h, 60h, 72h nuôi cấy trong môi trường 2dạng lỏng Môi trường 2 d ng lỏng, chủng BaVCM1166 tổng hợp protein PA và nhiều nhất sau 48 giờ (giếng 3 hình 3.10); thời gian thích hợp để chủng BaVCM1167 tổng hợp PA l i là ở 36 giờ (giếng 8 hình 3.10). Ở môi trường 2, chủng BaVCM1167 có thời gian tổng hợp PA dải hơn ở môi trường 1 (từ 36 giờ đến 72 giờ so với 36 giờ – 48 giờ ). Các kết quả trên cho thấy khoảng thời gian thích hợp cho sự sinh tổng hợp protein PA của các chủng BaVCM1167 là 36 – 48 giờ, và sinh tổng hợp protein PA tốt hơn khi được nuôi trong môi trường 2 dạng lỏng 3.2.1.3. Sản xuất protein kháng nguyên bảo vệ PA của chủng BaVCM1167 Biểu đồ động thái quá trình lên men 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 4 6 10 14 18 22 26 30 34 36 Thời gian p H 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 O D pH sinh khối protein Hình 3.6: Động thái quá trình lên men chủng BaVCM1167 ở nhiệt độ 37 oC trong điều kiện kỵ khí hoàn toàn sản xuất vaccine AVA 1 – 5: Protein chủng Ba VCM 1166 sau 24, 36, 48, 60, 72 giờ nuôi cấy 6: Thang protein chuẩn 7 – 11: Protein chủng Ba VCM 1167 sau 24, 36, 48, 60, 72 giờ nuôi cấy 14 y = 0.0163x + 0.0246 R2 = 0.9828 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0 5 10 15 20 25 BSA (mg/ml) OD Series1 Linear (Series1) Đường chuẩn protein PA y = 0.4299x + 0.0648 R2 = 0.9833 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0 0.5 1 1.5 2 2.5 PA OD 3.2.1.4. Nghiên cứu quá trình tinh sạch protein PA từ chủng BaVCM1167  Kết quả tinh sạch protein PA bằng phƣơng pháp tủa ethanol Kết quả cho thấy ở nồng độ Ethanol 50 % các protein khác đã bị loại bỏ đồng thời băng protein kích thước 83 kDa đã tăng lên rõ nét. Từ đó, chúng tôi tiến hành tinh sạch hàm lượng lớn protein PA ở nồng độ này. 1 2 kDa 100 85 70 83 kD a 1 2 3 4 5 6 7 83 kDa 85 kDa Hình 3.8: Điện di protein tổng số của chủng BaVCM 1167 Giếng 1: Protein PA tinh s ch sau khi tủa băng thanol 5 Giếng 2: protein trước tinh s ch Giếng 3: Thang protein chuẩn 85 kDa 83 kDa Hình 3.7: Đường chuẩn Bradford cho xác định hàm lượng protein tổng số của dịch lên men và phương trình đường chuẩn protein PA cho xác định hàm lượng protein PA trong dung dịch sau ly tâm . Hình 3.9: Tinh sạch protein PA bằng phương pháp tủa ethanol ở các nồng độ khác nhau 1-6: sản phẩm điện di tủa protein ở các nồng đ cồn lần lượt là 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %. 7: thang chuẩn protein. 1 2 3 15  Kết quả tinh sạch protein qua cột sắc ký trao đổi ion 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0 5 10 15 20 25 30 35 Hình 3.35. sắc ký đồ DEAE của các phân đoạn được đẩy ra khỏi cột  Kết quả tinh sạch protein qua cột sắc ký biogel P100  Khẳng định sự biểu hiện của protein PA bằng phản ứng Western blot 85 KDa 83 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Hình . : kết quản A xác đinh sự có mặt của protein PA trong các đỉnh 1-4: các đỉnh thu được tu sắc ký đồ P1 – P4 5: ĐC ( saline buffer) 1 2 3 4 5 Hình 3.10: Hình ảnh điện di các phân đoạn tinh sạch protein bằng sắc ký biogel P100. 1: Marker 2: protein trước tinh s ch 3 - 9: các phân đo n tinh sạch P1 P3 P2 P4 16 3..2.2. Sản xuất vaccine phòng bệnh than sống giảm độc lực tại Công ty Vaccine và Sinh phẩm Pasteur Đà Lạt: Phụ lục 4 3.3. ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN, VÀ SINH MIỄN DỊCH CỦA VẮC XIN AVA VÀ VẮC XIN TTB TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM. 3.3.1. Kiểm tra tiêu chuẩn an toàn vaccine 3.3.1.1. Yếu tố vật lý: - Vaccine hấp phụ: + Bóc nhãn lọ đựng vaccine, nhìn và đánh giá bằng mắt thường: vaccine được đóng trong lọ thủy tinh trắng, vaccine đông khô tạo thành bánh xốp, màu trắng, bong, không teo, không chảy nước. + Cho 6ml nước muối sinh lý tạo thành huyền dịch màu trong đồng nhất, không vẩn cặn. - Vaccine toàn tế bào: Lọ Vaccine phòng bệnh than đông khô có màu trắng, xốp, bong ra, không bị chảy nước. Hình 3.25a. Phản ứng của protein tái tổ hợp PA gắn Thioredoxin với kháng thể kháng Thioredoxin trên màng lai PVDF Giếng 4. Thang chuẩn protein Hình 3.25b. Phản ứng của protein tái tổ hợp PA gắn Thioredoxin với kháng thể kháng PA trên màng lai PVDF Giếng 7: Thang protein chuẩn (Fermentas) Giếng 8: Đối chứng (Huyết thanh thỏ trước khi gây miễn dịch) 17 3.3.1.2. Kiểm tra pH vaccine: - Vaccine hấp phụ: Hút dung dịch nhỏ lên giấy quỳ so màu với thang màu kết quả cho thấy ở khoảng màu pH=7,0 - Vaccine toàn tế bào: Các lô vaccine phòng bệnh than đông khô có giá trị pH đạt 6,8 – 7,5 3.3.1.3. Kết quả kiểm tra vô trùng.  Vaccine hấp phụ: Cho 6ml nước muối sinh lý vô trùng vào lọ vaccine, lắc đều. Tiến hành lấy 0,5 ml cho vào môi trường thạch máu, thạch dinh dưỡng và thạch sabouraud. Lấy que cấy ria đều huyền dịch trên đĩa thạch, ủ đĩa cấy trong nhiệt độ 370C/ 24 giờ. + Kết quả vi khuẩn hiếu khí: âm tính + Kết quả vi khuẩn tan huyết: âm tính + Kết quả nấm men, nấm mốc: âm tính  Vaccine toàn tế bào: thuần nhất 3.3.2. Kết quả đánh giá tính an toàn và sinh miễn dịch của vaccine: 3.3.2.1. Đánh giá phản ứng toàn thân và tại chỗ sau tiêm vaccine trên thỏ: Bảng 3.6. Kết quả theo dõi nhiệt độ và phản ứng tại chỗ của thỏ sau tiêm 02 loại vaccine, so sánh với nhóm chứng và nhóm plascebo. Mã số thỏ Trƣớc tiêm Sau tiêm T0 dao động Vết tiêm -2 -1 0 1 2 V a cc in e A V A Thỏ 1 Sáng 37,8 38,2 39 39,4 0,7 Bình thường chiều 39 39,1 39,1 39,4 Thỏ 2 Sáng 38,8 38 38,2 38,2 0,0 Bình thường chiều 38,2 38,1 38,4 38,3 Thỏ 3 Sáng 39,1 38,9 39 39 0,2 Bình thường chiều 38,9 39 39,4 39,2 Thỏ 4 Sáng 39,5 38,9 38,1 38,1 -0,8 Bình thường chiều 38,9 39 38,5 38,4 Thỏ 5 Sáng 38,9 39 39,5 39,5 0,2 Bình thường chiều 39,1 39 38,9 39 Thỏ 6 Sáng 37,5 38,2 39 39 0,7 Bình thường chiều 38,9 38,5 38,9 39 Thỏ 7 Sáng 38 39 38,9 38,9 0,2 Bình thường chiều 39 39 39 39 Thỏ 8 Sáng 38 38.5 39 39 0,8 Bình thường chiều 38.2 38 39 39 V a cc in e to à n t ế b à o (T T B ) Thỏ 9 Sáng 39,1 39 39,2 39 -0,1 Bình thường chiều 39,2 39,3 39,1 39 Thỏ 10 Sáng 38,2 38,5 38,8 38,5 -0,2 Bình thường chiều 39,1 39,2 38,5 38,5 Thỏ 11 Sáng 39,2 38,9 39,1 39,1 0,0 Bình thường chiều 39,2 39 39,1 39 Thỏ 12 Sáng 37,6 38,1 39,3 39,3 1,1 Bình thường chiều 38 38,2 38,5 39 Thỏ 13 Sáng 38,9 38,9 38,5 38,5 -0,4 Bình 18 3.3.2.2. Đánh giá độc cấp tính của vaccine (LD50) trên chuột nhắt trắng.  