Tóm tắt Luận án Nghiên cứu squalene từ vi tảo biển dị dưỡng shizochytrium mangrovei pq6 định hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm

Schizochytrium được nuôi trong các bình tam giác 1.000 mL chứa 300 mL môi trường M1, chế độ lắc 200 vòng/phút ở 25-28oC. 6 - Chủng tảo thuộc chi Thraustochytrium được nuôi trên môi trường Bajpai cải tiến, chế độ lắc 200 vòng/ phút ở 25-28oC. - Môi trường nuôi trồng Schizochytrium spp. trong bình lên men 30L gồm Môi trường M12 cho lên men theo mẻ (9% glucose, 1% cao nấm men, muối biển nhân tạo 17,5 g/L); Môi trường sử dụng để nhân giống cấp 1 (CNT1), giống cấp 2 (CNT2), cho lên men theo mẻ (CNT3) có bổ sung cơ chất gồm: Môi trường CNT1 (%): glucose - 3, cao nấm men -0,4, monosodium glutamate- 6,42, NaCl - 1,25, MgSO4 - 0,4, KCl - 0,05, CaCl2 - 0,01, NaHCO3 - 0,05, KH2PO4 - 0,4, hỗn hợp vitamin - 0,14 (vitamin B1 - 45 g/L, vitamin B6 - 45 g/L và vitamin B12 - 0,25 g/L) và vi lượng - 0,8; Môi trường CNT2 (%) gồm: glucose - 8,57, cao nấm men - 0,64, monosodium glutamate - 6,42, NaCl - 2, KH2PO4 - 0,64, MgSO4 - 2,29, CaCl2 - 0,03, NaHCO3 - 0,03, Na2SO4 - 0,03, hỗn hợp vitamin - 0,14, và vi lượng - 0,2; Môi trường CNT3 (%) gồm: glucose- 7,5, cao nấm men - 1,2, monosodium glutamate- 6,42, NaCl - 0,25, KH2PO4- 0,96, MgSO4- 1,2, CaCl2- 0,12, NaHCO3- 0,12, KCl-0,08, hỗn hợp vitamin - 0,4. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Nhóm phương pháp xác định chủng/loài; đặc điểm sinh học; điều kiện nuôi trồng tối ưu của chủng/loài tiềm năng cho sản xuất squalene cao 2.2.1.1. Phương pháp xác định sinh trưởng qua mật độ tế bào và sinh khối khô: sử dụng buồng đếm Burker - Turk (Đức), sấy sinh khối tảo ở 105oC đến khối lượng không đổi (Dang Diem Hong và cs, 2011) 2.2.1.2. Phương pháp chụp ảnh hình thái: chụp bằng máy ảnh kỹ thuật số Canon IXY 7.0 của Nhật Bản dưới kính hiển vi quang học Olympus CX21. 2.2.1.3. Phương pháp xác định hàm lượng lipid tổng số trong sinh khối tảo: theo phương pháp của Bligh và Dyer (1959) với một số cải tiến. 2.2.1.4. Phương pháp nhuộm lipid bằng Nile Red (Doan và Obbard, 2010). 2.2.1.5. Phương pháp xác định đường khử bằng DNSA: theo Miller (1959). 2.2.1.6. Phương pháp xác định sơ bộ hàm lượng squalene: định lượng squalene bằng phương pháp so màu (Rothblat và cs, 1962). 2.2.1.7. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu điều kiện nuôi trồng tối ưu của chủng/loài tiềm năng thuộc chi Schizochytrium cho sản xuất squalene cao Cấp độ bình tam giác Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, nồng độ cao nấm men, nồng độ glucose ban đầu, nồng độ terbinafie (TBNF): sử dụng bình tam giác 250 mL chứa 100 mL môi trường M1, lắc 200 vòng/phút trong 5 ngày để nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy (15oC, 20oC, 25oC, 30oC), nồng độ glucose ban đầu (15, 30, 40, 60 và 90 g/L), cao nấm men (0,5, 1, 1,5, 2, 3, 4%); và TBNF (0, 0,1, 1, 10, 100, 150, 200 µg/mL) trong khi các thành phần khác vẫn giữ nguyên như trong môi trường cơ bản. Nghiên cứu ảnh hưởng của hỗn hợp vitamin (B1, B6, B12): Tảo nuôi trong bình tam giác 250 mL chứa 100 mL môi trường CNT3 có bổ sung 0; 0,2; 0,4; 0,6% hỗn hợp vitamin (vitamin B1- 