Tóm tắt Luận án Nghiên cứu sự di truyền các đột biến gây bệnh ở bệnh nhân Beta - Thalassemia vùng đồng bằng sông Cửu Long bằng kỹ thuật sinh học phân tử - Phạm Thị Ngọc Nga

lệ mang gen bệnh: được xác định dựa vào chỉ số MCV/MCH, điện đi Hb và kết quả tìm được ĐB bằng các kỹ thuật sinh học phân tử (Sơ đồ 3.1). * Kiểu hình huyết học: được khảo sát ở môt vài thông số Số lượng hồng cầu; chỉ số Hct; chỉ số MCV; chỉ số MCH; chỉ số Hb được ghi nhận từ kết quả của xét nghiệm công thức máu 18 thông số. Tỷ lệ HbA, HbA2, HbF, HbE được ghi nhận từ kết quả điện di Hb. 3.3.3.4. Tư vấn di truyền (n=75) * Tư vấn di truyền về kiến thức bệnh β-Thal Các đối tượng mang gen 18-65 tuổi trong cùng 1 phả hệ sẽ được tư vấn di truyền. Đánh giá kiến thức liên quan đến bệnh β-Thal theo bộ 13 câu hỏi tự điền và được soạn sẵn. Kiến thức được đánh giá trước và sau khi bác sĩ tư vấn trên 3 lĩnh vực: kiến thức về bệnh (5 câu hỏi); kiến thức về chăm sóc bệnh nhân mắc bệnh (5 câu hỏi); kiến thức về phòng bệnh (3 câu hỏi). * Tư vấn di truyền cho các cặp vợ chồng mang gen và đang mang thai giai đoạn đầu (<24 tuần): cặp vợ chồng mang gen bệnh đồng ý nghiên cứu sẽ thực hiện chẩn đoán trước sinh khi thai nhi đạt 15-20 tuần tuổi tại bệnh viện Từ Dũ. 7 3.3.4. Các xét nghiệm và kỹ thuật dùng trong nghiên cứu * Mục tiêu xác định kiểu đột biến gen - 50% số mẫu máu của bệnh nhân được ly trích DNA bằng kít QIAamp DNA Blood Mini và xác định 22 kiểu ĐB phổ biến ở khu vực Đông Nam Á dựa vào nguyên lý của kỹ thuật lai dò ngược Reverse Dot Blot (RDB) tại trung tâm nghiên cứu Thalassemia, trường đại học Mahidol, Thái Lan bằng kít β-globin StripAssay SEA™ của ViennaLab Diagnostics GmbH, Vienna, Austria. Các mẫu bệnh chưa có kết quả sẽ tiếp tục giải trình tự gen β-globin. - 40% số mẫu máu của bệnh nhân được ly trích DNA và thực hiện kỹ thuật giải trình tự tại trung tâm Y - Sinh học phân tử, trường đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh. - 10% số mẫu máu của bệnh nhân được thực hiện RDB và giải trình tự để đối chiếu kết quả của 2 phương pháp. Các mẫu bệnh chưa có kết quả bằng giải trình tự sẽ được gửi đến khoa xét nghiệm Di truyền Y học, bệnh viện Từ Dũ để thực hiện kỹ thuật MLPA bằng kít MLPA Probemix P102 HBB cho nhóm gen globin ® của MRC – Holland để tìm ĐB ngoài gen β-globin. * Mục tiêu xây dựng 12 phả hệ - Người có quan hệ huyết thống 3 đời với bệnh nhân sẽ làm công thức máu 18 thông số tại Khoa Huyết học, bệnh viện trường Đại học Y Dược Cần Thơ. - Đối tượng có kết quả dương tính với chỉ số MCV và/hoặc MCH sẽ được thực hiện kỹ thuật điện di Hb tại Trung tâm chẩn đoán Y khoa Medic, thành phố Hồ Chí Minh để tìm người mang gen bệnh. - Người mang gen bệnh sẽ được ly trích DNA và thực hiện xác định 22 kiểu ĐB bằng các kỹ thuật như mục tiêu 1 để xác định thể bệnh β-Thal và GAP-PCR tìm ĐB gây α-Thal. 8 3.3.5. Sơ đồ nghiên cứu Sơ đồ 3.1. Các bước chính trong nghiên cứu 9 Chương 4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Trong thời gian 1/6/2013 đến 30/6/2016, có 341 bệnh nhân được chẩn đoán mắc bệnh