Tóm tắt Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài trichosanthes baviensis gagnep. (qua lâu ba vì), trichosanthes anguina l. (dưa núi) và trichosanthes kirilowii maxim. (qua lâu nhân)

loài, trong đó có khoảng 1/3 trên tổng số loài được nhân dân dùng làm thuốc. Rất nhiều loài trong số đó từ xa xưa đến nay đã được sử dụng trong y học cổ truyền và các mục đích khác phục vụ đời sống của con người như mật nhân Eurycoma longifolia, bạc hà Mentha arvensis, khổ qua Momordica charantia, ngũ da bì hương Acanthopanax trifoliatus, đương quy Angelica sinensis, sâm Ngọc Linh Panax vietnamensis, thìa canh Gymnema sylvestre, đã trở nên rất quen thuộc. Ngoài sự phong phú về thành phần chủng loại, nguồn dược liệu Việt Nam còn có giá trị to lớn trong việc điều trị các căn bệnh khác nhau trong dân gian. Các cây thuốc được sử dụng dưới hình thức độc vị hay phối hợp với nhau tạo nên các bài thuốc cổ phương, đang tồn tại phát triển đến ngày nay. Ngoài ra, hàng trăm cây thuốc đã được khoa học y - dược hiện đại chứng minh về giá trị chữa bệnh của chúng. Trong vài thập kỉ qua, y học cổ truyền đã cung cấp cho thuốc Tây với hơn 40% tổng các loại thuốc. Do đó, các nghiên cứu đã tập trung vào việc đánh giá khoa học của các loại thuốc truyền thống có nguồn gốc thực vật. Trong số các loài thực vật kể trên, nhiều loài thuộc chi Qua lâu (Trichosanthes) được trồng rộng rãi và nhiều loài mọc tự nhiên ở nước ta và các nước trong khu vực. Trong dân gian, một số loài thuộc chi Qua lâu được sử dụng làm rau ăn, một số loài được sử dụng làm thuốc chữa bệnh như: làm thuốc giải nhiệt, lợi tiểu, lợi sữa, giảm đường huyết hoặc chữa bệnh ngoài da, chữa bệnh đau đầu. Nhằm mục đích nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học và hoạt 2 tính sinh học của một số loài thuộc chi Qua lâu (Trichosanthes), tôi đã lựa chọn tên luận án: ‘‘Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Trichosanthes baviensis Gagnep. (Qua lâu Ba Vì), Trichosanthes anguina L. (Dưa núi) và Trichosanthes kirilowii Maxim. (Qua lâu nhân)”. Mục tiêu của luận án: Xác định thành phần hóa học chủ yếu của ba loài T. baviensis, T. anguina và T. kirilowii ở Việt Nam. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư và hoạt tính ức chế enzym tyrosinase của các hợp chất phân lập được để tìm kiếm hợp chất có hoạt tính sinh học. Nội dung luận án bao gồm: 1. Phân lập các hợp chất từ ba loài thuộc chi Trichosanthes bằng các phương pháp sắc ký. 2. Xác định cấu trúc hoá học các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp hoá lý. 3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư và hoạt tính ức chế enzym tyrosinase của các chất phân lập được. Bố cục của luận án - Phần mở đầu: 2 trang (1 → 2). - Tổng quan: 26 trang (3→ 28). - Thực nghiệm và kết quả: 22 trang (30 → 51). - Thảo luận kết quả: 65 trang (52 → 116). - Kết luận: 2 trang (118, 119). - Tài liệu tham khảo: 86 tài liệu. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN Bao gồm phần tổng quan về các nghiên cứu trong nước và quốc tế về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài thuộc chi Trichosanthes. 