45 g/L, vitamin B6- 45 g/L và B12- 0,25 g/L). Sau 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 h nuôi, tiến hành thu, đếm mật độ tế bào (MĐTB), xác định sinh khối tươi (SKT), SKK, và squalene. Cấp độ bình lên men 30 L Nghiên cứu ảnh hưởng của glucose: - Giống cấp 1: S. mangrovei PQ6 được nuôi cấy trên môi trường thạch GPY, sau đó được cấy chuyển sang các bình nuôi 1 L có chứa 300 mL môi trường M1, lắc ở 200 v/p, nhiệt độ nuôi 28C trong thời gian 96 h. - 2% giống cấp 1 được bổ sung vào bình lên men 30 L chứa 15 L môi trường M12 với nồng độ glucose thay đổi từ 3, 6, 9, 12, 22%. Sau 24, 48, 72, 96 và 120 h lên men, tiến hành thu mẫu, chụp ảnh hình thái tế bào, đếm MĐTB, xác định SKT, SKK, hàm lượng lipid và squalene. Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ: 2% giống cấp 1 được bổ sung vào bình lên men 30 L chứa 15 L môi trường M12 với nguồn nitơ là 1% cao nấm men hoặc kết hợp 1,2% cao nấm men (Y) và 6,42% monosodium glutamate (YM). Sau 24, 48, 72, 96 và 120 h lên men, tiến hành thu, chụp ảnh hình thái tế bào, đếm MĐTB, xác định SKT, SKK, hàm lượng đường dư và squalene. Nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất (fed-batch): 7 - Giống cấp 1: Khuẩn lạc S. mangrovei PQ6 được cấy chuyển sang bình nuôi 500 mL có chứa 200 mL môi trường CNT1, nuôi lắc ở 28oC, 200 v/p trong 24 h. - Giống cấp 2: 1% giống cấp 1 được bổ sung vào bình tam giác 2 L có chứa 1 L môi trường CNT2, nuôi lắc ở 28oC, 200 v/p trong 24 h. - 2% giống cấp 2 được bổ sung vào bình lên men 30 L có chứa 15 L môi trường CNT3. Tại thời điểm 48 h, bổ sung glucose đến nồng độ 22%. Sau 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 và 108 h, thu mẫu, đếm MĐTB, xác định SKT, SKK, hàm lượng đường dư và squalene. Nghiên cứu ảnh hưởng của vitamin trong lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất - Giống cấp 1: Khuẩn lạc S. mangrovei PQ6 được cấy chuyển sang bình nuôi 500 mL có chứa 200 mL môi trường CNT1, nuôi lắc ở 28oC, 200 v/p trong 24 h. - Giống cấp 2: 1% giống cấp 1 được bổ sung vào bình tam giác 2 L có chứa 1 L môi trường CNT2, có hoặc không có bổ sung 0,14% hỗn hợp vitamin, nuôi lắc ở 28oC, 200 v/p trong 24 h. - 2% giống cấp 2 được bổ sung vào bình lên men 30 L có chứa 15 L môi trường CNT3 có hoặc không có bổ sung 0,4% hỗn hợp vitamin. Sau 12, 24, 36, 48 h xác định hàm lượng đường dư trong môi trường nuôi. Khi hàm lượng đường dư nhỏ hơn 2% thì bổ sung glucose để đạt nồng độ 22%. Sau khi bổ sung glucose 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, và 108 h tiến hành thu mẫu, đếm MĐTB, xác định SKT, SKK, hàm lượng đường dư và squalene. 2.2.2. Nhóm phương pháp xác định điều kiện tách chiết và tinh sạch squalene từ S. mangrovei PQ6 2.2.2.1. Phương pháp xác định điều kiện tách chiết và tinh sạch lượng nhỏ squalene từ sinh khối S. mangrovei PQ6 - Phương pháp tách chiết lipid không xà phòng hóa (KXPH) từ lipid tổng số: theo phương pháp của Lewis và cs (2001). Lipid KXPH được sử dụng để chạy sắc ký lớp mỏng (TLC). - Tối ưu điều kiện tách chiết lipid tổng số từ sinh khối S. mangrovei PQ6: nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi khác nhau (n-hexane, chloroform, petroleum