β-Thal tham gia xác định đột biến. Có 12 gia đình bệnh nhân với 263 thành viên đồng ý tham gia nghiên cứu sự di truyền bệnh qua phả hệ. Có 75/93 (80,6%) người mang gen bệnh đủ điều kiện tham gia tư vấn di truyền. Sau tư vấn có 3 cặp vợ chồng mang gen và đang có thai giai đoạn đầu đồng ý chọc ối chẩn đoán trước sinh xác định thể bệnh cho thai nhi. 4.1. Tỷ lê ̣ các kiểu đột biến gen gây bệnh và thể bệnh β-Thal ở khu vực Đồng bằng sông Cửu Long 4.1.1. Các kỹ thuật sinh học phân tử đã dùng xác định đột biến gen β-globin Beta thalassemia là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường phổ biến ở Việt Nam. Có hơn 200 đột biến gây bệnh β-Thal đã được công bố trên thế giới. Việc phát hiện các kiểu đột biến gen sẽ giúp chẩn đoán trước sinh và tư vấn di truyền hạn chế sự xuất hiện của các trẻ mắc thể nặng. Để tìm ĐB cho bệnh nhân β-Thal khu vực ĐBSCL, nghiên cứu đã kết hợp cả 3 kỹ thuật sinh học phân tử: RDB, giải trình tự và MLPA theo sơ đồ 4.1. Kết quả: 100% bệnh nhân đã tìm được ĐB phù hợp với kết quả điện di và lâm sàng. - 8/22 kiểu ĐB được phát hiện bằng kỹ thuật reverse dot blot (RDB) trên các mẫu bệnh nhân: -28 A>G, Cd17 A>T, Cd26 G>A, IVS1.1 G>T, Cd41/42 –TTCT, Cd71/72 +A, Cd95 +A và IVS2.654 C>T. - Có 15 kiểu ĐB được phát hiện bằng giải trình tự. Ngoài 8 đột biến phổ biến tìm gặp tương tự như RDB, còn có thêm 4 đột biến hiếm: IVS1.5 G>C (βIVS1.5), Cd26 G>T (βCd26), Cd15 G>A (c.48 G>A) (βCd15), Cd11 G>A (Hb Hamilton) (βCd11) và 3 đột biến mới: IVS2.499 C>T; IVS2.636 A>C là hai ĐB thay thế nucleotide ở vùng intron 2 của gen β-globin tại lần lượt các vị trí c.316-42C>T và c.316-179A>C; Đột biến Cd38-39 ACCCAG>CCCAA (βCd38/39) xảy ra tại vị trí c.115 đến c.120, 6 nucleotide thuộc 2 codon 38 và 39 ACC-CAG (Thr- Gln-) bị thay bằng 5 nucleotide là CCCAA (Pro-). Kết quả, khung giải mã bị dịch chuyển từ vị trí c.115 về sau (Hình 4.1). - 35 (10%) bệnh nhân thực hiện cả 2 kỹ thuật giải trình tự và RDB. Đối chiếu kết quả: 100% bệnh nhân cho kết quả tương tự nhau ở cả 2 10 phương pháp. Như vậy, cả hai kỹ thuật đều có độ đặc hiệu cao và tuy tốn nhiều thời gian thực hiện hơn nhiều so với RDB, kỹ thuật giải trình tự đã phát hiện được tất cả các ĐB trong vùng gen β-globin khảo sát với chi phí xét nghiệm tương tự. Đó là lý do, ngày nay giải trình tự được sử dụng khá phổ biến để tìm ĐB gen gây bệnh β-Thal. Hình 4.1. Đột biến Cd38-39 ACCCAG>CCCAA được phát hiện bằng SEQ - Có 2 kiểu mất đoạn lớn trong cụm gen β-globin được phát hiện trên 2 bệnh nhân bằng kỹ thuật MLPA: (1) Đột biến mất đoạn từ exon 3 thuộc gen Delta (HbD) đến 0,5kb sau của exon 3 thuộc gen β-globin (δβ)del; (2) Đột biến mất một đoạn từ vị trí promoter đến hết exon1 của gen β-globin (-pro)del. Sơ đồ 4.1. Các kỹ thuật sinh học phân tử và số lượng mẫu đã thực hiện. 11 4.1.2. Tỷ lệ đột biến gây bệnh β-Thal ở khu vực ĐBSCL Có 609/682 alen của 341 bệnh nhân tìm được ĐB. Trong đó, có 268/341 bệnh nhân thuộc dạng truyền máu phụ thuộc, mỗi bệnh nhân sẽ có cả 2 alen mang ĐB và 73/341 bệnh nhân thuộc dạng không cần truyền