1.1. Giới thiệu về chi Trichosanthes 1.1.1. Đặc điểm thực vật của chi Trichosanthes Chi Qua lâu (Trichosanthes) là một chi lớn trong họ Bầu bí (Cucurbitaceae), bao gồm khoảng 100 loài và đang được các nhà 23  5 hợp chất đã biết lần đầu tiên phân lập từ chi Trichosanthes: kaemferol 3-O-β-D-glucopyranoside (1→3) O-β-D-glucopyranoside (TA7), corchoionoside B (TA3), icariside B5 (TA4) và (3R,9S) 3,9- dihydroxymegastigman-5-ene 9-O-β-D-glucopyranoside (TA5), isopentyl 1-O-β-D-glucopyranoside (TA8); 1 hợp chất đã biết: icariside B1 (TA6). 3. Đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học của 8 hợp chất từ loài T. kirilowii (TK1-TK8), cụ thể:  1 hợp chất mới: trichobenzolignan (hợp chất lignan) (TK1)  3 hợp chất đã biết lần đầu tiên phân lập từ chi Trichosanthes, arvenin I (TK8), ligballinol (TK2) và ehletianol C (TK4); 4 hợp chất đã biết: (-)-pinoresinol (TK3), luteolin-7-O-glucoside (TK5), chrysoeriol-7-O-β-D-glucoside (TK6) và 10α-cucurbita-5,24-dien- 3β-ol (TK7). 4. Đã nghiên cứu hoạt tính ức chế enzym tyrosinase của các hợp chất phân lập được từ loài T. baviensis. Kết quả cho thấy, hợp chất TB6 thể hiện hoạt tính ức chế enzym tyrosinase rất mạnh với IC50 là 3,9 ± 1,5 µM. Các hợp chất TB3, TB4 và TB10 thể hiện hoạt tính mạnh với IC50 tương ứng là 6,9 ± 2,2, 9,5 ± 3,1, 9,3 ± 2,1 µM. Các hợp chất TB1, TB2, TB5, TB7, TB8 và TB9 thể hiện hoạt tính tương đối với IC50 tương ứng là 14,5 ± 3,4, 11,4 ± 2,8, 10,3 ± 2,5, 11,5 ± 4,1, 16,7 ± 2,1, 10,1 ± 3,1 µM. Đây là lần đầu tiên các hợp chất phân lập từ loài T. baviensis được nghiên cứu hoạt tính ức chế enzym tyrosinase. 5. Đã nghiên cứu hoạt tính ức chế enzym tyrosinase của các hợp chất phân lập được từ loài T. anguina. Kết quả cho thấy hợp chất TA7 có hoạt tính ức chế mạnh hơn cả chất đối chứng dương kojic acid (IC50 là 14,6 ± 3,3 µM) với IC50 là 8,5±3,3 µM. Các hợp chất từ TA1 đến TA6 thể hiện hoạt tính yếu hơn với giá trị IC50 trong khoảng 21,3 đến 46,7 µM. Hợp chất TA8 không thể hiện hoạt tính ở nồng độ nghiên cứu. 6. Đã tiến hành đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư người A- 549, HT-29, OVCAR và MCF-7 của 8 hợp chất (TK1 -TK8). Hợp chất triterpenoid TK7 thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển các tế bào ung thư mạnh nhất, đặc biệt là 2 dòng tế bào HT-29 và OVCAR 22 Các hợp chất trên đã được đánh giá khả năng ức chế sự phát triển một số dòng tế bào ung thư người bao gồm: tế bào ung thư phổi A-549, tế bào ung thư ruột kết HT-29, tế bào ung thư buồng trứng OVCAR và tế bào ung thư vú MCF-7. Hợp chất mitoxantrone, một hợp chất chống ung thư được sử dụng để so sánh. Kết quả nghiên cứu cho thấy, hợp chất triterpenoid TK7 thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển các tế bào ung thư mạnh nhất, đặc biệt là 2 dòng tế bào HT-29 và OVCAR với IC50 tương ứng là 4,1 và 6,5 µM, tương đương mitoxantrone (IC50 tương ứng là 3,1 và 8,4 µM). Trên dòng tế bào A-549, hợp chất TK5 thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển rất mạnh với IC50 là 2,7 µM, mạnh hơn cả mitoxantrone (IC50 là 7,2 µM). Hợp chất TK1, TK6 và TK8 thể hiện hoạt tính ức chế yếu hơn với IC50 trong khoảng 14,7-49,4 µM. Các hợp chất TK2 và TK3 thể hiện hoạt tính yếu với dòng tế bào A-549 và HT-29. Hợp chất TK4 không thể hiện hoạt tính ở nồng độ thử nghiệm phù hợp với kết quả đã công bố [86]. KẾT LUẬN 1. Đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học của 14 hợp chất (TB1-TB14) từ loài T. baviensis, cụ thể:  1 hợp chất mới: 9,26-epoxymultiflorenol (triterpene) (TB1).  