Tóm tắt Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài sưa (dalbergia tonkinensis prain) ở Việt Nam

Tổng quan về họ đậu (Fabaceae) và chi trắc (Dalbergia) 1.1.1. Tổng quan về họ Đậu (Fabaceae) 1.1.1.1. Tổng quan về chi Trắc (Dalbergia) 1.1.1.2. Tổng quan về loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) 1.2. Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi Trắc (Dalbergia) trên thế giới CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phần này mô tả chi tiết các quá trình xử lý mẫu nguyên liệu, phương pháp nghiên cứu vi phẫu và trình tự gen, điều chế các phần chiết, phân tách sắc ký và phân lập các hợp chất, các phương pháp thử hoạt tính sinh học. 3 2.1. Đối tượng nghiên cứu Cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) được thu hái tại thành phố Buôn Ma Thuột, tỉnh Đăk Lăk. Tên khoa học của loài cây trên được xác định bởi TS. Nguyễn Quốc Bình, Bảo Tàng thiên nhiên Việt Nam, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Mẫu tiêu bản của cây được lưu trữ tại phòng tiêu bản thực vật, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật và tại phòng Hoạt chất sinh học, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, kí hiệu mẫu là C-561 và C-612. Mẫu Sưa (lá, vỏ, thân và lõi gỗ) sau khi thu hái về được rửa sạch, loại bỏ phần vỏ, chỉ lấy phần thân lõi có màu đỏ để phân lập chất, phơi khô. Sau đó mẫu được xay nhỏ và được ngâm chiết kiệt nhiều lần bằng MeOH ở nhiệt độ phòng. Sau khi cất loại dung môi, cặn cô được chiết phân đoạn với các dung môi có độ phân cực tăng dần như: n-hexan, chloroform hoặc dichloromethane, etyl acetate và nước. Sơ đồ 2.1. Xử lý mẫu và chiết tách từ lõi gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) 2.2. Các phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Nghiên cứu vi phẫu: Thực hiện tại Bộ môn Thực vật- Trường Đại học Dược Hà Nội. 2.2.2. Nghiên cứu trình tự gen: Thực hiện tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.2.3. Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết Ngâm MeOH (5 x 7,0L) n-hexane Chiết phân bố nước ethyl acetate dichloromethane Đun nước (4 x 3,0L) Lõi gỗ (3,7 kg) Bã sau khi chiết ME (11,1 g) MH (29,0 g) W (4,2 g) MW (12,0 g) MD (45,1 g) Cao methanol (120 g, M) 4 Các phương pháp đã được sử dụng như: sắc ký lớp mỏng (TLC, dùng để khảo sát), sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel pha thường (Merck loại 40-63 m) hoặc pha đảo (ODS, YMC (30-50 μm)), sắc ký cột Dianion HP-20, Sephadex LH-20. Bên cạnh đó còn dùng phương pháp kết tinh để thu chất sạch. 2.2.4. Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất Phương pháp chung để xác định cấu trúc hóa học của các chất là sự kết hợp giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại bao gồm: Phổ khối ion hóa bụi điện tử ESI-MS được ghi trên máy ghi Agilent 6310 Ion Trap, phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS được đo trên máy Agilent 6510 Q-TOF LC/MS hoặc máy MicroQ-TOF III mass spectrometer (Bruker Daltonics, Germany). Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-, 13C-và DEPT NMR) và hai chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY) được ghi trên máy Bruker Avance 500 MHz đo với TMS là chất chuẩn nội. Sử dụng các dung môi hòa tan được hoàn toàn mẫu thử chủ yếu là DMSO-d6, MeOD-d4, CDCl3. Trong luận án này chúng tôi sử dụng phổ CD (lưỡng sắc vòng - circular dichroism) để xác định cấu hình tuyệt đối của hợp chất mới. 2.2.5. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học 2.2.5.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định trên một số chủng: Bacillus subtillis, Staphylococcus aureus, Aspergillus niger, Fusarium oxyporum, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans. Thực hiện tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.2.5.2. Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme -glucosidase Thực hiện tại Khoa Dược, Trường Đại học Tam Kang, Đài Loan. Enzyme - glucosidase từ gạo, nấm men (Saccharomyces cerevisiae), vi khuẩn (B. stearothermophilus), chuột cùng với cơ chất p-nitrophenyl -D-glucopyranoside (pNPG) và acarbose mua tại hãng Sigma Aldrich, St. Louis City, MO, USA. 2.2.6. Thông số hóa lý và dữ kiện phổ các hợp chất phân lập Phần này trình bày chi tiết các dữ kiện phổ cũng như hằng số vật lý của 18 hợp chất phân lập từ lõi gỗ Sưa (Dalbergia tonkinenis Prain). 5 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Chương này trình bày các kết quả nghiên cứu về vi phẫu, DNA, kết quả phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất, hoạt tính kháng khuẩn và ức chế enzyme -glucosidase. 3.1. Kết quả nghiên cứu về vi phẫu và trình tự gen của loài Sưa (Dalbergia tonkinenis Prain) Phần này mô tả chi tiết các kết quả về hình thái vi phẫu của lá, thân và bột lõi thân của loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain). 3.1.1. Kết quả nghiên cứu vi phẫu Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu vi phẫu lá, thân và bột lõi thân của loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) thu tại Tp. Buôn Ma thuột để hỗ trợ cho việc phân loại hình thái cũng như bổ sung cơ sở dữ liệu di truyền cho loài này. Một số kết quả được trình bày ở hình dưới đây: 1- Lông che chở; 2- Biểu bì trên; 3-Mô dày trên; 4; 7- Mô cứng; 5- Gỗ; 6- Libe; 8- Mô dày dưới; 9- Mô mềm; 10- Biểu bì dưới Hình 3.1. Vi phẫu lá Sưa 11- Biểu bì trên; 12- Hạ bì trên; 13- Mô giậu; 14- Mô khuyết; 15 – Biểu bì dưới. Hình 3.2. Phiến lá Sưa 6 3.1.2. Kết quả nghiên cứu về trình tự gen Trong nghiên cứu này chúng tôi đã tiến hành xác định trình tự 3 vùng gen lục lạp rbcL, rpoB và rpoC của 2 mẫu Sưa thu tại Tp. Buôn Ma Thuột (C-561-L) và thu tại Hà Nội (C-564-L) và so sánh khoảng cách di truyền của từng vùng gen đó với 5 loài Dalbergia khác đã công bố trình tự trên GenBank. Kết quả cho thấy (hình 3.3) ba vùng gen rbcL, rpoB và rpoC là thích hợp để sử dụng cho các nghiên cứu phân loại các loài thuộc chi Sưa (Dalbergia) với tỉ lệ phân biệt lần lượt là 99%, 98% và 97%. Trình tự 3 vùng gen lục lạp rbcL, rpoB và rpoC của loài Sưa (Dalbergia tonkinenis Prain) ở Việt Nam đã được đăng ký trên ngân hàng gen với số hiệu lần lượt là KY283103, KY287755 và KY287750. Hình 3.3. So sánh khả