máu, mỗi bệnh nhân chỉ có 1 alen mang ĐB. 17 kiểu ĐB được xác định: 97,2% các ĐB thuộc 8 kiểu phổ biến của Việt Nam; 9 kiểu ĐB thuộc dạng không phổ biến chiếm 2,8%. Ba đột biến mới chiếm 0,6%. Các kiểu ĐB được gặp với nhiều tần số khác nhau. Trong 17 kiểu đột biến: βHbE chiếm tỷ lệ cao nhất 33,8%, kiểu βCd41/42 và βCd17 đạt lần lượt 23,3% và 21%. Thấp nhất là các kiểu: βIVS2.499, βCd11, βIVS2.636, βCd38/39, (-pro)del và (δβ)del có tỷ lệ giống nhau 0,2%. Bảng 4.1. Tỷ lệ đột biến gây bệnh β-Thal ở khu vực ĐBSCL STT Kiểu ĐB Số lượng Tỷ lệ % Kiểu đột biến phổ biến ở Việt Nam 593 97,2 1 Cd26 G>A (βHbE) 206 33,8 2 Cd41/42 –TTCT (βCd41/42) 142 23,3 3 Cd17 A>T (βCd17) 128 21 4 -28 A>G (β-28) 28 4,6 5 Cd71/72 +A (βCd71/72) 28 4,6 6 IVS2.654 C>T (βIVS2.654) 26 4,2 7 IVS1.1 G>T (βIVS1.1) 22 3,6 8 Cd95 +A (βCd95) 13 2,1 Kiểu đột biến không phổ biến ở Việt Nam 16 2,8 9 Cd15 G>A (c.48 G>A) (βCd15) 5 0,8 10 IVS1.5 G>C (βIVS1.5) 3 0,5 11 Cd26 G>T (βCd26) 2 0,3 12 IVS2.499 C>T (βIVS2.499) 1 0,2 13 Cd11G>A (βCd11) 1 0,2 14 IVS2.636 A>C (βIVS2.636) 1 0,2 15 Cd38-39 ACCCAG>CCCAA (βCd38/39) 1 0,2 16 (-pro)del 1 0,2 17 (δβ)del 1 0,2 Tổng 609 100 * Các đột biến mới phát hiện Có 3 bệnh nhân mang 3 đột biến mới được phát hiện bằng kỹ thuật giải trình tự. 100% các bệnh nhân là dân tộc Kinh. Trong đó, có 2 bệnh 12 nhân ở thể dị hợp tử kép có lâm sàng thiếu máu nặng, ứ sắt, gan lách to cần truyền máu, thải sắt định kỳ hàng tháng; 1 bệnh nhân thể dị hợp tử dị hợp tử bị thiếu máu nhẹ và không cần truyền máu. Kết quả thể hiện ở các chỉ số huyết học trong bảng 4.2. Bảng 4.2. Chỉ số huyết học và Hb của các đột biến mới Kiểu phối hợp đột biến Chỉ số huyết học Chỉ số Hb RBC Hct Hb MCV MCH HbA HbA2 HbF βCd17/ βCd38/39 2,7 19,7 6,1 71,8 22,3 65,3 2,7 32 (-pro)del/βIVS2.499 2,3 19,7 6,8 85,8 29,5 95,2 2,2 2,2 βIVS2.636 4.77 33 10 69.2 21 89.8 6 4.2 Như vậy, ba ĐB mới là βIVS2.636, βCd38/39 và βIVS2.499 cũng góp phần gây thiếu máu với mức độ tương tự như các bệnh nhân β-Thal thể nặng hoặc các bệnh nhân dị hợp tử do các ĐB phố biến. * Tỷ lệ các kiểu đột biến theo các nhóm dân tộc - Tỷ lệ các kiểu đột biến ở dân tộc Kinh: có 549/614 alen của 307 đối tượng dân tộc Kinh tìm được ĐB, 16 kiểu ĐB được xác định: 97,5% đột biến thuộc 8 kiểu phổ biến ở Việt Nam, có 8 kiểu ĐB khác thuộc dạng không phổ biến chiếm 2,5%. Kiểu đột biến βHbE, βCd41/42 và βCd17 chiếm tỷ lệ cao nhất >20%. Thấp nhất là các kiểu: βIVS2.499,βCd11, βIVS2.636, βCd38/39, (β-pro)del mỗi loại đạt 0,2%. - Tỷ lệ các kiểu đột biến ở dân tộc Khmer: có 39/40 alen của 20 đối tượng dân tộc Khmer tìm được ĐB, 5 kiểu ĐB được xác định: 4/5 kiểu thuộc dạng ĐB phổ biến: βHbE, βCd41/42, βCd17 và βIVS2.654 chiếm 97,4%. Trong đó, kiểu βHbE, βCd41/42 chiếm tỷ lệ cao nhất lần lượt là 48,7% và 33,3%. βCd15 là kiểu ĐB không phổ biến duy nhất trên dân tộc Khmer chiếm 2,6%. - Tỷ lệ các kiểu đột biến ở dân tộc Hoa: có 12/14 alen của 7 đối tượng dân tộc Hoa tìm được ĐB, 4 kiểu ĐB được xác định. 100% ĐB là phổ biến tại Việt Nam. Trong đó, kiểu βCd41/42 và βHbE chiếm tỷ lệ cao nhất lần lượt là 41,7% và 33,3%, còn lại là β-28, βIVS2.654. - Tỷ lệ các kiểu đột biến ở dân tộc Chăm: có 9/14 alen của 7 đối tượng dân tộc Chăm tìm được ĐB và chỉ có 2 kiểu ĐB được xác định: đột biến phổ biến βHbE (88,9%) và ĐB không phổ biến (δβ)del (11,1%). Như vậy, mỗi dân tộc có số lượng và tỷ lệ mỗi kiểu ĐB khác nhau. Kiểu ĐB đa dạng và chiếm tỷ lệ cao ở dân tộc Kinh do có số lượng bệnh nhân tham gia nghiên cứu nhiều (307 bệnh nhân). Ở mỗi dân tộc, 8 loại 13 ĐB phổ biến ở Việt Nam luôn chiếm tỷ lệ cao từ 88,9% ở dân tộc Chăm đến 100% ở dân tộc Hoa. Các ĐB hiếm được gặp với tần suất rất thấp <3%, trừ dân tộc Chăm 11,1%. Tóm lại, bên cạnh 8 kiểu ĐB phổ biến chiếm tỷ lệ cao, nghiên cứu đã ghi nhận có đến 9 kiểu ĐB khác. Trong đó có cả ĐB mới, ĐB chưa phát hiện trong các nghiên cứu trước tại Việt Nam, hơn nữa các ĐB này còn rất hiếm gặp trên thế giới. Điều này cho thấy phổ ĐB của bệnh nhân β-Thal khu vực ĐBSCL rất rộng. Kết quả nghiên cứu là một tiền đề quan trọng trong việc gợi ý các xét nghiệm tìm kiểu gen cho bệnh nhân hoặc chẩn đoán trước sinh cho đối tượng mang gen có ý định có con. Cần phải chú trọng sử dụng kỹ thuật phù hợp để tránh bỏ sót và dẫn đến việc chào đời bé thể nặng hoặc đánh giá sai về thể bệnh ảnh hưởng điều trị cho bệnh nhân. 4.1.3. Các thể bệnh β-Thal và các kiểu phối hợp gen giữa các ĐB 17 kiểu ĐB đã tạo 5 kiểu phối hợp gen chính (chiếm 99,1%) trên 341 bệnh nhân β-Thal: β0/β0, β0/β+, β+/β+, β+/β, β0/β và 2 kiểu gen chưa xác định được do ĐB mới tạo thành (0,9%). Bảng 4.3. Tỷ lệ các kiểu gen trên 341 bệnh nhân STT Kiểu gen Số lượng Tỷ lệ % 1 β0/β+ 211 61,9 2 β0/β 61 17,9 3 β0/β0 36 10,5 4 β+/β+ 19 5,6 5 β+/β 11 3,2 6 β0/β? 2 0,6 7 β?/β 1 0,3 Tổng 341 100 17 kiểu ĐB này do sự kết hôn ngẫu nhiên của các cặp vợ chồng nên đã tạo đến 42 kiểu phối hợp ĐB gen trong 4 thể bệnh β-Thal: đồng hợp tử, dị hợp tử kép, thể phối hợp HbE/β-Thal và β-Thal dị hợp tử. Tỷ lệ các thể bệnh trình bày ở bảng 4.4. Cũng tương tự như các nghiên cứu khác trong nước và trong khu vực, thể phối hợp HbE/β-Thal luôn là thể bệnh phổ biến nhất (58,1%). Khi tìm hiểu về sự phối hợp của các kiểu ĐB trong các thể bệnh, nghiên cứu ghi nhận: thể dị hợp tử kép có 16 kiểu phối hợp; thể dị hợp tử có 13 kiểu; phối hợp HbE/β-Thal có 10 kiểu; ít nhất là thể đồng hợp có 3 kiểu. 14 Bảng 4.4. Tỷ lệ các thể bệnh trên 341 bệnh nhân STT Thể bệnh Số lượng Tỷ lệ % 1 Phối hợp HbE/β-Thal 198 58,1 2 Dị hợp tử 73 21,4 3 Dị hợp tử kép 58 17 4 Đồng hợp tử 12 3,5 Tổng 341 100 Ở 12 bệnh nhân đồng hợp tử, chỉ có 3 kiểu đột biến tham gia trong thể bệnh này là: βHbE, βCd17, βCd41/42. Trong đó, sự phối hợp của 2 đột biến βCd17 chiếm đến 50%. Tương tự ở các thể dị hợp tử kép kiểu đột biến: βCd41/42/βCd17; ở thể phối hợp HbE/β-Thal: βCd41/42/βHbE, βCd17/βHbE và ở thể dị hợp tử kiểu đột biến: βCd41/42/β, βCd17/β luôn chiếm tỷ lệ cao hơn so với các kiểu phối hợp của các ĐB khác trong nhóm. Sự kết hôn giữa các cặp vợ chồng đều mang tính chất ngẫu nhiên. Do đó, kết quả này, chỉ xuất hiện khi tần số của 3 loại ĐB rất