8 hợp chất đã biết lần đầu tiên phân lập từ chi Trichosanthes: β-amyrin acetate (TB2), lup-20(29)-en-3β-ol (TB6), ergosta-6,22- dien-3β,5α,8α-triol (TB3), nicotiflorin (TB12), (+)-lyoniresinol 9'-O- β-D-glucopyranoside (TB7), (-)-lyoniresinol 9'-O-β-D- glucopyranoside (TB8), demethoxybergenin (TB9), icariside F2 (TB11); 5 hợp chất đã biết: spinasterol (TB4), 4α,14α-dimethyl- 9,19-cyclo-5α,9β-ergost-24(28)-en-3β-ol (TB5), bergenin (TB10), (6S,9S)-roseoside (TB13) và thymidine (TB14). 2. Đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học của 8 hợp chất từ loài T. anguina (TA1-TA8), cụ thể:  2 hợp chất mới: tricanguina A (TA1) và tricanguina B (TA2) (dẫn xuất coumarin). 3 khoa học trên thế giới rất quan tâm. Theo thống kê và mô tả sơ bộ của GS. Phạm Hoàng Hộ, Việt Nam có khoảng 12 loài Trichosanthes trong đó có 2 loài đặc hữu của Việt Nam là qua lâu Ba Vì (T. baviensis) và qua lâu Pierre (T. pierrei) [1]. 1.1.2. Tình hình sử dụng trong y học cổ truyền các loài thuộc chi Trichosanthes. Một số loài trong chi Qua lâu (T. ovigera Blume, T. cucumerina L.) đã được trồng rộng rãi và sử dụng quả làm rau ăn. Nhiều loài đã được dùng trong dân gian làm thuốc giải nhiệt, lợi tiểu, lợi sữa, giảm đường huyết, chữa bệnh ngoài da, bệnh đau đầu, ... 1.1.3. Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Trichosanthes Trong những năm gần đây, cũng đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học một số loài thuộc chi Trichosanthes. Theo những công trình đã được công bố cho thấy, thành phần hóa học của chi Trichosanthes, bao gồm các nhóm chất chính như: triterpenoid, steroid, flavonoid, lignan, các hợp chất có nitơ và một số hợp chất khác. Trong đó lớp chất triterpenoid, đặc biệt là các hợp chất khung cucurbitane là các hợp chất khá phổ biến trong các loài thuộc chi Trichosanthes đã được nghiên cứu. Các nghiên cứu thành phần hóa học chủ yếu tập trung ở 8 loài: T. anguina, T. cucumerina, T. cucumeroides, T. dioica, T. fructus, T. kirilowii, , T. pericarpium và T. tricuspidata. Chi tiết các tổng quan về thành phần hóa học xem ở Luận án. 1.1.3.1. Các hợp chất triterpenoid Theo các công trình đã công bố, có 64 hợp chất triterpenoid 1-64 đã phân lập được từ bốn loài T. cucumerina, T. kirilowii, T. tricuspidata, và T. anguina. 1.1.3.2. Các hợp chất steroid Theo các công trình đã công bố, có 26 hợp chất steroid 65-90 đã phân lập được từ bốn loài T. dioica, T. kirilowii, T. rosthornii và T. tricuspidata. 4 1.1.3.3. Các hợp chất flavonoid Theo các công trình đã công bố, có 20 hợp chất flavonoid 91-110 đã phân lập được từ 2 loài T. kirilowii và T. pericarpium. 1.1.3.4. Các hợp chất lignan Theo các công trình đã công bố, có 5 hợp chất lignan 110- 114 đã phân lập được từ loài T. kirilowii. 