năng phân biệt giữa các loài Dalbergia của 3 vùng gen nghiên cứu 3.2. Kết quả phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất từ lõi gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain). Phần này mô tả chi tiết kết quả phân lập, phân tích phổ và xác định cấu trúc hóa học của lõi gỗ cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain), trong đó có 02 hợp chất mới và còn lại là các hợp chất đã biết. Kết quả đã phân lập và xác định cấu trúc của 18 hợp chất từ lõi gỗ Sưa bao gồm: 08 hợp chất từ cao chiết dichloromethane, 07 hợp chất từ cao chiết ethyl acetate và 03 hợp chất từ cao nước. Cấu trúc 18 hợp chất phân lập được trình bày ở bảng 3.1. 7 Bảng 3.1. Bảng tổng hợp các hợp chất phân lập từ lõi gỗ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) . Pinocembrin Naringenin 3'-hydoxy-2,4,5-trimethoxydalbergiquinol Medicarpin Buteaspermanol Daltonkin A (2S)-8-carboxyethylpinocemprin (Chất mới) Daltonkin B (2S)-2,6-dicarboxyethylnaringenin (Chất mới) Dalbergin 8 Liquiritigenin 7,3',5'-trihydroxyflavanone Sativanone 3'-O-methylviolanone Vestitone Calycosin 7,3',4'-trihydroxyaurone (Sulfuretin) Formononetin Isoliquiritigenin 4',7-dihydroxy-3-methoxyflavone 3.2.1. Hợp chất mới daltonkin A Hợp chất daltonkin A được phân lập dưới dạng chất rắn vô định hình. Phổ khối phun bụi electron phân giải cao (HR-ESI-MS), cho pic ion giả phân tử ở m/z = 9 327,0868 [M – H]– (theo lý thuyết là 327,0863). Như vậy, công thức phân tử của hợp chất daltonkin A là C18H16O6. Phổ hồng ngoại (IR) của hợp chất daltonkin A xuất hiện các cực đại hấp thụ đặc trưng tại vị trí νmax tại 3354 và tại νmax 1701 cm-1, của các nhóm hydroxyl OH, nhóm carbonyl và kết C=C (benzene) ( νmax: 1701, 1637, 1610, 1452). Phổ tử ngoại UV cũng xuất hiện các đỉnh đặc trưng cho nối đôi liên hợp ở UV (MeOH) λmax nm (logε): 293 nm. Các tín hiệu trên phổ 1H-NMR và 13C-NMR cho thấy, ngoài các tín hiệu đặc trưng cho 2 vòng thơm A và B còn xuất hiện thêm các tín hiệu của 1 carbon methylene tại δC 44,3 (C-3), 1 tín hiệu carbon nhóm oxymethine ở vị trí δC 80,5 (C-2) và tín hiệu 1 carbon của nhóm carbonyl tại δC 197,5 (C-4) của vòng C trong phổ 13C- NMR. Điều này cho phép kết luận hợp chất daltonkin A là một flavanone. Phổ 1H và 13C-NMR của daltonkin A tương tự như hợp chất pinocembrin đã được phân lập từ loài Dalbergia odorifera, ngoại trừ sự thay thế một proton thơm H-8 trong hợp chất pinocembrin bởi một nhóm carboxyethyl (CH2CH2COOH) (H-9 [δH 2,86, t, 8,0 Hz]/C-9 [δC 18,7], H-10 [δH 2,49, t, 8,0 Hz]/C-10 [δC 34,1] và C-11 [δC 177,7]). Hình 3.4. Phổ 1H-NMR của hợp chất daltonkin A 10 Hình 3.5. Phổ 13C-NMR của hợp chất daltonkin A Hình 3.6. Phổ DEPT của hợp chất daltonkin A Mạch nhánh carboxyethyl được chứng minh thông qua các tương quan giữa proton methylene H-9 và H-10 trong phổ COSY, cũng như các tương quan giữa proton H-9 và H-10 với carbon C-11 của nhóm carbonyl trong phổ (HMBC). 11 Hình 3.7. Phổ COSY của hợp chất daltonkin A Hình 3.8. Phổ HMBC của hợp chất daltonkin A Thêm vào đó, các tương quan của proton H-9 với các carbon C-7, C-8 và C-8a trong phổ HMBC cho phép xác định nhóm carboxyethyl gắn vào vị trí C-8 của vòng A. Bảng 3.2. Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất daltonkin A Vị trí daltonkin A (*) δH (ppm) (J , Hz) δC (ppm) 2 5,47, dd, 13,0; 3,0 80,5, d 3 2,80, dd, 17,0; 3,0, H-3eq 3,11, dd, 17,0; 13,0, H-3ax 44,3, t 4 197,5, s 4a 103,3, s 5 162,8, s 6 6,02, s 95,6, d 7 166,1, s 8 108,5, s 8a 162,8, s 9 2,86, t, 8,0 18,7, t 10 2,49, t, 8,0 34,1, t 11 177,7, s 9' 10' 11' 1' 140,5, s 2',6' 7,52, d, 7,5 127,3, d 4' 7,39, t, 7,5 129,6, d 3',5' 7,44, d, 7,5 129,7, d (*)1H-NMR (500 MHz, methanol-d4); 13C-NMR (125 MHz, methanol-d4) 12 Các nghiên cứu trước đây cho thấy các flavanone cấu hình 2S trên phổ CD (lưỡng sắc vòng - circular dichroism) thường có hiệu ứng Cotton dương trong vùng gần 330 nm (n–*) và hiệu ứng Cotton âm ở vùng 270–290 nm. Phổ CD (c 0,4, MeOH) của hợp chất daltonkin A (hình 3.9) cho thấy có hiệu ứng Cotton dương tại 330 + 2,10 (n–*) và hiệu ứng Cotton âm tại 288 – 10,43 (– * ). Như vậy, hợp chất flavanone daltonkin A có cấu hình 2S. Hình 3.9. Phổ CD của hợp chất daltonkin A Qua phân tích tổng hợp các dữ liệu phổ trên cho phép xác định hợp chất daltonkin A là (2S)-8-carboxyethylpinocembrin, đây là một hợp chất mới lần đầu tiên phân lập từ thiên nhiên. Hình 3.10. Cấu trúc hóa học của hợp chất daltonkin A Hình 3.11. Các tương tác HMBC (H→C) và COSY (H→H) của hợp chất daltonkin A 13 3.2.2. Xác định cấu trúc hợp chất mới daltonkin B Hợp chất daltonkin B được phân lập dưới dạng chất bột vô định hình màu trắng. Phổ hồng ngoại (IR) của hợp chất daltonkin B xuất hiện các cực đại hấp thụ đặc trưng cho nhóm hydroxyl OH (νmax 3369 cm-1) và nhóm carbonyl C=O (νmax 1751 cm-1) và liên kết C=C (benzene) (νmax, 1751, 1676, 1575 cm-1). Phổ tử ngoại UV tương tự hợp chất daltonkin A cũng xuất hiện các đỉnh đặc trưng cho nối đôi liên hợp ở UV (MeOH) λmax nm (logε): 297 nm. Phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS) của hợp chất daltonkin B cho pic ion giả phân tử ở m/z = 415,1014 [M – H]– (tính toán là 415,1024). Công thức phân tử của hợp chất daltonkin B là C21H19O9. Hình 3.12. Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS của hợp chất daltonkin B Tương tự như hợp chất daltonkin A, các tín hiệu carbon của hợp chất này đặc trưng cho một khung flavanone bao gồm: 1 tín hiệu của carbon methylene tại δC 44,0 (C-3), 1 tín hiệu carbon nhóm oxymethine ở vị trí δC 80,3 (C-2) và 1 tín hiệu carbon của nhóm carbonyl tại δC 197,5 (C-4) trong phổ 13C-NMR. Phổ 1H và 13C-NMR của daltonkin B có các tín hiệu tương tự như của flavanone narigenin, được phân lập từ loài Dalbergia odorifera, ngoại trừ sự thay thế hai proton của vòng benzene (H-6 và H-8) trong hợp chất narigenin bởi tín hiệu của hai nhóm carboxyethyl (H-9 [δH 2,85, m]/C-9 [δC 18,8], H-10 [δH 2,55, m]/C-10 [δC 34,4], và C-11 [δC 179,1]) và (H-9' [δH 2,81, m]/C-9' [δC 19,4], H-10' [δH 2,51, 14 m]/C-10' [δC 34,8] và C-11' [δC 179,2]). Các số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất daltonkin B được trình bày trong (bảng 3.3). Hình 3.13. Phổ 1H-NMR của hợp chất daltonkin B