Độc tính cấp của vaccine AVA. Bảng 3.7. Xác định liều chết 50% (LD50) vaccine AVA trên chuột nhắt trắng Lô chuột thử nghiệm Nồng độ AVA ( µg/chuột) Số lƣợng chuột Tỉ lệ chết (%) Chết Sống Tổng số Lô sô 1 (n=8) 1800.00 2 6 8 25,00 Lô sô 2 (n=8) 1440.00 2 6 8 25,00 Lô sô 3 (n=8) 1152.00 0 8 8 0,00 Lô sô 4 (n=8) 921.60 0 8 8 0,00 Lô sô 5 (n=8) 737.28 0 8 8 0,00 Áp dụng công th c: logLD50 = Log X100 – Log Fd (∑t – n/2) n LD50 = 90.000 µg/kg Kết qủa cho thấy độc tính của vaccine AVA rất thấp, ở hàm lượng PA cao nhất mà chúng tôi có thể tạo ra không thể gây chết 50 % động vật thí nghiệm.  Độc tính cấp của vaccine TTB. Bảng 3.8. Xác định liều chết 50% (LD50) vaccine TTB trên chuột nhắt trắng Số lô chuột n Số lƣợng tế bào/ liều Kết quả theo dõi số lƣợng chuột Tỉ lệ chết (%) Chết Sống Tương quan Lô sô 1 8 1,25 x10 8 7 1 7/8 87,50 chiều 39 39 38,5 38,6 thường Thỏ 14 Sáng 38,7 39 39,2 39.2 0,3 Bình thường chiều 39 39 39,2 39,2 Thỏ 15 Sáng 39 39 39 39 -0,1 Bình thường chiều 38,9 39,2 39 38,9 Thỏ 16 Sáng 38,2 39 39,5 39,5 0,7 Bình thường chiều 38,1 38,1 38,5 38,8 p la sc eb o Thỏ 17 Sáng 39 38,5 38,8 38,8 -0,1 Bình thường chiều 38,8 39 38,7 38,6 Thỏ 18 Sáng 38,8 38,5 39,6 39,6 0,8 Bình thường chiều 38,2 38 38,2 39,2 ch ứ n g Thỏ 19 Sáng 38,1 38,5 39 38,6 0,4 Bình thường chiều 38,4 38,8 38,9 38,9 Thỏ 20 Sáng 39 39 38,9 39 0,2 Bình thường chiều 38,2 38,5 39 38,7 19 Lô sô 2 8 1,00 x10 8 6 2 6/8 75,00 Lô sô 3 8 0,75 x10 8 4 4 4/8 50,00 Lô sô 4 8 0,50 x10 8 1 7 1/8 12,5 Lô sô 5 8 0,25 x10 8 0 8 8 0,00 Áp dụng công th c: Từ công thức trên có thể áp dụng cụ thể trong trường hợp này là: LD50 = 2,27 x 10 9 tbvk/kg Kết qủa trên cho thấy độc tính của vaccine TTB tương đối cao. Liều an toàn trên chuột là 0.25 x 108 tương đương 1,25 x 109 tbvk/kg. 3.3.2.3. Kết quả đánh giá tính sinh miễn dịch của vaccine AVA và TTB trên thỏ  Kết quả đánh giá kháng thể nền trên thỏ và xác định ngƣỡng dƣơng tính. Bảng 3.9. Nồng độ kháng thể nền trong huyết thanh thỏ trƣớc khi tiêm vaccine Vaccine thử nghiệm dự kiến Số thỏ Ký hiệu thỏ Định lƣợng nồng độ anti-PA83 trên thỏ trƣớc tiêm vaccine OD GMT Xm ± SD P (α=0,05) Vaccine hấp phụ (AVA) 7 Thỏ 1 0,576 0,423 0,437 ± 0,121 0,889 Thỏ 2 0,365 Thỏ 4 0,533 Thỏ 5 0,584 Thỏ 6 0,365 Thỏ 7 0,334 Thỏ 8 0,305 Vaccine toàn tế bào (TTB) 8 Thỏ 9 0,416 0,435 0,45 ± 0,108 Thỏ 10 0,305 Thỏ 11 0,495 Thỏ 12 0,504 Thỏ 13 0,365 Thỏ 14 0,347 Thỏ 15 0,640 Thỏ 16 0,495 Tổng (16 thỏ) 0,429 0,442 ± 0,111 Ghi chú: n: số lượng thỏ th nghiệm; : đ lệch chuẩn. Xm giá trị trung bình c ng của kháng thể. GMT: giá trị trung bình nhân của hiệu giá kháng thể 20  Kết quả định lƣợng kháng thể trên thỏ tuần thứ 6 sau tiêm 2 mũi vaccine. Bảng 3. 10. Nồng độ anti-PA83 của các lô thỏ vào tuần thứ 6 sau tiêm vaccine. Lô thỏ n Ký hiệu Định lƣợng nồng độ anti-Pa 83 trên thỏ P (α=0,05) anti-PA (µg/ml) Ln(PA) GMT (µg/ml) Lô 1 (tiêm vaccine AVA) 8 Thỏ 1 59,926 11,000 13,065 P(1,2) = 0,0052 P(1;3) = 0,170 P(2;3) = 0,000547 Thỏ 2 6,240 8,738 Thỏ 3 8,713 9,072 Thỏ 4 6,862 8,833 Thỏ 5 49,752 10,814 Thỏ 6 6,272 8,743 Thỏ 7 11,848 9,379 Thỏ 8 10,280 9,237 Lô 2 (tiêm vaccine toàn tế bào) 8 Thỏ 9 36,004 10,491 39,518 Thỏ 10 51,740 10,854 Thỏ 11 36,702 10,510 Thỏ 12 33,224 10,411 Thỏ 13 45,634 10,728 Thỏ 14 24,478 10,10