1.1.3.5. Các hợp chất có chứa nitơ Theo các công trình đã công bố, có 17 hợp chất có chứa nitơ 115-131 đã phân lập được từ loài T. kirilowii. 1.1.4. Hoạt tính sinh học của chi Trichosanthes Các nghiên cứu trên thế giới chủ yếu tập trung vào 8 loài thuộc chi Trichosanthes và cho thấy các hợp chất phân lập từ các loài thuộc chi Trichosanthes có hoạt tính mạnh. Một số hoạt tính đáng quan tâm như gây độc tế bào ung thư, kháng viêm, kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hoá trong đó, nổi bật là hoạt tính gây độc tế bào ung thư với khả năng ức chế mạnh trên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau. 1.1.4.1. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư 1.1.4.2. Hoạt tính kháng viêm 1.1.4.3. Tác dụng chống oxy hóa 1.1.4.4. Tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm Chi tiết các tổng quan về hoạt tính sinh học xem ở Luận án. 1.1.5. Tình hình nghiên cứu về chi Trichosanthes ở Việt Nam Theo các tài liệu đã công bố, chi Trichosanthes ở Việt Nam có 2 loài là T. kirilowii và T. tricuspidata đã được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. 1.2. Giới thiệu về loài T. baviensis, T. anguina và T. kirilowii 1.2.1. Loài T. baviensis 1.2.2. Loài T. anguina 1.2.3. Loài T. kirilowii 21 triển vọng ứng dụng trong ngành công nghiệp mỹ phẩm, bảo vệ da khỏi những tác nhân bên ngoài môi trường. Các kết quả nghiên cứu sẽ góp phần đưa đến cơ hội ứng dụng trong sản xuất thuốc điều trị những căn bệnh có liên quan về rối loạn sắc tố da. 3.2.2. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được từ loài T. kirilowii Theo các nghiên cứu trước đây, các hợp chất phân lập từ loài T. kirilowii thể hiện nhiều hoạt tính lý thú đặc biệt là hoạt tính gây độc tế bào ung thư. Các nghiên cứu trên dòng tế bào ung thư đã công bố bao gồm: A-549, SK-OV-3, SK-MEL-2, XF-498, HCT-15, UO- 31, CCRF-CEM, SR, NCI-H460, NCI-H522, HCT-116, U251, OVCAR-3, OVCAR-6, SN12C, SK-Mel-2, B16F1, ung thư vú (SR- BR-3, MCF-7, T47D và MDA-MB-435), ung thư ruột kết (Caco-2) [4], [14], [37]. Trong số các hợp chất được phân lập từ loài T. kirilowii, hợp chất karounidiol (45) thể hiện hoạt tính mạnh trên rất nhiều dòng ung thư như ức chế ung thư biểu mô tế bào thận (UO-31 với IC50 là 1,98 μM), bệnh bạch cầu (CCRF-CEM với giá trị IC50 1,63 μM; SR (CRL-2262) với giá trị IC50 1,75 μM), ung thư phổi (A- 549 với giá trị IC50 1,76 μM; NCI-H460 với giá trị IC50 1,91 μM, NCI-H522 với giá trị IC50 3,56 μM), ung thư đại tràng (HCT-116 với giá trị IC50 2,01 μM), ung thư thần kinh trung ương (U251 với giá trị IC50 2,02 μM), ung thư buồng trứng (OVCAR-3 với giá trị IC50 1,79 μM; OVCAR-6 với giá trị IC50 2,06 μM) và ung thư thận (SN12C với giá trị IC50 2,36 μM) [14]. Theo một công bố khác, hợp chất isoetin 5'-methyl ether (93) phân lập được năm 2007 đã thể khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư phổi A-549, ung thư da ác tính SK-Mel-2 và tế bào ung thư chuột ác tính B16F1 với giá trị IC50 lần lượt là 0,92, 8,00, 7,23 µg/mL [29] Trong số các hợp chất phân lập (TK1-TK8) từ loài T. kirilowii, trichobenzolignan (TK1) là hợp chất mới, ligballinol (TK2), ehletianol C (TK4) và arvenin I (TK8) lần đầu tiên được phân lập từ loài này. Các tra cứu về các hợp chất TK6, TK7 và TK8 cho thấy chưa có đánh giá nào về tác dụng gây độc tế bào ung thư. 20 Nghiên cứu của Khan và các cộng sự vào 2005 đã phân lập được tám hợp chất cycloartane triterpenoid và tiến hành thử hoạt tính ức chế enzym tyrosinase. Kết qủa cho thấy bảy trong số tám chất có khả năng ức chế tốt hơn chất đối chứng kojic acid (IC50 = 16,67±0,52); một chất có hoạt tính rất mạnh, IC50 = 1,32 ± 0,37 [84]. Năm 2014, Khan và các cộng sự đã phân lập được chất β- amyrin acetate (TB2) từ quả của loài Madhuca latifolia và tiến hành thử hoạt tính ức chế enzym tyrosinase. Kết qủa cho giá trị IC50 = 23,12±0,07 [85]. Trong một công bố của Park và các cộng sự năm 2017, hợp phần bergenin trong một số mỹ phẩm có khả năng ức chế sự phát triển của enzym tyrosinase. Từ kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học của loài T. Baviensis-một loài đặc hữu tại Việt Nam, cho thấy tất cả các hợp chất đều thể hiện hoạt tính ức chế mạnh enzym tyrosinase. Các hợp chất nghiên cứu có hoạt tính ức chế mạnh hơn cả chất đối chứng dương kojic acid (IC50 là 14,6 ± 3,3 µM). Cụ thể: hợp chất TB6 thể hiện hoạt tính ức chế enzym tyrosinase mạnh nhất với IC50 là 3,9 ± 1,5 µM. Các hợp chất TB3, TB4 và TB10 thể hiện hoạt tính yếu hơn với IC50 tương ứng là 6,9 ± 2,2, 9,5 ± 3,1, 9,3 ± 2,1 µM. Các hợp chất TB1, TB2, TB5, TB7, TB8 và TB9 thể hiện hoạt tính yếu nhất với IC50 tương ứng là 14,5 ± 3,4, 11,4 ± 2,8, 10,3 ± 2,5, 11,5 ± 4,1, 16,7 ± 2,1, 10,1 ± 3,1 µM. Đây là lần đầu tiên các hợp chất phân lập từ loài T. baviensis được nghiên cứu hoạt tính ức chế enzym tyrosinase. Kết quả nghiên cứu về hoạt tính ức chế enzym tyrosinase của các hợp chất phân lập được từ loài T. anguina, cho thấy hợp chất TA7 có hoạt tính ức chế mạnh hơn cả chất đối chứng dương kojic acid (IC50 là 14,6 ± 3,3 µM) với IC50 là 8,5±3,3 µM. Các hợp chất từ TA1 đến TA6 thể hiện hoạt tính yếu hơn với giá trị IC50 trong khoảng 21,3 đến 46,7 µM. Hợp chất TA8 không thể hiện hoạt tính ở nồng độ nghiên cứu. Các hợp chất phân lập được từ loài T. baviensis đã thể hiện hoạt tính ức chế enzym tyrosinase mạnh sẽ gợi mở hướng nghiên cứu, cơ chế tác dụng hoạt tính ức chế enzym tyrosinase của loài T. baviensis. Vì thế cần thiết có các nghiên cứu in vivo nhằm nâng cao 5 CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1. Đối tượng nghiên cứu Thân lá T. baviensis được thu tại Ba Vì, Hà Nội, Việt Nam (mẫu tiêu bản NCCT-TB1109); thân lá T. anguina được thu tại Hòa Bình, Việt Nam (mẫu tiêu bản NCCT-TA1308); rễ củ T. kirilowii được thu tại Hòa Bình, Việt Nam (mẫu tiêu bản NCCT-TK1209). Tên khoa học của 3 mẫu được giám định bởi PGS. TS. Ninh Khắc Bản, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Cả 3 mẫu tiêu bản được lưu trữ tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất 2.2.1.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) 2.2.1.2. Sắc ký cột (CC) 2.2.1.3. Tinh chế các hợp chất 2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định trên cơ sở sử dụng các phép xác định thông số vật lý và các phương pháp đo phổ bằng các thiết bị hiện đại đồng thời kết hợp với phân tích và tra cứu tài liệu tham khảo. 2.2.2.1. Phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS) 2.2.2.2. Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR) 2.2.2.3. Phổ lưỡng sắc tròn (CD) 2.2.2.4. Độ quay cực ([α]) 2.2.3. Phương pháp xác định hoạt tính sinh học 2.2.3.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư 2.2.3.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzym tyrosinase 2.3. Phân lập các hợp chất 2.3.1. Các hợp chất phân lập từ loài T. baviensis 6 Hình 2.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài T. baviensis 2.3.2. Các hợp chất phân lập từ loài T. anguina Hình 1.3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài T. anguina 19 Hình 3.65. Cấu trúc hóa học 8 hợp chất được phân lập từ loài T. kirilowii 3.2. Hoạt tính của các hợp chất phân lập được 3.2.1. Hoạt tính ức chế enzym tyrosinase của các hợp chất phân lập được từ T. baviensis và T. anguina. Các vấn đề về sắc tố da thường gây nhiều áp lực về mặt thẩm mỹ, đặc biệt là đối với phụ nữ. Ức chế enzym tyrosinase có thể làm hạn chế việc sản sinh quá nhiều các sắc tố melanin từ đó giúp điều trị các rối loạn liên quan đến tăng sắc tố da. Việc nghiên cứu, điều chế các sản phẩm từ thiên nhiên có tác dụng ức chế enzym này có ý nghĩa lớn trong khoa học y dược và mỹ phẩm. Thành phần của những sản phẩm này thường chứa một số hợp chất chính như flavonoid, phenolic, polyphenolic, chalcol, stilbene và kojic acid [82]. Tuy nhiên một số hợp chất phenolic như hydroquinone và artbutin thường có mặt trong các sản phẩm làm trắng da hiện nay không an toàn và ít hiệu quả khi sử dụng [83]. 18 Hình 3.64. Cấu trúc hóa học 8 hợp chất được phân lập từ loài T. anguina 7 2.3.3. Các hợp chất phân lập từ loài T. kirilowii Hình2.4. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài T. kirilowii 2.4. Thông số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất đã phân lập được 2.5. Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất 2.5.1. Hoạt tính ức chế enzym tyrosinase của các hợp chất phân lập được từ T. baviensis và T. anguina. Bảng 2.1. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế enzym tyrosinase của TB1-TB10 Hợp chất IC50 (μM) TB1 14,5 ± 3,4 TB2 11,4 ± 2,8 TB3 6,9 ± 2,2 TB4 9,5 ± 3,1 TB5 10,3 ± 2,5 TB6 3,9 ± 1,5 TB7 11,5 ± 4,1 TB8 16,7 ± 2,1 TB9 10,1 ± 3,1 TB10 9,3 ± 2,1 Kojic acid 14,6 ± 3,3 8 Bảng 2.2. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế enzym tyrosinase của TA1-TA8 Hợp chất IC50 (μM) TA1 21,3 ± 2,8 TA2 36,8±2,6 TA3 33,9±3,1 TA4 42,2±3,6 TA5 46,7±2,0 TA6 22,7±1,4 TA7 8,5±3,3 TA8 >100 Kojic acid 14,6 ± 3,3 2.5.2. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được từ T. kirilowii Bảng 2.3. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của TK1-TK8 IC50 (µM) Hợp chất A-549 HT-29 OVCAR MCF-7 TK1 36,4 16,2 21,6 26,5 TK2 >100 45,5 >100 >100 TK3 52,4 60,9 >100 >100 TK4 >100 >100 >100 >100 TK5 2,7 16,0 14,5 32,7 TK6 21,1 40,7 32,1 15,8 TK7 11,3 4,1 6,5 17,3 TK8 17,0 49,4 14,7 42,8 Mitoxantrone 7,2 3,1 8,4 10,3 17 3. Danh sách các hợp chất phân lập từ các loài thuộc chi Trichosanthes Tổng số có 30 hợp chất đã được phân lập từ 3 loài T. baviensis, T. anguina và T. kirilowii, trong đó có: O O O H OH H OH OH HO OH HO TB 9 R=H TB10 R=OMe R TB1 1 3 5 810 11 14 1718 20 2324 25 26 27 28 2930 O AcO TB2 HO TB4 HO TB3OH OH HO TB5 HO TB6 OH OGlc H3CO HO OCH3 OH H3CO OCH3 OH OGlc H3CO HO OCH3 OH H3CO OCH3 TB7 TB8 Hình 3.63. Cấu trúc hóa học 14 hợp chất được phân lập từ loài T. baviensis 16 Tương tác HMBC giữa H-7 (δH 5,46) và C-1 (δC 134,2)/ C-2/C- 6 (δC 128,2)/ C-3' (δC 131,5)/ C-4' (δC 161,0); giữa H-2/H-6 (δH 7,16) và C-1 (δC 134,2)/ C-4 (δC 158,5)/ C-7 (δC 88,7) gợi ý vị trí của nhóm p-hydroxyphenyl tại C-7. Tương tác HMBC giữa H-7' (δH 6,54) và C- 1' (δC 129,5)/ C-2' (δC 123,7)/ C-6' (δC 128,7)/ C-8' (δC 127,0)/ C-9' (δC 63,9) gợi ý vị trí liên kết đôi tại C-7'/C-8' và nhóm hydroxy tại C- 9'. Cấu hình của liên kết đôi tại C-7'/C-8' được xác định là E dựa trên hằng số tương tác giữa H-7' và H-8', JH-7′-H-8′ = 16,0 Hz. Hằng số tương tác giữa H-7 và H-8 lớn (JH-7-H-8 = 6,0 Hz) đã xác định hai proton tại C-7 và C-8 ở vị trí trans. Để khẳng định chính xác cấu hình tuyệt đối của TK1 tại C-7 và C-8, phổ CD đã được đo và so sánh với phổ CD của hợp chất có cấu tương tự. Cụ thể, hiệu ứng Cotton âm tại bước sóng λ = 244 nm (Δε: -4,3) và hiệu ứng Cotton dương tại bước sóng λ = 222 nm (Δε: +2,6) trên phổ CD của hợp chất TK1 cho phép xác định tuyết đối cấu hình tại C-7 và C-8 là 7R và 8S bằng cách so sánh với phổ CD của hợp chất cupressoside B (hiệu ứng Cotton âm tại bước sóng λ = 238 nm và hiệu ứng Cotton dương tại bước sóng λ = 221 nm) [75]. Dựa vào các bằng chứng phổ nêu trên và so sánh với tài liệu tham khảo, cấu trúc mới của hợp chất TK1 được xác định và đặt tên là trichobenzolignan. Hình 3.49. Các tương tác HMBC chính của TK1 9 CHƯƠNG 3. THẢO LUẬN KẾT QUẢ 3.1. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được 3.1.1. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được từ loài T. baviensis 3.1.1.1. Hợp chất TB1: 9,26-epoxymultiflorenol (mới) Hình 3.1. Cấu trúc hóa học của TB1 và hợp chất tham khảo TB1a Hợp chất TB1 thu được ở dạng rắn không màu. Trên phổ HR-ESI-MS của TB1 xuất hiện pic ion giả phân tử tại m/z 463,3536 [M+Na]+ (tính toán lí thuyết cho công thức [C30H48O2Na]+, 463,3547) cho phép kết luận công thức phân tử của TB1 được xác định là C30H48O2. Phổ 1H-NMR của TB1 xuất hiện tín hiệu của một proton olefin tại δH 5,25 (1H, dd, J = 2,4, 4,8 Hz); một proton oxymethine tại δH 3,21 (1H, dd, J = 5,4, 9,0 Hz); hai proton oxymethylene tại δH 3,25 (1H, d, J = 7,8 Hz) và 4,52 (1H, d, J = 7,8 Hz); và bảy nhóm methyl tại δH 0,84 (3H, s), 0,90 (3H, s), 0,93 (3H, s), 0,94 (3H, s), 0,95 (6H, s) và 1,02 (3H, s). Phổ 13C-NMR của hợp chất TB1 xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 30 carbon, bao gồm: tám carbon không liên kết trực tiếp với hydro tại δC 28,8, 32,2, 38,4, 39,0, 40,3, 49,0, 85,8 và 143,7; bốn carbon methine tại δC 45,1, 45,5, 79,3 và 113,3; mười một