Hình 3.14. Phổ 13C-NMR của hợp chất daltonkin B Các dữ kiện phổ 2 chiều HSQC, HMBC, COSY được sử dụng để xác định cấu trúc khung flavanone, 2 nhóm carboxyethyl và vị trí của gắn của chúng với vòng A của daltonkin B. Trên phổ COSY ta thấy rõ tương quan giữa các proton methylene H- 9/H-10 và H-9'/H-10'. Phổ HMBC khẳng định có hai nhóm carboxyethyl qua các tương tác giữa các proton methylene H-9 và H-10 với carbonyl carbon C-11 cũng như tương tác của proton H-9' và H-10' với carbon C-11'. Vị trí gắn kết của hai nhóm carboxyethyl được xác định qua tương tác giữa proton H-9' với các carbon C-5, C-6 và C-7, cũng như các tương tác của proton H-9 với C-7, C-8 và C-8a trên phổ 15 HMBC. Các tương tác đó cho phép kết luận hai nhóm carboxyethyl gắn vào vị trí C-6 và C-8 của vòng A. Hình 3.15. Phổ COSY của hợp chất daltonkin B Hình 3.16. Phổ HMBC của hợp chất daltonkin B Bảng 3.3. Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất daltonkin B Vị trí daltonkin B (*) δH (ppm) (J , Hz) δC (ppm) 2 5,39, dd, 13,0, 3,0 80,3, d 3 2,79, dd, 17,0, 3,0, H-3eq 3,13, dd, 17,0, 13,0, H-3ax 44,0, t 4 198,6, s 4a 103,4, s 5 159,8, s 6 109,0, s 7 163,9, s 8 108,3, s 8a 161,1, s 9 2,85, m 18,8, t 10 2,55, m 34,4, t 11 179,1, s 9' 2,81, m 19,4, t 10' 2,51, m 34,8, t 11' 179,2, s 1' 131,4, s 2',6' 7,36, d, 8,5 128,8, d 4' 158,9, s 3',5' 6,85, d, 8,5 116,4, d (*)1H-NMR (500 MHz, methanol-d4); 13C-NMR (125 MHz, methanol-d4) 16 Tương tự daltonkin A, hợp chất daltonkin B được xác định có cấu hình 2S. Như vậy, cấu trúc của hợp chất mới daltonkin B được xác định. Hợp chất dicarboxyethylflavanone mới này có tên gọi là (2S)-6,8- dicarboxyethylnaringenin, lần đầu được phân lập trong tự nhiên. Hình 3.17. Cấu trúc hóa học của hợp chất daltonkin B Hình 3.18. Các tương tác HMBC (H→C) và COSY (H→H) của hợp chất daltonkin B 3.2. Đánh giá tác dụng sinh học 3.2.1. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn Các hợp chất pinocembrin, naringenin và 3'-hydroxy-2,4,5- trimethoxydalbergiquinol phân lập từ lõi gỗ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) được thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định trên một số chủng. Kết quả (bảng 3.4) cho thấy hợp chất pinocembrin biểu hiện hoạt tính ức chế mạnh đối với hai chủng nấm mốc và Fusarium oxyporum và Aspergillus niger với nồng độ ức chế tối thiểu MIC = 50 µg/mL. Loài nấm Fusarium oxyporum là loại gây bệnh thối cổ rễ. Một trong các bệnh gây hại nhiều đến mùa màng nước ta. Còn đối với các chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans và vi khuẩn Gram dương Staphylococcus aureus thì hợp chất pinocembrin cho thấy khả năng ức chế trung bình với giá trị MIC=100µg/mL. Hợp chất naringenin có tác dụng ức chế vửa phải đối với chủng vi khuẩn Gram dương Staphylococcus aureus và chủng nấm mốc Aspergillus niger. Trong khi đó hợp chất 3'-hydroxy-2,4,5- 17 trimethoxydalbergiquinol không thể hiện hoạt tính kháng vi sinh vật trên các chủng thử nghiệm. Bảng 3.4. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các hợp chất phân lập từ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) (-): IC50 ≥ 200 µg/mL 3.2.2. Tác dụng ức chế enzyme -glucosidase  Cao chiết methanol của lõi gỗ, vỏ và lá của loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) đã được đánh giá hoạt tính ức chế enzyme -glucosidase, trong đó cao chiết methanol của lõi gỗ có tác dụng mạnh nhất với giá trị IC50 là 0,17 mg/mL, so với chất đối chứng dương là acabose (IC50 là 1,21 mg/mL). A Concentration (mg/mL) 0 1 2 3 4 5 a G I (% ) 0 20 40 60 80 100 Heartwood Trunk bark Leaves Acarbose B Part used Heartwood Bark Leaves Acarbose E C 5 0 ( m g /m L ) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 0.17 0.57 0.78 1.25 Nồng độ (mg/mL) A Concentration (mg/mL) 0 1 2 3 4 5 a G I (% ) 0 20 40 60 80 100 Heartwood Trunk bark Leaves Acarbose B Part used Heartwood Bark Leaves Acarbose E C 5 0 ( m g /m L ) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 0.17 0.57 0.78 1.25 Lõi gỗ Vỏ Lá Acarbose Hình 3.19. Khả năng ức chế α-glucosidase của các bộ phận loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain)  Đánh giá tác dụng ức chế enzyme -glucosidase của các phân đoạn cao chiết methanol lõi gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) Hợp chất Hoạt tính kháng khuẩn (MIC: µg/mL) Vi khuẩn Nấm mốc (sợi) Nấm men Bacillus subtillis Staphylococcus aureus Aspergillus niger Fusarium oxyporum Saccharomyces cerevisiae Candida albicans pinocembrin (-) 100 50 50 100 100 naringenin (-) 100 100 (-) (-) (-) 3'-hydroxy- 2,4,5- trimethoxydalbe rgiquinol (-) (-) (-) (-) (-) (-) Lõi gỗ Vỏ Lá Acarbose IC50 (mg/mL) Ức chế (%) 18 Bảng 3.5. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của các cao phân đoạn từ lõi gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) Mẫu Ức chế enzyme α-glucosidase IC50 (mg/mL) ức chế (%)* HDT (cao methanol) 0,172±0,011 98±3,2 HDT-1 (cao phân đoạn hexane) 1,712±0,210 73±4,1 HDT-2 (cao phân đoạn dichloromethane ) 0,124±0,003 90±2,5 HDT-3 (cao phân đoạn ethyl acetate ) 0,069±0,001 95±3,7 HDT-4 (cao phân đoạn nước) 0,513±0,051 82±2,3 Acarbose (đối chứng dương) 1,357 62 (*): Khả năng ức chế của acarbose và các phân đoạn được xác định trong khoảng nồng độ 0,1-5 mg/mL. Từ bảng 3.5 cho thấy cao chiết ethyl acetate (HDT-3) có hoạt tính ức chế mạnh nhất tương ứng 95% và giá trị IC50 là 0,069 mg/mL. Dựa trên đánh giá sắc ký lớp mỏng. Chúng tôi chọn cao chiết phân đoạn này và cao chiết nước để phân lập các hợp chất theo định hướng tác dụng sinh học. Kết quả từ hai phân đoạn 3.1.2 và 4.3.3, 02 hợp chất sativanone và formononetin đã được phân lập. Tác dụng ức chế enzyme α- glucosidase của 2 hợp chất này so với acarbose được thể hiện trong hình 3.20. Hình 3.20. Tác dụng ức chế α-glucosidase của các cao phân đoạn và hợp chất phân lập từ lõi gỗ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) A 3 .1 3 .2 3 .3 3 .4 3 .5 3 .6 3 .7 3 .8 3 .9 3 .1 0 3 .1 1 3 .1 2 a G I (% ) 0 20 40 60 80 100 Sub-fractions of HDT-3 B 3 .1 .1 3 .1 .2 3 .1 .3 3 .1 .4 3 .1 .5 3 .1 .6 3 .1 .7 3 .1 .8 a G I (% ) 0 20 40 60 80 100 Components separated from HDT-3.1 C 4 .1 4 .2 4 .3 4 .4 4 .5 4 .6 4 .7 4 .8 a G I (% ) 0 20 40 60 80 100 