ether; nhiệt độ (0, 30, 50 và 80C); thời gian phản ứng (1, 3, 4, 5 giờ); điều kiện khuấy trộn (không khuấy trộn, khuấy trộn liên tục, gián đoạn); số lần chiết (1, 2, 3 lần); tỷ lệ sinh khối/dung môi (1:8, 1:10, 1:12), nhiệt độ sấy sinh khối (60, 70, 80, 90C) và độ ẩm sinh khối 3, 30, 50, 80%). - Tối ưu điều kiện tách chiết lipid KXPH từ lipid tổng số: nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ hỗn hợp dung môi n- hexane: chloroform là 1:1; 2:1; 3:1; 4:1 và 5:1 trong khi các bước còn lại trong quy trình vẫn được giữ nguyên. - Tách chiết, tinh sạch và làm giàu squalene bằng phương pháp dung môi như mô tả trong báo cáo của Choo và cộng sự (2005). 2.2.2.2. Phương pháp xây dựng quy trình tách chiết và làm sạch squalene ở quy mô pilot từ sinh khối tảo S. mangrovei PQ6 - Tách chiết squalene thô từ sinh khối tế bào theo phương pháp của Lu và cộng sự (2003). Nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi (ethanol và methanol), độ ẩm sinh khối (20% đến 100%) lên tách chiết và hàm lượng squalene. - Tách chiết squalene thô từ dịch tế bào theo công bố của Pora và cộng sự (2015), tinh sạch squalene thô bằng sắc ký cột. 2.2.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng và độ tinh sạch của squalene bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) (Định Thị Ngọc và cs., 2013) 2.2.2.4. Phương pháp xác định cấu trúc của squalene: bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) sử dụng máy Bruker Avance-500 MHz spectrometer (Poucher và cộng sự, 1993). 2.2.3. Nhóm phương pháp xác định các chỉ tiêu chất lượng của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 Phương pháp xác định chỉ tiêu cảm quan theo TCVN 2627-1993 Phương pháp xác định chỉ tiêu hóa lý: độ ẩm theo TCVN 6120:2007; trị số acid, xà phòng hóa, peroxyt, Iod theo TCVN 6127:2010; TCVN 6126:2007; TCVN 6121:2010 và TCVN 6122: 2010, tương ứng. Phương pháp xác định chỉ tiêu vi sinh vật Phương pháp xác định chỉ tiêu kim loại 2.2.4. Nhóm phương pháp đánh giá tính an toàn và tác dụng dược lý của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên động vật thực nghiệm (in vivo) và mô hình tế bào (in vitro) 2.2.4.1. Nhóm phương pháp đánh giá tính an toàn và tác dụng dược lý của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên mô hình in vivo 8 - Nghiên cứu độc tính cấp của squalene theo phương pháp của Litchfield - Wincoxon (Đỗ Trung Đàm, 2014), quy định của Bộ Y tế Việt Nam (2018), hướng dẫn của Tổ chức Hợp tác và Phát triển Kinh tế (OECD) (2002) và Tổ chức Y tế thế giới (2000). - Đánh giá độc tính bán trường diễn: qui định của Bộ Y tế Việt Nam (2018), hướng dẫn của Tổ chức Hợp tác và Phát triển Kinh tế (OECD) (2000) và Tổ chức Y tế thế giới (2000). - Tác dụng làm tăng HDL-C của squalene trên chuột nhắt trắng được tiến hành đánh giá theo phương pháp được mô tả bởi Clara Gaba´s-Rivera và cộng sự (Đỗ Trung Đàm, 2006). 