cao trong cộng đồng. Như vậy, ở khu vực ĐBSCL 3 đột biến βCd41/42, βCd17, βHbE là ĐB gây bệnh phổ biến nhất. Ở thể đồng hợp tử, với sự phối hợp ngẫu nhiên 3 đột biến tạo ra hai kiểu gen chính: β0/β0, β+/β+. Trong đó, kiểu gen β0/β0 do 2 đột biến βCd17, βCd41/42 tự phối hợp tạo thành đã quy định kiểu hình thiếu máu nặng, cần truyền máu phụ thuộc hàng tháng. Ngược lại, kiểu gen β+/β+ do βHbE tạo ra chỉ mang kiểu hình β-Thal nhẹ, không cần truyền máu. Theo y văn, β-Thal là bệnh do gen lặn gây ra, nhưng trong nghiên cứu này không phải thể đồng hợp tử β-Thal nào cũng sẽ gây thiếu máu nặng. Bệnh nhân có biểu hiện mức độ thiếu máu nào thì cần phải xem xét đến bản chất các ĐB tạo nên kiểu gen đó. 4.2. Phả hệ di truyền của một số bệnh nhân Beta thalassemia 4.2.1. Xây dựng phả hệ di truyền 263 thành viên gồm: 12 bệnh nhân β-Thal và 251 người nhà tham gia trong 12 phả hệ. Trong đó có 141 nữ và 122 nam, ngoài ra các phả hệ còn có 2 thai nhi bị sảy, 1 thai đang phát triển và 1 bị chấm dứt thai kỳ do kết quả chẩn đoán trước sinh thai nhi ở thể bệnh β-Thal đồng hợp tử βCd41/42. 11/12 phả hệ có 3 thế hệ, chỉ có duy nhất một phả hệ kinh có 4 thế hệ. Số người trung bình trong mỗi phả hệ là 22 người. 8/12 phả hệ gia đình bệnh nhân là dạng phối hợp HbE/β-Thal: 4 dân tộc Kinh, 03 dân tộc Khmer và 1 dân tộc Hoa (Hình 4.2A). 15 1/12 phả hệ gia đình bệnh nhân dân tộc Kinh 4 thế hệ đương sự ở thể dị hợp kép do phối hợp giữa 2 đột biến β-28 và βCd17. Hình 4.2. Bốn phả hệ di truyền bệnh β-Thal đại diện cho 04 dân tộc Ghi chú: Một số ký hiệu dùng trong phả hệ 1/12 phả hệ gia đình bệnh nhân dân tộc Kinh là dạng đồng hợp tử do phối hợp của 2 đột biến giống nhau βCd41/42. 1/12 phả hệ gia đình bệnh nhân dân tộc Kinh là dạng dị hợp tử kép do phối hợp 2 đột biến: β-28, βCd41/42 và có thêm đột biến -SEA gây bệnh α- Thal (Hình 4.2C). 1/12 phả hệ gia đình bệnh nhân dân tộc Chăm mang HbE và ĐB gây bệnh beta hiếm gặp là (δβ)del (Hình 4.2D). Tất cả các bệnh nhân β-Thal (có hai ĐB) và người mang gen bệnh (có 1 đột biến) trong phả hệ đều được di truyền và tổ hợp các ĐB từ bố mẹ, ông bà ở thế thệ thứ I và thứ II. 100% phả hệ mang đặc điểm di truyền gen lặn trên NST thường theo quy luật của Mendel. 16 4.2.2. Tỷ lệ mang gen bệnh trong phả hệ nghiên cứu 4.2.2.1. Các xét nghiệm và kỹ thuật dùng sàng lọc, xác định người mang gen và các đột biến trong phả hệ nghiên cứu Người nhà của 12 đương sự (251/263 đối tượng) tham gia nghiên cứu trong phả hệ được làm xét nghiệm và nhiều kỹ thuật để sàng lọc tìm người mang gen cũng như xác định kiểu ĐB (Sơ đồ 4.2). Kết quả: - Công thức máu: 146/251 (58,2%) đối tượng có kết quả dương tính với chỉ số MCV/MCH (MCV<80fL, MCH<28pg). - Điện di Hb: 103/146 (70,5%) người nhà có dương tính gồm: 9 thể phối hợp HbE/β-Thal (HbE và HbF cao), 2 thể đồng hợp HbEE (HbE cao>90%), 59 thể dị hợp tử β-Thal (HbA2 >3,5), 33 thể dị hợp HbE (HbE tăng). - Kỹ thuật RDB tìm đột biến gây bệnh β-Thal: 101/103 (98,1%) bệnh nhân tìm được ĐB trên gen β-globin; 2 bệnh nhân không tìm được ĐB tiếp tục tìm ĐB bằng kỹ thuật MLPA. Sơ đồ 4.2. Các bước sàng lọc, xác định người mang gen và tìm đột biến cho các đối tượng ở 12 phả hệ - Kỹ thuật GAP-PCR tìm đột biến gây bệnh α-Thal, kết quả có 8 bệnh nhân mang có đột biến –SEA. Trong đó, 6/8 bệnh nhân là người chỉ mang gen gây bệnh α-Thal và 2/8 bệnh nhân là người mang gen phối hợp α và β-Thal (thể dị hợp tử phối hợp ĐB của α/β-Thal) do cả 2 bệnh nhân này ngoài đột biến –SEA, kỹ thuật RDB cũng tìm được ĐB gây bệnh β- Thal. - Kỹ thuật MLPA: 2 bệnh nhân làm MLPA đều mang đột biến giống nhau (δβ)del. 17 Kết quả các ĐB gây bệnh β-Thal tìm được bằng 2 kỹ thuật RDB và MLPA đều phù hợp với kết quả điện di. Tuy nhiên, nếu chỉ sử dụng điện di Hb mà không sử dụng kỹ thuật RDB và GAP-PCR để tìm kiểu ĐB sẽ có 2/103 (1,9%) bệnh nhân dị hợp tử phối hợp ĐB của α/β-Thal không được phát hiện. Điều này cho thấy sự cần thiết phải sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong việc xác định thể bệnh cho bệnh nhân thalassemia. 4.2.2.2. Tỷ lệ mang gen bệnh trong phả hệ nghiên cứu Ở mỗi phả hệ tỷ lệ mang gen bệnh đều ≤50%. Tỷ lệ mang gen β khác nhau: thấp nhất là 9,4% và cao nhất là 50%. Tỷ lệ mang gen HbE cũng dao động từ 0%-37,5% trong từng phả hệ. Tỷ lệ mang gen bệnh chung cả beta và HbE của 12 phả hệ 34,6% và là 35,4% nếu thêm 0,8% bệnh nhân mang gen phối hợp giữa α/β-Thal (Bảng 4.5). Bảng 4.5. Tỷ lệ mang gen bệnh trong 12 phả hệ Phả hệ β-Thal HbE α-Thal α/β-Thal n % n % n % n % Kinh 01 (n=24) 3 12,5 9 37,5 - - - - Kinh 02 (n=12) 6 50 1 8,3 - - - - Kinh 03 (n=15) 5 33,3 - - - - - - Kinh 04 (n=26) 6 23,1 - - 6 23,1 2 7,7 Kinh 05 (n=32) 3 9,4 7 21,9 - - - - Kinh 06 (n=21) 5 23,8 - - - - - - Kinh 07 (n=21) 5 23,8 1 4,8 - - - - Khmer 01 (n=40) 6 15 1 2,5 - - - - Khmer 02 (n=34) 11 32,4 4 11,7 - - - - Khmer 03 (n=10) 3 30 2 20 - - - - Hoa (n=17) 4 23,5 3 17,6 - - - - Chăm (n=11) 3 27,3 3 27,3 - - - - Tổng (n=263) 60 22,8 31 11,8 6 2,3 2 0,8 Như vậy, tỷ lệ mang gen bệnh trong từng phả hệ, theo nhóm dân tộc và tỷ lệ mang gen bệnh chung rất cao. Có hơn 1/3 số người trong phả hệ là người mang gen, điều này sẽ tạo cơ hội dễ dàng gặp nhau của các đối tượng mang gen. Khi một cặp vợ chồng mang gen quyết định có con, theo y văn sẽ có cơ hội 25% con thể nặng, 50% con mang gen được chào đời. 18 Với các trẻ thể nặng được sinh ra, gánh nặng của gia đình và xã hội sẽ rất lớn. Trong 12 phả hệ nghiên cứu, có 15 cặp vợ chồng mang gen kết hôn. Có 2/15 (13,3%) cặp vợ chồng không có con bệnh nặng, trong 2 gia đình này có tổng 5 cá thể mang gen chào đời. 13 cặp vợ chồng còn lại, mỗi cặp có 1-5 người con thể nặng. Trẻ mắc bệnh β-Thal sẽ gặp những hậu quả nghiêm trọng về phát triển cơ thể, tuổi thọ bởi sự tan máu và các biến chứng của nó. Phương pháp điều tri ̣ hiện nay chủ yếu là truyền máu và thải sắt định kỳ. Do đó, với các gia đình có con thể nặng, việc điều trị thật sự là gánh nặng kinh tế lớn. Ngoài trừ trẻ thể nặng, ở các cặp vợ chồng mang gen, các con khác cũng là người mang gen bệnh. Các đội tượng này sẽ lại mang đến nguy cơ cao về bệnh β-Thal cho gia đình và xã hội