carbon methylene tại δC 22,0, 23,5, 27,2, 30,3, 30,8, 33,3, 34,6, 36,1, 36,2, 36,3 và 78,1; và bảy carbon methyl tại δC 14,5, 15,4, 19,7, 28,3, 29,1, 31,7 và 33,5. Từ những phân tích dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR có thể dự đoán hợp chất TB1 là một triterpene khung multiflorane, tương tự hợp chất multiflorenol (TB1a) [56], ngoại trừ đóng vòng qua cầu oxy tại C- 9/C-26. Các tương tác HMBC từ H-23 (δH 1,02)/H-24 (δH 0,93) tới C-3 10 (δC 79,3)/ C-4 (δC 39,0)/ C-5 (δC 45,1) gợi ý vị trí của nhóm hydroxy tại C-3 và 2 nhóm methyl tại C-4. Cấu hình β của nhóm hydroxy tại C- 3 được xác định dựa trên hằng số tương tác, JH-2β/H-3 = 9,0 Hz, JH-2α/H-3 = 5,4 Hz và so sánh độ dịch chuyển hóa học trên phổ 13C-NMR của C- 3 (δC 79,3), C-4 (δC 39,0) của hợp chất TB1 với hợp chất 3β- hydroxyolean-12-en-28-oic acid [C-3 (δC 78,8), C-4 (δC 38,9)] và hợp chất 3α-hydroxyolean-12-en-28-oic acid [C-3 (δC 76,2), C-4 (δC 37,2) ] [57]. Tương tác HMBC giữa H-25 (δH 0,90) và C-1 (δC 30,8)/ C-5 (δC 45,1)/ C-9 (δC 85,8)/ C-10 (δC 38,4); giữa H-28 (δH 0,94) và C-16 (δC 34,6)/ C-18 (δC 45,5)/ C-22 (δC 36,2) gợi ý vị trí nhóm methyl tại C-10 và C-17. Tương tác HMBC giữa H-29 (δH 0,95) và C-21 (δC 33,3)/ C- 30 (δC 31,7); giữa H-30 và C-19 (δC 36,1)/ C-29 (δC 33,5) gợi ý 2 nhóm methyl tại C-20. Tương tác HMBC giữa H-26 (δH 3,25/ 4,52) và C-8 (δC 143,7)/ C-9 (δC 85,8)/ C-13 (δC 40,3)/ C-14 (δC 49,0)/ C-15 (δC 22,0) gợi ý vị trí của liên kết đôi tại C-7/C-8 và cầu oxy tại C-9/C-26. Trên phổ NOESY thấy xuất hiện tương tác Hβ-6 (δH 2,07) với H-24 (δH 0,93) và H-25 (δH 0,90), H-25 (δH 0,90) tương tác với Ha-26 (δH 3,25), Hb-26 (δH 4,52) tương tác với H-18 (δH 1,55) và H-28 (δH 0,94) xác định được cấu hình β tại vị trí H-24, Me-10, Me-14, H-18 và Me-28. Tương tác NOESY giữa H-23 (δH 1,02) với H-3 (δH 3,21) và H-5 (δH 1,47), Hα-15 (δH 1,87) với H-27 (δH 0,84) cho phép xác định cấu hình của H-3, Me(23)-4, H-5 và Me-13 là α. Dựa vào các dữ liệu phổ trên, cấu trúc của hợp chất TB1 được xác định. Đây là hợp chất mới và được xác định là 9,26-epoxymultiflorenol. Hình 3.2. Các tương tác HMBC, COSY và NOE chính của TB1 15 thơm thế para AA′BB′ tại δH 6,73 (2H, d, J = 8,0 Hz) và 7,16 (2H, d, J = 8,0 Hz); ba proton thơm hệ ABX tại δH 6,72 (1H, d, J = 8,0 Hz), 7,20 (1H, d, J = 8,0 Hz) và 7,34 (1H, s); hai proton olefin tại δH 6,20 (1H, dt, J = 6,0, 16,0 Hz) và 6,54 (1H, d, J = 16,0 Hz). Phổ 13C-NMR của hợp chất TK1 xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 18 carbon, bao gồm: năm carbon không liên kết trực tiếp với hydro tại δC 129,5, 131,5, 134,2, 158,5, và 161,0; mười một carbon methine tại δC 54,7, 88,7, 110,0, 116,3 (2C), 123,8, 127,0, 128,2 (2C), 128,7, 132,0; và hai carbon oxymethylene tại δC 63,9 và 65,1. Từ những phân tích số liệu phổ 1H và 13C-NMR của TK1 cho thấy cấu trúc của TK1 có khung là dihydrobenzofuran, giống với cupressoside B (TK1a) [75] ngoại trừ sự vắng mặt của nhóm propyl tại C-1' và 1 đơn vị đường tại C-4. Bảng 3.20. Số liệu phổ NMR của TK1 và phần cấu trúc tham khảo C δCa,# δCa,b δHa,c (mult., J = Hz) 1 128,6 134,2 - 2, 6 1