2.2.4.2. Nhóm phương pháp đánh giá bước đầu nghiên cứu cơ chế tác dụng giảm lipid của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên mô hình in vitro - Tế bào HepG2 và RAW264.7 được nuôi cấy trên môi trường DMEM/high glucose có chứa 10% FBS, 100 U/mL penicillin, và 0,1 mg/mL streptomycin trong tủ nuôi cấy vô trùng ở 37C, 5% CO2. - Độc tính của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên tế bào HepG2 được phân tích theo phương pháp MTT. - Nhuộm lipid bằng Oil red O (ORO) theo phương pháp của Hoang và cộng sự (2012). - Tách chiết lipid nội bào. - Hàm lượng cholesterol và triglyceride nội bào được xác định bằng phương pháp enzyme - Tách chiết RNA tổng số (theo kit RNAiso PlusTakara - Tokyo, Nhật Bản), tổng hợp cDNA (theo kit RevertAid First Strand cDNA - Thermo Fisher, Scientific Ins., Singapore). Các cDNA sau đó được sử dụng như khuôn mẫu cho phản ứng qPCR. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase được sử dụng để chuẩn hóa số liệu. 2.2.5. Thống kê phân tích số liệu Số liệu được trình bày bằng số trung bình ± sai số chuẩn. Sự sai khác được coi là có ý nghĩa thống kê ở mức P <0,05, số liệu được xử lý thống kê theo phương pháp Student’s t-test, so sánh bằng Anova test sử dụng phần mềm SPSS 16.0. 2.2.6. Địa điểm tiến hành các thí nghiệm trong nghiên cứu Chương 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận 3.1. Sàng lọc chủng vi tảo biển dị dưỡng có tiềm năng sản xuất squalene Dựa trên khả năng sinh trưởng, tích lũy lipid và squalene, đã lựa chọn được chủng S. mangrovei PQ6 từ 40 chủng thuộc chi Schizochytrium và Thraustochytrium. Lượng sinh khối khô, hàm lượng lipid và squalene của chủng PQ6 đạt cao nhất tương ứng là (12,38 ± 0,72) g/L, (39,61 ± 0,12)% SKK, (102,01 ± 1,04) mg/g SKK. Trong các nghiên cứu trước đây, chủng PQ6 đã được nghiên cứu khá kỹ về đặc điểm sinh học và khả năng nuôi trồng trên quy mô lớn. Đây cũng là chủng tiềm năng để sản xuất các PUFAs trong đó có DHA (Đinh Thị Ngọc Mai và cs, 2013; Hoang và cs, 2014). 3.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi trồng S. mangrovei PQ6 lên sinh trưởng và hàm lượng squalene 3.2.1. Tối ưu điều kiện nuôi trồng S. mangrovei PQ6 cho sản xuất squalene ở cấp độ bình tam giác 3.2.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng và hàm lượng squalene ở cấp độ bình tam giác Trong dải nhiệt độ từ 15-35oC, chủng PQ6 đã cho thấy sinh trưởng và hàm lượng squalene đạt cao nhất khi nuôi ở 28oC là (13,47 ± 0,53) g/L và (61,42 ± 1,24) mg/g SKK sau 4 và 5 ngày nuôi, tương ứng. Khi so sánh với công bố của Lewis và cs (2001), Nakazawa và cs (2012), nhiệt độ thích hợp cho chủng PQ6 sinh trưởng và tổng hợp squalene có cao hơn. Đặc điểm của chủng, điều kiện tự nhiên và khí hậu có thể là nguyên nhân dẫn đến sự sai khác này. 3.2.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men lên sinh trưởng và hàm lượng squalene ở cấp độ bình tam giác Trong khoảng nồng độ cao nấm men từ 0,5-4%, SKK và hàm lượng squalene của chủng PQ6 đạt gần tương đương ở nồng độ 1 và 1,5%. Ở nồng độ này, SKK và hàm lượng squalene của chủng PQ6 tương ứng đạt (13,56 ± 0,28) mg/g SKK và (61,02 ± 1,36) mg/g SKK sau 5 ngày nuôi. Nghiên cứu của Chen và cộng sự (2010) trên chủng Aurantiochytrium sp. đã cho thấy, sinh trưởng của chủng này tăng khi tăng nồng độ cao nấm men từ 0,5 đến 3 g/L. Hàm lượng và sản lượng squalene cao nhất đạt 0,21 mg/g và 1,62 mg/L sau 36 h nuôi khi sử dụng 6 g/L cao nấm men. Như vậy, hàm