ở thế hệ tiếp theo. Nếu đối tượng mang gen may mắn không kết hợp với người mang gen, mà là một người bình thường. Cặp vợ chồng này tuy không có nguy cơ sinh con thể nặng, nhưng lại có đến 50% cơ hội sinh con mang gen. Và như vậy, tỷ lệ mang gen bệnh trong xã hội lại không ngừng gia tăng. Tất cả điều này làm cho β-Thal là một căn bệnh di truyền nguy hiểm. Do đó, từ năm 1983, tổ chức y tế thế giới đã đưa Thalassemia là vấn đề của toàn cầu. Theo các nghiên cứu trong, ngoài nước và báo cáo của giáo sư Sunthat Fucharoen, năm 2015 ở hội nghị Thalassemia khu vực Châu Á, Thái Bình Dương, Việt Nam tỷ lệ mang gen β-Thal từ 1,6-25%, HbE từ 1- 75% tùy theo dân tộc. Mỗi năm có hơn 1.700 trẻ thể nặng chào đời tại Việt Nam. Và từ kết quả nghiên cứu của đề tài về tỷ lệ mang gen cao rất nhiều trong các gia đình có con mắc bệnh. Như vậy, ở nước ta, thalassemia đến nay có thể nói là quả bom đang bùng nổ và rất cần có một chính sách phòng bệnh được can thiệp kịp thời từ các đơn vị có chức năng. Một chiến lược phòng bệnh hiệu quả khi hạn chế được sự chào đời của các trẻ mắc bệnh thể nặng. Điều này chỉ thành công khi người mang gen được phát hiện. Các đối tượng này có kiến thức và cần chấp nhận sàng lọc trước hôn nhân cũng như sàng lọc trước sinh nếu cả hai vợ chồng đều mang gen, hay sàng lọc sau sinh cho con để xem có mang gen bệnh không nếu vợ hoặc chồng có 1 người mang gen. Bên cạnh người mang gen bệnh β-Thal, ở phả hệ Kinh 04, nghiên cứu còn ghi nhận sự xuất hiện của 6 người mang gen α-Thal và 2 người mang gen α-Thal phối hợp với β-Thal. Ở Việt Nam, khoảng 6-10% dân số mang gen α-Thal (Sunthat Fucharoen, 2015). Do đó, vẫn có nguy cơ xuất 19 hiện bệnh α-Thal trong các gia đình β-Thal và ngược lại, như trong phả hệ Kinh 04 của nghiên cứu. Theo y văn, nếu một bệnh nhân mắc bệnh β-Thal kết hợp với α-Thal do khiếm khuyết gen α, sẽ làm bệnh cảnh của β-Thal giảm xuống rất nhiều, hay tình trạng thiếu máu sẽ tăng nếu có thêm ĐB nhân đoạn α. Như vậy, việc phòng bệnh thật sự không đơn giản chỉ sàng lọc mỗi bệnh β-Thal mà bỏ qua α-Thal. 4.2.3. Tỷ lệ các kiểu đột biến trong 12 phả hệ Trong 12 phả hệ, có 145 alen mang ĐB và 6 kiểu ĐB được phát hiện (Bảng 4.6). Ngoại trừ ĐB gây bệnh α do mất đoạn –SEA được phát hiện trong gia đình mắc bệnh β-Thal Kinh 04 và một ĐB gây β0 rất hiếm gặp (δβ)del ở gia đình Chăm, 4 kiểu gây bệnh β-Thal còn lại đều là ĐB phổ biến ở Việt Nam. Trong đó βHbE chiếm tỷ lệ cao nhất (35,8%), tiếp theo là βCd41/42 (32,4%); βCd17 (17,9%) và β-28(6,2%) (Bảng 4.6). Kết quả nghiên cứu của phả hệ một lần nữa chứng minh, khu vực ĐBSCL các ĐB phổ biến vẫn chiếm đa số, bên cạnh các ĐB hiếm. Bảng 4.6. Tỷ lệ các kiểu đột biến trong 12 phả hệ Số TT Các kiểu ĐB Số alen Tỷ lệ % 1 βHbE 52 35,8 2 βCd41/42 47 32,4 3 βCd17 26 17,9 4 β-28 9 6,2 5 (δβ)del 3 2,1 6 –SEA 8 5,5 Tổng 145 100 Tỷ lệ mang gen bệnh khá cao trong các phả hệ cảnh báo gia tăng nguy cơ xuất hiện thể nặng trong các thế hệ tương lai. Đồng thời sự xuất hiện của đột biến –SEA và ĐB hiếm (δβ)del bên cạnh các ĐB phổ biến, cho thấy việc