Sub-fractions of HDT-4 D 4 .3 .1 4 .3 .2 4 .3 .3 4 .3 .4 4 .3 .5 4 .3 .6 a G I (% ) 0 20 40 60 80 100 Components separated from HDT-4.3 E Concentration (mg/mL) 0 1 2 3 4 5 a G I (% ) 0 20 40 60 80 100 Compound 1 (purified HDT-3.1.2) Compound 2 (purified HDT-4.3.3) Acarbose (positive control) Các phân đoạn HDT-3 Các phân đoạn HDT-3.1 Các phân đoạn DT-4 Các phân đoạn HDT-4.3 Nồng độ (mg/mL) Ức chế (%) Ức chế (%) Sativanone Formononetin Acarbose 19 Từ hình 3.20, thấy rằng khả năng ức chế α-glucosidase của 2 hợp chất sativanone và formononetin mạnh hơn acarbose (chất đối chứng dương) với tỉ lệ ức chế và giá trị IC50 lần lượt (90%, 0,23 mg/mL), (98%, 0,059 mg/mL) so với acarbose (62%, 1,321 mg/mL). Đây là 2 hợp chất lần đầu được phân lập từ lõi gỗ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain).  Kết quả thử hoạt tính chức chế enzyme α-glucosidase của 2 hợp chất phân lập từ lõi gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) trên các enzyme α- glucosidase từ các nguồn khác nhau Bảng 3.6. Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của sativanone và formononetin so với acarbose trên 4 nguồn enzyme α-glucosidase khác nhau STT Nguồn enzyme Khả năng ức chế tính theo IC50 (mg/mL) Sativanone Formononetin Acarbose 1 Nấm men 0,23±0,012 0,06±0,002 1,321±0,048 2 Chuột 0,37±0,022 0,23±0,037 0,121±0,001 3 Vi khuẩn 0,07±0,001 0,03±0,002 0,001±0,000 4 Gạo 0,81±0,023 0,98±0,029 0,031±0,005 (-) không có tác dụng; tất cả thử nghiệm được tiến hành 3 lần Nhận xét: trong thí nghiệm này enzyme α-glucosidase từ nấm men, từ chuột, từ vi khuẩn và từ gạo đã được sử dụng để đánh giá tác dụng chống đái tháo đường in vitro của các hoạt chất phân lập từ lõi gỗ cây Sưa. Kết quả cho thấy 2 hợp chất này đều có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase từ 4 nguồn enzyme α-glucosidase của nấm men, chuột, vi khẩn và gạo. Enzyme α-glucosidase từ nấm men đã được sử dụng làm enzyme đích để sàng lọc chống đái tháo đường trong thử nghiệm in vitro đã được báo cáo. Tuy nhiên, α- glucosidase từ chuột được cho là nguồn enzyme tốt hơn để đánh giá các chất ức chế mạnh vì enzyme này tương tư với enzyme của người. Trong nghiên cứu này, cả sativanone và formononetin đã chứng minh khả năng sự ức chế enzyme α- glucosidase mạnh hơn so với acarbose, kết quả cũng cho thấy các tác dụng tương đương của chúng đối với acarbose trên enzyme α-glucosidase của chuột. 20 Bảng 3.7. Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase trên chuột của các cao chiết các bộ phận và 2 hợp chất từ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) Thành phần Khả năng ức chế enzyme α-glucosidase trên chuột IC50 (mg/mL ) Ức chế cực đại (%) Cao chiết methanol lõi gỗ 1,72±0,116 61±3,46 Cao chiết methanol vỏ 2,91±0,289 51±4,62 Cao chiết methanol lá 2,78±0,173 54±4,60 Phân đoạn EtOAc (HDT-3) 1,31±0,057 68±5,77 HDT-3.1 1,13±0,057 75±5,20 HDT-3.1.2 0,92±0,023 77±5,18 Sativanone 0,357±0,006 91±4,61 Cao nước (HDT-4) 1,43±0,115 67±2,89 HDT-4.3 0,87±0,035 78±4,61 HDT-4.3.3 0,55±0,012 84±6,42 Fomononetin 0,251±0,006 94±5,11 Acarbose 0,119±0,005 93±2,50 Kết