lượng squalene của chủng PQ6 cao hơn so với công bố của tác giả trên. 3.2.1.3. Ảnh hưởng của nồng độ glucose ban đầu lên sinh trưởng và hàm lượng squalene ở cấp độ bình tam giác Khi tăng nồng độ glucose từ 1,5- 9%, sinh trưởng của chủng này đạt cực đại ở nồng độ glucose 4% sau 5 ngày nuôi cấy là (13,06 ± 0,39) g/L. Hàm lượng lipid, hàm lượng và sản lượng squalene cao nhất đạt được ở 9% 9 glucose sau 6 và 5 ngày nuôi tương ứng là (51,02 ± 1,54% SKK), (62,89 ± 2,59) mg/g SKK và (640,94 ±10,04) mg/L. Khi chủng này được nuôi trồng trong bình tam giác ở điều kiện tối ưu, hàm lượng squalene chiếm 6,3% SKK đã được xác định bằng phương pháp TLC và HPLC. Giá trị này cao hơn hàng trăm lần so với các chủng thraustochytrids đã được thông báo trước đây (0,002-0,150% SKK) (Jiang và cs, 2004; Li và cs, 2009; Chen và cs, 2010; Lewis và cs, 2001; Fan và cs, 2010). 3.2.1.4. Ảnh hưởng của nồng độ terbinafine lên sinh trưởng và hàm lượng squalene ở cấp độ bình tam giác TBNF là một chất ức chế enzyme squalene monooxygenase trong con đường sinh tổng hợp sterol. Enzyme này có vai trò xúc tác quá trình oxy hóa squalene thành 2,3 oxidosqualene trong sự có mặt của phân tử ôxy và NADH (Ono 2002; Ryder và cs, 1992). Việc bổ sung TBNF từ 0,1 lên 200 µg/mL vào môi trường làm giảm đáng kể MĐTB và lượng SKK sau 5 ngày nuôi. Tuy nhiên, hàm lượng lipid và squalene lại tăng lên đáng kể. Hàm lượng squalene thay đổi không đáng kể khi tăng nồng độ TBNF lên 10 lần (0,1-1 µg/mL). Khi tăng nồng độ TBNF lên 1000 lần (100 g/mL), hàm lượng squalene đạt cực đại (97,34 ± 1,97) mg/g SKK sau 5 ngày nuôi. 3.2.1.5. Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp vitamin lên sinh trưởng và hàm lượng squalene ở cấp độ bình tam giác Nghiên cứu của Pora và cộng sự (2014) cho thấy các vitamin như B1, B6 và B12 có tác dụng làm tăng sản xuất squalene trong nuôi cấy tảo Schizochytrium. Khi nghiên cứu ảnh hưởng tổ hợp các vitamin này với nồng độ 0- 0,6% lên quá trình tổng hợp squalene của chủng PQ6 đã cho thấy, sinh trưởng và hàm lượng squalene của chủng này đạt cao nhất khi bổ sung tổ hợp vitamin ở nồng độ 0,4 và 0,6%. Do không có sự khác biệt đáng kể giữa 2 nồng độ này, nên nồng độ 0,4% được lựa chọn cho các thí nghiệm nghiên cứu tiếp theo. Sau 6 ngày nuôi cấy, SKK và hàm lượng squalene của chủng PQ6 đạt được cao nhất khi bổ sung 0,4% tổ hợp vitamin tương ứng là (39,98 ± 0,35) g/L và (76, 16 ± 2,34) mg/g SKK (tăng 34,43% so với đối chứng không bổ sung vitamin). 3.2.2. Tối ưu điều kiện nuôi trồng chủng S. mangrovei PQ6 ở bình lên men 30 lít để thu sinh khối tảo giàu squalene 3.2.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ glucose lên sinh trưởng và tích lũy squalene của chủng S. mangrovei PQ6 nuôi trồng theo mẻ trong hệ thống bình lên men 30 L Nồng độ glucose ban đầu có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng và khả năng tích lũy squalene của loài A. mangrovei (tên trước đây là S. mangrovei) đã được chứng minh trong các nghiên cứu của Fan và cs (2010), Nakazawa và cộng sự (2012). Kết quả đạt được khi nuôi chủng PQ6 ở bình lên men 30 L với nồng độ glucose từ 3- 22% đã cho thấy MĐTB, SKK và sản lượng squalene của chủng PQ6 tăng mạnh khi nồng độ glucose tăng từ 3 đến 9%. Với nồng độ glucose ban đầu là 9% cho lượng SKK và lượng squalene đạt giá trị cao nhất. Lượng SKK và squalene đạt giá trị cực đại tương ứng là (35,5 ± 0,1) g/L và (1,1 ± 0,1) g/L. Kích thước tế bào đồng đều ở nồng độ 6% - 9% glucose và lớn hơn so với nồng độ cao là 12% và 22% glucose. Do vậy, nồng độ glucose ban đầu là 9% được lựa chọn để nuôi trồng chủng PQ6 bằng hệ thống lên men 30 L theo mẻ. 3.2.2.