cần thiết phải sử dụng nhiều kỹ thuật khác nhau trong trường hợp chẩn đoán trước sinh bệnh β-Thal. Như vậy, nghiên cứu phả hệ kết hợp với xét nghiệm sinh học phân tử sẽ là hai công cụ đắc lực giúp bác sĩ trong tư vấn tính nguy cơ và đưa ra các chỉ định chẩn đoán bệnh cũng như chẩn đoán trước sinh phù hợp. Tóm lại, việc sàng lọc, tìm ra đối tượng nguy cơ sinh con mắc bệnh (người mang gen) và TVDT là rất cần thiết. Trong nghiên cứu này, các đối tượng mang gen sẽ được TVDT nhằm hỗ trợ trong công tác phòng bệnh. 20 4.2.4. Các thể bệnh β-Thal và kiểu hình huyết học Bảng 4.7. Tỷ lệ các thể bệnh trong 12 phả hệ STT Thể bệnh Số lượng Tỷ lệ % 1 β-Thal đồng hợp tử (βHomo) 1 0,9 2 HbE đồng hợp tử (HbEE) 2 1,7 3 β-Thal dị hợp tử kép (βThal/βThal) 2 1,7 4 Phối hợp HbE/β-Thal (βE/βThal) 17 14,8 5 β-Thal dị hợp tử (βThal/β) 60 52,2 6 HbE dị hợp tử (HbE) 31 27,0 7 β-Thal dị hợp tử/α-Thal (α/β) 2 1,7 Tổng 115 100 Nếu HbE được tách thành thể bệnh riêng và tính cả thể dị hợp tử phối hợp α/β-Thal ở phả hệ Kinh 04, trong 12 phả hệ có tổng 7 thể bệnh cần xác định kiểu hình huyết học (Bảng 4.7). * Các chỉ số huyết học Nghiên cứu ghi nhận các chỉ số huyết học có sự thay đổi khác nhau ở từng thể bệnh: Số lượng hồng cầu (RBC) thấp nhất ở 3 thể bệnh βHomo, βE/βThal, βThal/βThal <4x10 12 /L. Cao nhất là thể α/β và HbEE >5x10 12 /L. Chỉ số HCT khác nhau trong các thể bệnh, thấp nhất ở thể bệnh βThal/βThal 18,05%, cao nhất là thể HbE 38,07%. βHomo, βThal/βThal, βE/βThal là 3 thể bệnh có Hb trong máu thấp nhất: 7,24g/dL, 7,40g/dL và 7,41g/dL. Cao nhất là ở thể HbE: 12,42g/dL. Trừ thể bệnh βHomo, tất cả các thể bệnh còn lại đều có MCV<80fL và MCH<28pg. * Các chỉ số điện di 100% các thể bệnh đều có HbA giảm. Thể β-Thal đồng hợp tử, HbA là 0%, thể phối hợp α/β và thể dị hợp tử β-Thal, HbA chỉ giảm nhẹ, lần lượt là: 93,15%, 92,18%. Nhìn chung, HbA2 trung bình đều tăng >3,5% ở các thể bệnh, ngoại trừ thể đồng hợp tử βHomo và dị hợp tử kép βThal/βThal: 2% và 2,6%. Tỷ lệ HbF rất khác nhau ở các thể bệnh. Thấp nhất là ở thể đồng hợp HbEE là 0%, dị hợp tử α/β-Thal và HbE chỉ có 0,8% và 1,02%, tăng lên 2,5% ở thể dị hợp tử β-Thal. HbF tăng đến 30,76% ở trường hợp dị hợp tử kép βE/βThal và cao nhất ở thể βHomo 98%. HbE chỉ xuất hiện ở 3 thể bệnh với tỷ lệ trung bình : 26,9% ở thể dị hợp tử HbE, 39,31% ở thể βE/βThal và tăng đến 93,75% ở thể 21 đồng hợp tử HbEE. Mỗi thể bệnh trong phả hệ đều có kiểu hình huyết học khác nhau. Biểu hiện rõ sự thay đổi trong các chỉ số huyết học cũng như điện di Hb là 3 thể bệnh: β-Thal đồng hợp tử, thể β-Thal dị hợp tử kép và thể phối hợp HbE/β-Thal. Tất cả 3 thể bệnh này đều có kiểu hình thiếu máu nặng và cần truyền máu phụ thuộc, trong đó thể đồng hợp tử có biểu hiện thiếu máu nặng nhất. Thay đổi chỉ số huyết học nhẹ là thể bệnh β-Thal dị hợp tử, HbEE và thể dị hợp tử phối hợp α/β-Thal. Bên cạnh đó, nghiên cứu còn ghi nhận 3 thể bệnh này có kiểu hình thiếu máu rất nhẹ, khó chẩn đoán trên lâm sàng nếu không dựa vào chỉ số MCV, MCH và điện di Hb. Ngoài bệnh nhân thể đồng hợp tử đượ