quả bảng 3.7 cho thấy rằng các cao chiết tổng methanol của lõi gỗ và 2 hợp chất sativanone và formononetin từ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) là các tác nhân ức chế enzyme α-glucosidase mạnh và có tiềm năng phát triển thành chế phẩm hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường trong tương lai. 21 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Về kết quả nghiên cứu thực vật - Các đặc điểm vi phẫu của lá, thân và bột lõi thân của cây Sưa đã được miêu tả cụ thể, góp phần tiêu chuẩn hóa loài cây gỗ quý này. - Đã xác định trình tự 03 vùng gen lục lạp rbcL, rpoB và rpoC của 2 mẫu Sưa và so sánh khoảng cách di truyền của từng vùng gen đó với 05 loài Dalbergia khác đã công bố trình tự trên GenBank. - 03 vùng gen lục lạp rbcL, rpoB và rpoC có khả năng phân biệt các loài thuộc chi Sưa (Dalbergia) với tỉ lệ tương ứng lần lượt là 99%, 98% và 97%. - Trình tự 03 vùng gen rbcL, rpoB và rpoC của loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) ở Việt Nam đã được đăng ký trên ngân hàng gen với số hiệu lần lượt là KY283103, KY287755 và KY287750. 2. Về mặt hóa học - Lần đầu tiên từ lõi gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 18 hợp chất flavonoid: pinocembrin, naringenin, 3'-hydroxy- 2,4,5-trimethoxydalbergiquinol, medicarpin, buteaspermanol, daltonkin A [(2S)- 8-carboxyethylpinocembrin], daltonkin B [(2S)-2,6-dicarboxyethylnaringenin], dalbergin, isoliquiritigenin, 7,3',5'-trihydroxyflavanone, vestitone, calycosin, 4',7- dihydroxy-3-methoxyflavone, liquiritigenin, sativanone, 3'-O-methylviolanone, 7,3',4'-trihydroxyaurone và formononetin. - 02 hợp chất daltonkin A và daltonkin B là các hợp chất mono- và di- carboxyethylflavanone mới. 3. Tác dụng sinh học của các cao chiết và hợp chất phân lập được - Tác dụng kháng khuẩn Hợp chất pinocembrin biểu hiện hoạt tính ức chế trên nấm sợi (với nồng độ ức chế tối thiểu [MIC] là 50 µg/mL), trong khi đó đối với nấm men và vi khuẩn Gram dương staphylococcus aureus thì hợp chất pinocembrin và naringenin cho thấy khả năng ức chế trung bình với giá trị MIC là 100 µg/mL. - Tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase 22 - Cao chiết methanol của lõi gỗ, vỏ và lá của loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) đã được đánh giá hoạt tính ức chế enzyme - glucosidase, trong đó cao chiết methanol của lõi gỗ có tác dụng mạnh nhất với giá trị IC50 là 0,17 mg/mL, so với chất đối chứng dương là acabose (IC50 là 1,21 mg/mL). - Phân lập theo định hướng ức chế enzyme α-glucosidase đã xác định 2 hợp chất sativanone và formononetin có khả năng mạnh hơn acarbose (chất đối chứng dương) với tỉ lệ ức chế và giá trị IC50 lần lượt của sativanone (90%, 0,23 mg/mL) và của formononetin (98%, 0,06 mg/mL) so với acarbose (62%, 1,321 mg/mL). - Cao chiết methanol từ lõi gỗ Sưa (HDT) có tác dụng ức chế enzyme α- glucosidase trên chuột mạnh hơn của vỏ và lá với IC50 là 1,72 mg/ mL. - Sativanone và formononetin có tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase của chuột với tỉ lệ ức chế và giá trị IC50 lần lượt (91%, 0,357 mg/mL), (9