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sinh trưởng và tích lũy squalene của chủng S. mangrovei PQ6 nuôi trồng theo mẻ trong hệ thống lên men 30 L Khi kết hợp cả hai nguồn nitơ là cao nấm men và monosodium glutamate, MĐTB, SKK và sản lượng squalene đạt cực đại, tương ứng là (3,3 x 108) tế bào/mL, 46,7 g/L và 1,6 g/L sau 72 h nuôi cấy. Hàm lượng squalene không có sự thay đổi đáng kể khi sử dụng nguồn nitơ là cao nấm men hoặc kết hợp cả cao nấm men và monosodium glutamate. Tuy nhiên, khi kết hợp hai nguồn nitơ nói trên thì sản lượng squalene đạt giá trị cao nhất sau 72 h (1605,5 mg/L), trong khi đó sử dụng cao nấm men chỉ đạt 1195,2 mg/L. Điều này có thể là do tăng lượng sinh khối trong môi trường khi kết hợp cả hai nguồn nitơ. Vì vậy, nguồn nitơ trong thí nghiệm của chúng tôi chỉ có tác dụng làm tăng tốc độ sinh trưởng của tảo dẫn đến tăng sản lượng squalene chứ không làm tăng sự tích lũy squalene. Điều này cũng tương tự như mô tả của Chen và cộng sự (2010). 3.2.2.3. Ảnh hưởng của lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất lên sinh trưởng và tích lũy squalene của chủng S. mangrovei PQ6 Pora và cộng sự (2014) đã thông báo hàm lượng squalene của một số loài thraustochytrid có thể tăng từ 5- 10 lần khi nuôi cấy theo mẻ có bổ sung cơ chất là glucose lên tới 22% (fed-batch). Đối với chủng PQ6, nuôi theo kiểu fed-batch cũng làm tăng sinh trưởng và tích lũy squalene. MĐTB và SKK đạt cực đại tại thời điểm 108 h sau khi bổ sung glucose (392,53 ± 1,91) × 106 TB/mL và (100,41 ± 1,43) g/L, tương ứng. Sản lượng squalene cao nhất đạt được là (4592,53 ± 0,3) mg/L ở 84 h, tăng 2-3 lần so với lên men theo mẻ. 3.2.2.4. Ảnh hưởng của tổ hợp vitamin lên sinh trưởng và tích lũy squalene của chủng S. mangrovei PQ6 10 Việc bổ sung 0,4% tổ hợp vitamin vào môi trường nuôi cũng đã làm tăng sinh khối và hàm lượng squalene của chủng PQ6 khi nuôi theo kiểu fed-batch. SKK cao nhất đạt (105,25 ± 0,75) g/L sau 96 h. Hàm lượng và sản lượng squalene đạt cực đại tương ứng là (91,53  2,45) mg/g SKK và (6928,6  14,6) mg/L sau 48 h, cao gấp 2-3 lần so với kiểu fed-batch không bổ sung vitamin và cao gấp 4-6 lần so với lên men theo mẻ. Sản lượng squalene của chủng PQ6 đạt được cao hơn so với các chủng Schizochytrium sp., Schizochytrium sp. ATCC 20888 và Aurantiochytrium sp. ATCC PRA 276 trong nghiên cứu của Pora và cộng sự (2014). Nile Red là thuốc nhuộm huỳnh quang được sử dụng để phát hiện các hạt lipid trung tính trong tế bào nhân sơ và tế bào nhân chuẩn (Cooksey và cs, 1987). Vì squalene nằm trong phần lipid không xà phòng hóa nên có thể quan sát định tính sự tích lũy squalene thông qua nhuộm Nile Red (Hình 3.13). 3.3. Xây dựng quy trình tách chiết và tinh sạch squalene từ S. mangrovei PQ6 3.3.1. Tối ưu điều kiện tách chiết và tinh sạch lượng nhỏ squalene từ S. mangrovei PQ6 3.3.1.1. Tách chiết lipid tổng số từ sinh khối S. mangrovei PQ6 Các điều kiện thích hợp cho quá trình tách chiết lipid tổng số của S. mangrovei PQ6 là sinh khối ban đầu sấy ở 80oC đến độ ẩm 3%, sử dụng dung môi n-hexane, nhiệt độ tách chiết 70-75oC, khuấy liên tục trong thời gian 4 giờ, chiết 1 lần với tỷ lệ sinh khối: dung môi là 1:8 (w/v). 3.3.1.2. Tách chiết lipid không xà phòng hóa- lipid KXPH từ lipid tổng số Trong các tỷ lệ khảo sát của tỷ lệ hỗn hợp dung môi n-hexane: chloroform là 1:1, 2:1, 3:1, 4:1 và 5:1, hàm lượng squalene trong lipid KXPH ở tỷ lệ 2:1 đạt cao nhất là (8,1 ± 0,14)%. 3.3.1.3. Tinh sạch và định lượng squalene bằng sắc ký mỏng và sắc kỷ lỏng cao áp Kết quả chỉ ra trên Hình 3.15 A cho thấy mẫu lipid KXPH tách chiết từ chủng PQ6 xuất hiện băng tương đồng với squalene chuẩn. Định lượng bằng HPLC, hàm lượng squalene khoảng (50,10 ± 0,03) mg/g SKK. Squalene tách chiết được có độ tinh sạch cao (98,6%) (Hình 3.15 B). Hàm lượng squalene thu được bằng phương pháp này cao hơn Aurantiochytrium limacinum 9F-4a (0,6 mg/g SKK), 4W-1b (0,5 mg/g SKK), Schizochytrium limacinum SR21 (0,2 mg/g) nhưng lại thấp hơn A. limacinum SR21 (171,1 mg/g SKK) (Nakazawa và cộng sự (2012). Hình 3.13. Hình thái tế bào chủng PQ6 ở các giai đoạn nuôi cấy của quá trình lên men fed-batch. A- Trước thời điểm bổ sung glucose; B- Sau khi bổ sung glucose lên 22%. (a) Kính hiển vi quang học; (b) Nile red; (c) Kính hiển vi điện tử truyền qua. L- thể lipid; Mi- ty thể; N- nhân; V- không bào. Thanh kích thước: a-b=10 m; c=2 m A B Hình 3.15. Sắc ký lớp mỏng mẫu lipid không xà phòng hóa (A) và sắc kí đồ squalene tinh sạch từ sinh khối chủng PQ6 (B) (A: giếng 1: squalene chuẩn - 2 mg; giếng 2, 3, 4, 5, 6, 7: lipid KXPH tách từ sinh khối chủng PQ6) 11 3.3.1.4. Tách chiết, tinh sạch và làm giàu squalene bằng phương pháp dung môi Do hàm lượng squalene thu được sau khi sử dụng phương pháp TLC và HPLC thấp nên đã tiến hành làm giàu squalene theo mô tả của Choo và cộng sự (2005) bằng phương pháp dung môi. Hàm lượng squalene đã tăng 1,7 lần (từ 61,76 ± 0,12 lên 104,99 ± 0,34 mg/g SKK). Squalene thu được có độ tinh sạch cao (>98%) và qua phân tích cấu trúc bằng bằng 1H NMR 1H (500 MHz, CDCl3) có thể khẳng định chất tách chiết được là squalene. 3.3.2. Xây dựng quy trình tách chiết và tinh sạch squalene ở quy mô pilot từ S. mangrovei PQ6 3.3.2.1. Ảnh hưởng của các tác nhân lên hiệu quả tách chiết squalene từ sinh khối S. mangrovei PQ6 Ảnh hưởng của dung môi: Hỗn hợp KOH/ ethanol cho kết quả tốt nhất với hàm lượng squalene thô đạt (123 ± 11) mg/g SKK, trong đó hàm lượng squalene thực tế là (0,32 ± 0,04) mg/mg squalene thô. Ảnh hưởng của độ ẩm sinh khối: độ ẩm của sinh khối không ảnh hưởng đến hàm lượng squalene tách chiết. Hàm lượng squalene thô và thực tế tách chiết được từ sinh khối có độ ẩm 20 và 100% tương ứng là (128 ± 31) mg/g SKK và (0,30 ± 0,02) mg/mg squalene thô; (126 ± 14) mg/g SKK và (0,32 ± 0,03) mg/mg squalene thô. 3.3.2.2. Tách chiết squalene từ dịch tế bào chủng S. mangrovei PQ6 sau quá trình nuôi cấy lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất Môi trường kiềm và nhiệt độ cao có thể phá vỡ màng tế bào các loài thuộc chi thraustochytrids (Pora và cs, 2014). Dịch tế bào chủng PQ6 có mật độ tương đương với 250-300 g/L được chỉnh pH đến 10 bằng KOH 45%, được khuấy ở 60oC, 150 vòng/phút trong 6 h. Kết quả thu được cho thấy, không có sự khác biệt đáng kể về hàm lượng squalene khi tách chiết từ dịch lên men ((0,29 ± 0,02) mg/mg squalene thô) và từ sinh khối khô ((0,28 ± 0,03) mg/mg squalene thô). Vì vậy, để hướng tới việc sản xuất squalene theo quy mô công nghiệp, phương pháp tách chiết squalene trực tiếp từ dịch chiết lên men đã được lựa chọn. 3.3.2.3. Điều kiện tinh chế squalene bằng phương pháp pháp sắc ký cột Các phân đoạn squalene thu được sau khi qua cột sắc ký với hệ dung môi rửa giải n-hexane, squalene thu được sau khi qua cột có độ tinh sạch cao (chiếm 90-95% khi so sánh phần trăm diện tích peak). Bên cạnh đó, hiệu suất thu hồi đạt khoảng 50-60%. Kết quả nghiên cứu của Watanabe và cộng sự (2013) cũng cho thấy n-hexane đã cho phép thu squalene có độ tinh sạch cao và hiệu suất thu hồi có thể đạt tới 70-80%. Do vậy, dung môi rửa giải cho sắc ký cột để tinh chế squalene là n-hexane đã được lựa chọn. 3.3.2.4. Xây dựng quy trình tách chiết và làm sạch nguyên liệu squalene từ sinh khối tảo S. mangrovei PQ6 Dựa vào các nghiên cứu tách chiết và tinh chế squalene có tính ổn định và lặp lại cao, quy trình tách chiết và làm sạch nguyên liệu squalene từ dịch lên men sau quá trình lên men có bổ sung cơ chất của chủng PQ6 đã được xây dựng (Hình 3.26). Sử dụng quy trình này, đã tách chiết được squalene tinh khiết ở dạng dịch lỏng không màu, không mùi với độ tinh sạch đạt 90-95%. 3.3.3. Tách chiết và tinh chế lượng lớn squalene từ S. mangrovei PQ6 Với quy trình đã xây dựng ở trên (Hình 3.26), từ 46 L dịch lên men (khoảng (3,9 ± 0,1) kg SKK) đã tách chiết được (1,08 ± 0,29) kg squalene thô, tinh chế được khoảng 131 mL squalene tinh khiết ở dạng dịch lỏng không Hình 3.26. Quy trình tách chiết squalene từ S. mangrovei PQ6 12 màu, không mùi, có hàm lượng squalene là (305,23 ± 2,34) g (Hình 3.27). Kết quả phân tích sắc ký HPLC cho thấy squalene thu được có độ tinh sạch cao (chiếm từ 90-95%; Hình 3.28) và không bị tạp nhiễm. Phân tích phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3), phân tích khối phổ 13 C NMR (125 MHz, 140 CDCl3) (Hình 3.29) và so sánh với squalene chuẩn (Pouchert và Behnke, 1993), có thể khẳng định đã tách được squalene từ VTBDD S. mangrovei PQ6. 3.3.4. Phân tích các chỉ tiêu về cảm quan, hóa lý, vi sinh vật và kim loại của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 Kết quả phân tích chất lượng squalene tách chiết được tại Trung tâm Chứng nhận phù hợp (Quacert), Trung tâm Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng, Bộ KH và CN đã cho thấy squalene đạt yêu cầu chất lượng để làm nguyên liệu cho định hướng sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm: dạng lỏng, không màu, không mùi; chỉ số acid- 0,524 mgKOH/g; chỉ số peroxyt- 4,2 Meq O2/kg, không có chứa dư lượng urê, các chỉ tiêu về kim loại nặng đều nằm trong giới hạn cho ph